Versuchsprotokoll: Photosynthetische Sauerstoffproduktion

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Material und Methoden
2.1 Polarographische Messung der photosynthetischen O² -Produktion
2.2 Hill-Reaktion isolierter Chloroplasten

3 Ergebnisse
3.1 Polarographische Messung der photosynthetischen O² -Produktion
3.2 Hill-Reaktion isolierter Chloroplasten
3.2.1 Erster Versuchsteil
3.2.2 Zweiter Versuchsteil

4 Diskussion

1 Einleitung

Im Allgemeinen sind Lebewesen organisierte, aus organischen Stoffen bestehende Struk­turen, die aufgenommene Stoffe chemisch umwandeln können (Metabolismus), einen genetischen Bauplan besitzen (DNA) und diesen an eine Folgegeneration weiter verer­ben können (Reproduktion). Diese Vorgänge setzen jedoch voraus, dass der Organismus auf schnell verfügbare, chemische Energieträger zurückgreifen kann, welche leicht zu transportieren und zu speichern sind, gleichzeitig aber genug Energie für die oben genannten Vorgänge liefern. Einer der wichtigsten ist die Glucose. Ein aus Kohlenstoff, Sauerstoff und Wasserstoff bestehendes Molekül, das von einem Organismus leicht verwertet werden kann und zugleich ein guter Energielieferant^[2] ist. Dieses Molekül entsteht jedoch nicht spontan, sondern muss gebildet werden. Die Ausgangsstoffe für die Glucosebildung, Kohlenstoffdioxid und Wasser sind auf der Erde ubiquitär. Die Energie zur Synthese von Glucose liefert die Sonne, in Form von unter anderem sicht­barem Licht^[3]. Je nach Jahreszeit und Ort der Messung schwankt der Energieeintrag der Sonne zwar, liegt im Mittel für die gesamte Erdoberfläche jedoch bei ungefähr 1,37 kJ · s-1 · m-2. Viele Organismen sind auf diese Energiequelle direkt oder indirekt angewiesen. Dabei nutzen heterotrophe Organismen die Energie, welche zuvor von autotrophen Organismen verfügbar gemacht wurde. Fast alle autotrophen Organismen sind zur Photosynthese befähigt. Hierbei wird überwiegend und allgemein gesprochen Wasser oxidiert und Kohlenstoffdioxid reduziert. Bei genauerer Betrachtung der Vorgän­ge in den Chloroplasten, der Ort an dem die Photosynthese stattfindet, stellt man fest, dass die Synthese in zwei Phasen gegliedert ist.

Am Tag, während die Strahlungsenergie der Sonne verfügbar ist, wird mit Hilfe der vom Licht vermittelten Energie, Wassers vom Photosystem II oxidiert, wobei elementarer Sauerstoff und Wasserstoffionen frei werden. (Lichtphase) Das Sauerstoffgas entweicht und die Protonen werden im Thylakoidlumen aufkonzentriert. Dadurch wird ein Pro­tonengradient über der Thylakoidmembran aufgebaut. Dieser wird von den in der Membran befindlichen ATP-Synthasen genutzt um ADP mit einer freien Phosphatgrup­pe zu phosphorylieren. Die nach dem Abbau des Gradienten ins Stroma gelangenden Protonen werden, unter anderem, vom Photosystem I genutzt, um NADP zu reduzieren und so NADPH+H+ zu bilden. Die Energie für die Reduktion liefert das Licht.

Bei den ersten beiden Versuchen sollen diese Vorgänge und deren Eigenschaften genauer untersucht werden. Der dritte Versuch soll die Vorgänge während der Dunkelphase verdeutlichen. In dieser wird die, während der Lichtphase in chemische Energie um­gewandelte Strahlungsenergie genutzt um Kohlenstoffdioxid (CO² ) zu fixieren. Dabei werden ATP und NADPH+H+ verbraucht, welche in der Lichtphase gebildet wurden. Bei diesem Vorgang synthetisiert die Pflanze a-D-Glucose aus Wasser und (CO² ). Mittels Glykolyse kann die so gespeicherte Energie wieder in ATP und NADPH+H+ umge­wandelt werden. In einem weiteren Schritt wird die Glucose 1,4- und 1,6-glykosidisch verknüpft (Stärkebildung) und die so entstandene Stärke in Amyloplasten angereichert. Diese Art der Speicherung hat einen entscheidenden Vorteil gegenüber einer Speiche­rung von Energie in Form von ATP, NADPH+H+ oder Glucose. Im Gegensatz zu diesen Stoffen ist Stärke nicht Wasserlöslich, da es sich hierbei um ein unpolares Makromolekül handelt. Als Lösungsmittel liegt im Cytosol Wasser (polar) vor. Daher ist Stärke nicht im Cytosol löslich und somit auch nicht osmotisch wirksam. Somit wird die Osmolarität der Pflanzenzelle nicht beeinflusst und kann unter diesem Aspekt in beliebiger Menge gespeichert werden. Nur das begrenzte Volumen innerhalb der Zelle steht dem entgegen. Des weiteren wird die Stärke als Energiespeicher in Samen verwendet. Diese Samen bzw. Pflanzen sind wiederum Nahrung für Herbivoren oder Omnivoren. Die mit den Pflanzen aufgenommene Stärke ist dabei eine wichtige Energiequelle. Die aufgenomme­ne Stärke wird in andere Energieträger (z.B. ATP) überführt oder als Reservestoff (z.B. Glykogen) gespeichert.

2 Material und Methoden

Bei den ersten beiden Versuchen sollen Sauerstoffkonzentrationen mit einer Clarkschen Sauerstoffelektrode zum Einsatz. Bei dieser handelt es sich um eine elektrochemische Zelle mit einer Platinkathode an der eine Polarisationsspannung von -800 mV gegen eine Silber/Silberchlorid-Elektrode anliegt. Als Elektrolyt dient eine Kaliumchlorid­lösung. Die Zelle ist durch eine Teflonmembran von dem umgebenden Medium ab­geschirmt. Ist Sauerstoff in diesem vorhanden, kann es aufgrund des Partialdrucks in den Reaktionsraum der Zelle diffundieren. An der Kathode wird der Sauerstoff in zwei Schritten, über Wasserstoffperoxid, zu Wasser reduziert. Das Silber der Elektrode wird mit Chlor-Anionen oxidiert. Es findet eine Redoxreaktion statt, bei der die bei­den Halbreaktionen räumlich voneinander getrennt sind. Deshalb fließt ein Strom, der gemessen werden kann. Da der Strom nur in Gegenwart von Sauerstoff fließt, ist die Stromstärke proportional zur Sauerstoffkonzentration im Reaktionsraum. Des weite­ren wird die Stromstärke durch die Temperatur der Probe beeinflusst. Jedoch verfügt die Sauerstoffelektrode über einen integrierten Temperaturfühler. Die Temperatur der

Probe wird mitgemessen. Das Endgerät berücksichtigt die Temperatur und gibt direkt Werte in mg-ml-1 an. Zuvor muss sie jedoch auf mit Sauerstoff gesättigtem Wasser als Maximalwert und auf sauerstofffreies Wasser als Minimalwert geeicht werden.

2.1 Polarographische Messung der photosynthetischen O2 -Produktion

Beim ersten Versuch wird in fünf Messungen die Anreicherung einer Algensuspension (Chlamydomonas reinhardtii) mit Sauerstoff bei unterschiedlichen Belichtungsverhält­nissen beobachtet. Dazu werden für jede Messung 3 ml der Algensuspension in eine temperierte Messzelle pipettiert. Unter ständigem rühren mit einem Magnetfisch wer­den, nach einer Äquilibrierungszeit von zwei Minuten, alle 15 Sekunden, insgesamt 29 Werte genommen. Danach wird die Belichtung der Messzelle geändert. Die Intensität soll, zwecks Vergleichbarkeit der Werte, immer bei 40 J-s-1-m-2 liegen. Jeweils eine Messreihe wird bei Rotlicht, eine bei Grünlicht und eine bei Weißlicht durchgeführt. Zusätzlich wird noch eine Messreihe ohne Licht (0 J-s-1-m-2) und eine bei Raumlicht erstellt. Bei letzterer wird die Intensität des Lichts separat gemessen und notiert.

2.2 Hill-Reaktion isolierter Chloroplasten

Der zweite Versuch hat die Hill-Reaktion^[4] isolierter Thylakoidmembranen zum Ge­genstand. Damit Sauerstoff freigesetzt werden kann, muss ein Elektronenakzeptor vorhanden sein. In vivo übernimmt diese Funktion NADP. In vitro muss ein artifizieller Elektronenakzeptor wie Kaliumhexacyanidoferrat(III) (FeCN) verfügbar sein.

Zur Untersuchung des Einflusses von Elektronenakzeptoren auf die Photosyntheseakti­vität, müssen erst Chloroplasten in hinreichender Menge verfügbar sein. Die Chloro- plastengewinnung erfolgt am bei einer konstant niedrigen Temperatur, weshalb alle folgenden Schritte mit eisgekühlten Werkzeugen, Gefäßen und Lösungen durchgeführt werden. 25 g Spinatblätter werden nach Entfernung der chloroplastenarmen Mittelrippe in kleine Stücke zerschnitten und mit 35 ml Lösung I (400 mM Saccharose, 20 mM KCl, 500 mM KH2PO4, 50 mM Tris; pH 7,6) in einem Mörser zusammen mit Sand zerrieben. Die Mischung wird daraufhin grob mit Mull gefiltert. Das Filtrat wird für fünf Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Das Rückstand wird in 10 ml der Lösung I aufgenommen und erneut für fünf Minuten bei 3000 g zentrifugiert. Das Sediment wird in 10 ml einer Puf­ferlösung aus gleichen Teilen Lösung II (0,66 M Saccharose, 40 mM KCl, 3 mM KH2PO4, 4 mM MgCl2,100 mM HEPES; pH 8) und destilliertem Wasser pipettiert. Daraufhin wird der Chlorophyllgehalt in mg/ml errechnet. Dieser Wert lässt sich aus dem Extinktions­wert Eg52 der Suspension errechnen, da Chlorophyll a und b Licht dieser Wellenlänge im gleichen Maße absorbieren. Die Chloroplastensuspension wird in den beiden fol­genden Versuchsteilen verwendet. Im ersten wird der Einfluss von drei unterschiedlich hohen FeCN-Konzentrationen auf die Sauerstoffproduktion gemessen. Die Versuchspa­rameter entsprechen der Weißlichtmessung vom ersten Versuch (s. 1.1), jedoch wird statt der Algensuspension einer von drei vorbereiteten Ansätzen (s. Tabelle 1) in die Messzelle pipettiert, denen nach drei Minuten Äquilibrierungszeit eine FeCN-Lösung (20 mM Kaliumhexacyanidoferrat(III)) zugegeben wird.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Pipettierschema für die Ansätze 1 bis 3, die im ersten Teil des Hill-Versuches zur Anwendung kommen.

Die Chloroplastensuspension wird in den beiden folgenden Versuchsteilen verwendet. Im ersten wird der Einfluss von drei unterschiedlich hohen FeCN Konzentrationen auf die Sauerstoffproduktion gemessen. Die Versuchsparameter entsprechen der Weißlicht­messung vom ersten Versuch, jedoch wird statt der Algensuspension einer von drei Ansätzen (s. Tabelle 1) in die Messzelle pipettiert, denen nach drei Minuten Äquilibrie­rungszeit eine FeCN-Lösung (20 mM Kaliumhexacyanidoferrat(III)) zugegeben wird. Nach erfolgter Messung wird jeder Ansatz noch für weitere sechs bis acht Minuten verfolgt. Im zweiten Versuchsteil soll die Hill-Reaktion direkt gemessen werden und nicht über eine Messung der O² -Konzentration in der Probelösung. Dies ist mit DCPIP möglich, ein Farbstoff der Licht bei einer Wellenlänge von 600 nm absorbiert. Wird DCPIP jedoch zum Beispiel vom Photosystem II reduziert, führt dies zu einer Verändert der Absorbtionseigenschaften des Farbstoffes.

Des weiteren wird der Einfluss von DCMU auf die Photosynthese beobachtet. DCMU verhindert den Elektronentransport entlang der Thylakoidmembran, was den Aufbau ei­nes Protonengradienten verhindert und somit die Photosynthese stoppt.

[...]

^[1] Diskussion 11

^[2] 2980 kJ/Mol bei vollständiger Verbrennung

^[3] 380 nm bis 780 nm

^[4] Hill, R. (1939): Oxygen produced by isolated chloroplasts. Proc. R. Soc. London Ser. B. Bd. 127, S. 192210