Einsatz von Biotests in der Routine-Gewässerüberwachung des Saarlandes

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung

2. Einleitung

3. Material und Methoden
3.1 Nährmedien
3.1.1 Algen
3.1.1.1 Mineralnährmedium nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a), modifiziert
3.1.2 Daphnien
3.1.2.1 Künstliches Süßwasser nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a)
3.1.2.2 M4- Medium (Elendt 1990)
3.1.3 Leuchtbakterien
3.1.3.1 Salted-Sea-Water-Kulturmedium mit C-Quelle (SSWC, Nealson 1978)
3.1.3.2 Artificial-Sea-Water-Medium für Leuchtbakterien (ASW, Krebs 1992 a)
3.2 Probestellen
3.2.1 Charakterisierung der Probestellen
3.2.1.1 Saar-Altarm in Saarlouis
3.2.1.2 Heinitzbach bei Neunkirchen
3.2.1.3 Rossel bei Emmersweiler
3.2.1.4 Prims bei Dillingen
3.3 Probenahme, Probenvorbereitung und Elutionen
3.3.1 Probenahme und Probenvorbereitung nach DIN 38 414 Teil 11 (DEV 1987)
3.3.2 Elutionsverfahren
3.3.2.1 Bestimmung der Eluierbarkeit mit Wasser im Schüttelversuch ("Präzisierte DEV S 4-Methode") (Sievers 1996)
3.3.2.2 Elution mit 1 %iger DMSO- und 2 %iger NaCl-Lösung nach Scheibel et al. (1991)
3.3.2.3 Elution modifiziert nach Stoll (1997)
3.3.2.4 Elution nach Daniels et al. (1989)
3.4 Charakterisierung der Wasserproben
3.4.1 Abwässer
3.4.1.1 Temperatur
3.4.1.2 pH-Wert
3.4.1.3 Leitfähigkeit
3.4.1.4 O2-Gehalt
3.4.1.5 Weitergehende analytische Untersuchungen
3.4.2 Begleitende Analytik bei Oberflächenwässern und Sediment-Eluaten
3.5 Sedimentuntersuchungen
3.5.1 Korngrößenverteilung
3.5.2 Bestimmung des Wassergehaltes und des Trockenrückstandes nach DIN 38 414 Teil 2 (DEV 1985 a)
3.5.3 Bestimmung des Glührückstands und des Glühverlusts nach DIN 38 414 Teil 3 (DEV 1985 b)
3.6 Lagerung der Proben
3.6.1 Eluate und Oberflächenwasserproben
3.6.2 Direkteinleiterproben
3.6.3 Referenzproben
3.7 Biologische Testmethoden
3.7.1 Algentest modifiziert nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)
3.7.1.1 Testorganismus und Grundlage des Verfahrens
3.7.1.2 Anzucht und Stammhaltung
3.7.1.3 Inkubationsbedingungen
3.7.1.4 Probenvorbereitung
3.7.1.5 Herstellung der Vorkultur
3.7.1.6 Testdurchführung
3.7.1.7 Messung
3.7.1.8 Auswertung und Gültigkeitskriterium
3.7.1.9 Gültigkeitskriterium
3.7.2 Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a)
3.7.2.1 Testorganismus und Grundlage des Verfahrens
3.7.2.2 Anzucht und Stammhaltung
3.7.2.3 Probenvorbereitung
3.7.2.4 Gewinnung geeigneter Testtiere
3.7.2.5 Testdurchführung
3.7.2.6 Auswertung
3.7.2.7 Gültigkeitskriterien
3.7.3 Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b)
3.7.3.1 Testorganismus und Grundlage des Verfahrens
3.7.3.2 Probenvorbereitung
3.7.3.3 Testdurchführung
3.7.3.4 Messung und Auswertung
3.7.3.5 Gültigkeitskriterien
3.7.3.6 Farbkorrektur für stark gefärbte Proben nach LUMIStox Applikation 01 (Dr. Lange GmbH a)
3.7.4 Leuchtbakterientest LCK 486
3.7.4.1 Testorganismus und Grundlage des Verfahrens
3.7.4.2 Probenvorbereitung
3.7.4.3 Testdurchführung
3.7.4.4 Messung und Auswertung
3.7.4.5 Gültigkeitskriterien für den LCK 486-Test
3.7.5 Referenzproben zur Qualitätssicherung der Biotestergebnisse
3.8 Mikroskopie
3.8.1 Lichtmikroskopie
3.8.1.1 Optische Geräte
3.8.1.2 Längenmessung
3.8.1.3 Zellzahlbestimmung
3.8.2 Transmissionselektronenmikroskopie
3.8.2.1 Optische Geräte
3.8.2.2 Fixierung und Einbettung der Präparate
3.8.2.3 Herstellung der Ultradünnschnitte
3.8.2.4 Kontrastierung der Ultradünnschnitte

4. Ergebnisse
4.1 Validierung der Biotests
4.1.1 Algentest, modifiziert nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)
4.1.1.1 Überprüfung des Einflusses der Stellplätze auf die Biomasseproduktion
4.1.1.2 Einfluß der NaHCO3-Konzentration auf das Algenwachstum
4.1.1.3 Einfluß einer 1 %igen (v/v) DMSO-Lösung auf das Wachstum der Algen
4.1.2 Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a)
4.1.2.1 Bestimmung des EC50-Wertes von Kaliumdichromat
4.1.2.2 Bestimmung des Einflusses von DMSO auf die Schwimmfähigkeit der Daphnien
4.1.3 Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b)
4.1.3.1 Bestimmung der EC20- und EC50-Werte von Ammoniumacetat, Dimethylsulfoxid und Phenol
4.1.3.2 Untersuchung des Einflusses von DMSO auf die Wirkung von Phenol auf die Leuchtbakterien
4.1.4 Leuchtbakterientest LCK 486
4.1.4.1 Bestimmung der Hemmwirkung von Phenol auf Leuchten und Wachstum der Leuchtbakterien
4.1.4.2 Bestimmung der Hemmwirkung von Ammoniumacetat auf Leuchten und Wachstum der Leuchtbakterien
4.1.4.3 Untersuchung des Einflusses von DMSO auf Leuchten und Wachstum der Leuchtbakterien
4.1.4.4 Überprüfung des Einflusses der Probenfiltration auf die Ergebnisse im chronischen Leuchtbakterientest
4.2 Abwasseruntersuchungen mit Biotests
4.2.1 Ablauf Rauchgaswäsche Kraftwerk
4.2.2 Ablauf Deponiesickerwasser-Kläranlage
4.2.3 Ablauf Kommunale Kläranlage
4.2.4 Kokereiabwässer
4.2.4.1 Probe 130/97
4.2.4.2 Probe 584 /97
4.2.4.3 Probe 781/97
4.3 Oberflächenwasseruntersuchung mit Biotests
4.3.1 Rossel, Heinitzbach und Altarm Saarlouis
4.3.2 Prims bei Dillingen
4.4 Untersuchung der Sedimentproben
4.4.1 Chemisch-physikalische Untersuchungen
4.4.1.1 Bestimmung der Korngrößen und deren Verteilung
4.4.1.2 Bestimmung des Wassergehaltes und des Trockenrückstandes nach DIN 38 414 Teil 2 (DEV 1985 a)
4.4.1.3 Bestimmung des Glührückstands und des Glühverlusts nach DIN 38 414 Teil 3 (DEV 1985 b)
4.4.1.4 Experimente zur Auswahl einer geeigneten Elutionsmethode für Sedimentuntersuchungen mittels Biotests
4.4.1.5 Bestimmung der Konzentrationen von Metallen, Nährstoffen und Polychlorierten Biphenylen
4.4.1.6 Bestimmung der Pestizid-Gehalte
4.4.1.7 Bestimmung Gehalte an Chlorierten Kohlenwasserstoffen
4.4.2 Untersuchung der Sedimenteluate mit Biotests
4.4.2.1 Saar-Altarm in Saarlouis
4.4.2.2 Heinitzbach bei Neunkirchen
4.4.2.3 Rossel bei Emmersweiler
4.4.3 Untersuchungen zur Anwendbarkeit des LCK 486-Tests für die Untersuchung von Gewässer- und Sedimentproben
4.4.3.1 Einfluß autochthoner Bakterien auf das Wachstum in den Testansätzen
4.4.3.2 Einfluß von Nährstoffen und organischer Belastung auf das Leuchten und Wachstum
4.4.3.3 Einfluß von Alkali- und Erdalkaliionen auf Leuchten und das Wachstum der Leuchtbakterien

5. Diskussion
5.1 Überprüfung der Biotests auf deren Gültigkeit und Untersuchung des Einflusses der Probenvorbereitung auf die Biotestergebnisse
5.1.1 Algentest modifiziert nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)
5.1.2 Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a)
5.1.3 Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b)
5.1.4 Leuchtbakterientest LCK 486
5.2 Abwasseruntersuchungen mit Biotests
5.2.1 Ablauf Rauchgaswäsche Kraftwerk
5.2.2 Ablauf Kläranlage Hausmülldeponie
5.2.3 Kommunale Kläranlage
5.2.4 Kokereiabwässer
5.2.4.1 Probe 130/97
5.2.4.2 Probe 584/97
5.2.4.3 Probe 781/97
5.3 Untersuchung saarländischer Fließgewässer
5.3.1 Chemisch-physikalische Sediment-Untersuchungen
5.3.1.1 Bestimmung der Korngrößen und deren Verteilung
5.3.1.2 Bestimmung von Wassergehalt und Glührückstand
5.3.1.3 Metall-, Nährstoff-, PCB- und CKW-Gehalte
5.3.2 Untersuchung von Oberflächenwässern und Sediment-Eluaten mit Biotests
5.3.2.1 Experimente zur Auswahl einer geeigneten Elutionsmethode für biologische und chemische Sedimentuntersuchungen
5.3.2.2 Untersuchung der Sedimente und Oberflächenwässer des Saar-Altarms in Saarlouis, der Rossel bei Emmersweiler und des Heinitzbachs bei Neunkirchen
5.3.2.3 Oberflächenwasser Prims und Kokereiabwasserproben 584/97 und 781/97
5.3.3 Untersuchungen zur Anwendbarkeit des LCK 486-Tests für die Untersuchung von Gewässer- und Sedimentproben
5.3.3.1 Einfluß von Nährstoffen und organischer Belastung auf das Leuchten und Wachstum der Leuchtbakterien
5.3.3.2 Einfluß autochthoner Bakterien auf Leuchten und Wachstum der Leuchtbakterien
5.3.3.3 Einfluß von Alkali- und Erdalkaliionen auf Leuchten und Wachstum der Leuchtbakterien
5.3.3.4 Einfluß niedriger O2-Gehalte auf das Leuchten
5.3.3.5 Gegenseitige Beeinflussung von Nährstoffangebot, Wachstum und Leuchten bei Leuchtbakterien
5.3.4 Zusammenfassende Bewertung des LCK 486-Tests
5.3.5 Eignung von DMSO als Elutionsmittel zur Untersuchung von Sediment-Eluaten

6. Literaturverzeichnis

D anksagung

Ich danke Herrn Prof. Dr. H. Kaltwasser für die Vergabe des sehr interessanten und praxis­relevanten Themas sowie für seine Diskussionsbereitschaft und Unterstützung bei der Anferti­gung dieser Arbeit.

Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn Priv.-Doz. Dr. H-D. Janke, der freundlicherweise die Zweitkorrektur der Arbeit übernahm.

Den MitarbeiterInnen des Lehrstuhls für Allgemeine Mikrobiologie danke ich für die freundliche Aufnahme und die gute Zusammenarbeit. Besonderer Dank gilt Herrn Diplom-Biologen Christof Siersdorfer und Frau Diplom-Biologin Simone Peter für ihre Diskussionsbereitschaft, Hilfsbereitschaft und konstruktive Kritik bei der Anfertigung dieser Arbeit.

Ich bedanke mich bei allen MitarbeiterInnen des Staatlichen Instituts für Gesundheit und Umwelt in Saarbrücken, die mich bei meiner Arbeit unterstützten.

Ein ganz besonderer Dank geht an Herrn Diplom-Biologen Adam Schmitt für seine stete Diskussionsbereitschaft, seine wertvollen Tips bei der Ausarbeitung und seine Mitarbeit bei der Veröffentlichung der Ergebnisse dieser Arbeit.

Herrn Diplom-Biologen Christoph Klein danke ich für seine tatkräftige Hilfe bei der Anfertigung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen.

Der Firma Dr. Lange GmbH danke ich für die Bereitstellung der Materialien für den LCK 486- Leuchtbakterientest.

Mein Dank gilt außerdem all denen, die mich bei der Anfertigung dieser Arbeit durch konstruk­tive Kritik unterstützt haben.

Ein ganz besonderer Dank gebührt meiner Freundin Ana João Trindade für ihre Geduld und hilfreiche Unterstützung in der Endphase der Ausarbeitung.

Nicht zuletzt danke ich meinen Eltern, ohne die mein Studium nicht möglich gewesen wäre.

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1 Reaktionsschema der bakteriellen Lumineszenz (aus: Krebs 1992 b)

Abbildung 2 Saar-Altarm in Saarlouis; Blick von St. Nazairer Allee in Richtung City

Abbildung 3 Saar-Altarm in Saarlouis; Blick von St. Nazairer Allee in Richtung City

Abbildung 4 Heinitzbach bei Neunkirchen; Blick in Fließrichtung nach Neunkirchen

Abbildung 5 Heinitzbach bei Neunkirchen unmittelbar nach Probenahme mit Sedimentschöpfer

Abbildung 6 Rossel bei Emmersweiler; Blick entgegen der Fließrichtung nach Frankreich

Abbildung 7 Rossel bei Emmersweiler; Blick in Fließrichtung

Abbildung 8 Prims bei Dillingen, unmittelbar vor der Mündung in die Saar; Blick entgegen der Strömung in Richtung Dillingen

Abbildung 9 Prims bei Dillingen; Blick auf die Mündung in die Saar

Abbildung 10 Schöpfer zur Probenahme von Sediment

Abbildung 11 Überkopfschüttler zur Elution der Sedimentproben

Abbildung 12 Algentestapparatur mit angehobener Schüttlerplatte

Abbildung 13 Überprüfung der Stellplätze im Algentest auf ihre Validität

Abbildung 14 Einfluß einer 1 %igen DMSO-Lösung auf die Vermehrung im Algentest innerhalb einer 72-stündigen Inkubationszeit

Abbildung 15 Einfluß von Kaliumdichromat auf die Schwimmfähigkeit der Daphnien nach einer 24-stündigen Kontaktzeit

Abbildung 16 Einfluß von DMSO auf die Schwimmfähigkeit von Daphnien

Abbildung 17 Einfluß von DMSO auf die Leuchtbakterien im DIN-Test nach 30 min Kontaktzeit

Abbildung 18 Einfluß einer 1 %igen (v/v) DMSO-Lösung auf die akute Wirkung von Phenol im DIN- Leuchtbakterientest (DEV 1991 b)

Abbildung 19 Hemmwirkung von Phenol auf das Leuchten der Bakterien im DIN-Leucht-bakterientest und im Langzeit-Leuchtbakterientest LCK 486 nach 30 min und 24 h Kontaktzeit

Abbildung 20 Abhängigkeit der Wachstums- und Leuchthemmung der Leuchtbakterien von der Phenol-Konzentration beim LCK 486-Test nach 24 h Kontaktzeit

Abbildung 21 Hemmwirkung von Ammoniumacetat auf das Leuchten im DIN-Leuchtbakterientest und im chronischen Leuchtbakterientest nach 30 min und 24 h Kontaktzeit

Abbildung 22 Abhängigkeit von Wachstums- und Leuchthemmung der Leuchtbakterien von der Ammoniumacetat-Konzentration im LCK 486-Test

Abbildung 23 Einfluß einer 1 %igen DMSO-Lösung auf Leuchten und Wachstum der Leuchtbakterien im LCK 486-Test

Abbildung 24 Untersuchung des Ablaufs eines saarländischen Kraftwerks mit dem DIN- und dem LCK 486-Leuchtbakterientest

Abbildung 25 Einfluß von Deponiesickerwasser auf Leuchten und Wachstum der Leucht-bakterien im LCK 486-Leuchtbakterientest nach 30 min und 24 h

Abbildung 26 Einfluß von mechanisch gereinigtem Abwasser auf die Lumineszenz von Vibrio fischeri nach 30 min und 24 h

Abbildung 27 Einfluß von Kokereiabwasser auf das Leuchten von Vibrio fischeri nach 30 min und 24 h Kontaktzeit

Abbildung 28 Untersuchung der Abwasserprobe 584/97 einer saarländischen Kokerei mit verschiedenen Varianten des Leuchtbakterientests

Abbildung 29 Untersuchung der Abwasserprobe 781/97 einer saarländischen Kokerei mit Leuchtbakterientests

Abbildung 30 Untersuchung der Oberflächenwasser-Proben mit dem Algentest

Abbildung 31 Vergleichende Untersuchung von 2 Kokereiabwasserproben und dem zugehörigen Vorfluter nach etwa 1000 m Fließstrecke mit dem Algentest

Abbildung 32 Korngrößenverteilung der Sedimente von Heinitzbach, Rossel und Saar-Altarm

Abbildung 33 Vergleich verschiedener Elutionsmethoden am Sediment des Saar-Altarmes in Saarlouis anhand der mit der Verdünnungsstufe G 2 erzielten Hemmung im DIN-Leuchtbakterientest

Abbildung 34 Einfluß verschiedener Eluate des Saar-Altarms auf das Wachstum der Algen

Abbildung 35 Einfluß der Sediment-Eluate des Saar Altarmes auf das Leuchten der Leucht_bakterien im DIN-Leuchtbakterientest und im LCK 486-Test nach 30 min Kontaktzeit

Abbildung 36 Einfluß der Sediment-Eluate des Saar Altarmes auf das Leuchten der Leucht-bakterien nach 24 h Kontaktzeit

Abbildung 37 Einfluß verschiedener Verdünnungen von Oberflächenwasser und Eluaten des Saar-Altarms in Saarlouis auf die Vermehrung der Bakterien im LCK 486-Test innerhalb von 24 h

Abbildung 38 Einfluß verschiedener Eluate des Heinitzbachs auf das Algenwachstum

Abbildung 39 Einfluß der Sediment-Eluate des Heinitzbachs auf das Leuchten der Leuchtbakterien nach 24 h Kontaktzeit

Abbildung 40 Verlauf der relativen Bakterienvermehrung innerhalb von 24 h gegenüber der NaCl-Kontrolle zum Zeitpunkt t=0 bei verschiedenen Verdünnungen von Oberflächenwasser und Eluaten des Heinitzbachs

Abbildung 41 Einfluß von Sediment-Eluaten der Rossel bei Emmersweiler auf das Algenwachstum in Algentest

Abbildung 42 Akute Wirkung der Sediment-Eluate der Rossel auf das Leuchten der Leuchtbakterien im DIN-Leuchtbakterientest und im LCK 486-Test nach 30 min Kontaktzeit

Abbildung 43 Chronische Wirkung der Sediment-Eluate der Rossel auf das Leuchten der Leuchtbakterien nach 24 h Kontaktzeit

Abbildung 44 Verlauf der relativen Bakterienvermehrung innerhalb von 24 h gegenüber der NaCl-Kontrolle zum Zeitpunkt t=0 bei verschiedenen Verdünnungen von Oberflächenwasser und Eluaten der Rossel

Abbildung 45 Einfluß autochthoner Bakterien aus Sedimenten und Oberflächenwässern auf die optische Dichte im Testansatz

Abbildung 46 Vergleich von Leuchtbakterien mit den isolierten Bakterien

Abbildung 47 Leuchtbakterien-Reinkultur.TEM-Aufnahme, Vergrößerung 16000-fach, Belichtungs­zeit 1 s

Abbildung 48 Schleimumhüllte Kokken aus dem Eluat des Saar-Alt­armes in Saar­louis. TEM-Auf­nahme, Vergrößerung 4500-fach, Belich­tungs­zeit 2 s. .

Abbildung 49 Stäbchenbakterien aus dem Eluat des Saar-Alt­armes in Saarlouis. TEM-Aufnahme, Vergrößerung 6500-fach, Belichtungs­zeit 1 s

Abbildung 50 Untersuchung des Einflusses hoher organischer Belastung im LCK 486-Test mit SSWC-Kulturmedium (farbkorrigierte Werte)

Abbildung 51 Einfluß des ASW-Mediums auf das Leuchten und das Wachstum der Leuchtbakterien im 24 h-Leuchtbakterientest (Mittelwert aus 3 Versuchen)

Abbildung 52 Zeitlicher Verlauf von Wachstum und Leuchten bei Leuchtbakterien (aus : Meighen 1991)

Abbildung 53 Zeitlicher Verlauf von Wachstum und Leuchten bei Leuchtbakterien (aus : Rase 1969)

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1 Lebensformen und Lebensräume von Leuchtbakterien (aus Hastings 1986)

Tabelle 2 Übersicht über die Sediment-Probestellen im Saarland

Tabelle 3 Übersicht über die Untersuchungsparameter und verwendeten Bestimmungsmethoden bei Oberflächenwässern und Sediment-Eluaten

Tabelle 4 Pipettierschema für den Algentest, modifiziert nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)

Tabelle 5 Pipettierschema für den Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)

Tabelle 6 Zusammensetzung der Testansätze für den Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b)

Tabelle 7 Optimierung des Bicarbonatgehaltes im Algentest nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)

Tabelle 8 Vergleich der ermittelten EC50-Werte mit Literaturwerten im Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a)

Tabelle 9 Vergleich der im Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b) ermittelten EC20- und EC50-Werte mit Literaturwerten

Tabelle 10 Vergleich der für die Leuchthemmung auf Vibrio fischeri ermittelten EC20- und EC50-Werte von Ammoniumacetat und Phenol mit Literaturdaten

Tabelle 11 Chemisch-physikalische Daten der Filtrate nach der Druckfiltration

Tabelle 12 Einfluß der Probenvorbereitung auf Leuchten und Vermehrung der Leuchtbakterien im LCK 486-Test nach 30 min und 24 h Kontaktzeit

Tabelle 13 Ergebnisse der Abwasseruntersuchungen mit Leuchtbakterien-, Daphnien-, Algen- und Fischtests

Tabelle 14 Korngrößeneinteilung der Sedimente und Sedimentgesteine nach DIN 4022 (Tucker 1985)

Tabelle 15 Korngrößenbestimmung der Sedimente von Saar-Altarm, Rossel und Heinitzbach

Tabelle 16 Bestimmung des Wassergehaltes und des Trockenrückstandes der Sedimente von Saar-Altarm, Rossel und Heinitzbach

Tabelle 17 Bestimmung des Glührückstandes und des Glühverlustes der Sedimente von Saar Altarm, Rossel und Heinitzbach

Tabelle 18 Vergleich der Untersuchungswerte der Sedimente mit Zuordnungswerten ausgewählter Parameter aus der TA Siedlungsabfall (aus: Hein und Schwedt 1996)

Tabelle 19 Vergleich der Untersuchungswerte der Sedimente mit Grenzwerten ausgewählter Parameter aus der Klärschlammverordnung) (aus: Hein und Schwedt 1996)

Tabelle 20 Vergleich der Ergebnisse der Sedimentuntersuchungen mit nutzungs- und schutzbezogenen Grenzwerten für (Schad-)Stoffe in Böden (aus: Hösel et al. 1996) mit den Untersuchungsergebnissen der Sediment-Eluate

Tabelle 21 Vergleich Pestizid-Gehalte der Sediment-Eluate mit B- und C-Werten der „Holländischen Liste“ (aus: Hein und Schwedt 1996)

Tabelle 22 Vergleich der CKW-Gehalte der Sedimente von Saar-Altarm, Rossel und Heinitzbach mit Grenzwerten der „Holländischen Liste“ (aus: Hein und Schwedt 1996)

Tabelle 23 Bewertungsschema für den chronischen Leuchtbakterientest (nach Grabert, mündliche Mitteilung)

1. Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden Oberflächenwasser- und Abwasserproben aus der Routine-Gewässerüberwachung des Saarlandes sowie Sedimentproben mit Biotests untersucht. Ziel war es, anhand ausgewählter Proben herauszufinden, welches Testsystem jeweils am empfindlichsten reagiert und ob gegebenenfalls durch ein Sedimentscreening mit Biotests zusätzliche Infor­mationen über die Schadstoffbelastung saarländischer Fließgewässer zu erhalten sind.

Als Testsysteme dienten der Algentest nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a), der Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a), der Kurzzeit-Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991b) und der Langzeit-Leuchtbakterientest LCK 486 (Dr. Lange GmbH, Düssel­dorf). Die Ergebnisse von Abwasseruntersuchungen mit dem Fischtest nach DIN 38 412 Teil 31 (DEV 1989 b) wurden vom SIGU Saarbrücken bezogen.

Keine der Oberflächenwasserproben übte einen hemmenden Einfluß auf die Testorganismen aus. Die Untersuchungen mit dem Algentest deuteten auf eine starke Nährstoffbelastung hin, da teilweise massive Wachstumsförderungen auftraten. Bei der Abwasseruntersuchung war der Leuchtbakterientest mit einer Ausnahme das empfindlichste Testsystem. Bei den meisten Ab­wasserproben zeigten mehrere Testsysteme deutliche Hemmwirkungen an.

Der neue Langzeit-Leuchtbakterientest erbrachte bei Referenzchemikalien und Abwasser­proben nach 30 Minuten meist gut mit dem DIN-Test übereinstimmende Ergebnisse. Im 24 Stunden-Versuch trat eine deutliche Steigerung der Empfindlichkeit im Vergleich zum Kurzzeittest auf. Besonders empfindlich reagierte der Langzeit-Test bei der Untersuchung von Deponiesicker­wasser und dem Ab­lauf einer kommunalen Kläranlage.

An 13 ausgewählten Probestellen saarländischer Fließgewässer wurden Sedimente entnommen. Diese Proben wurden sowohl mit Wasser nach der DEV S 4-Methode (Sievers 1996) als auch unter Zugabe des organischen Lösemittels Dimethylsulfoxid (1 % v/v, Scheibel et al. 1991) eluiert. Die Untersuchung der Eluate erfolgte mit dem Daphnientest, dem Algentest und den beiden Leuchtbakterientests. Mittels chemischer Analytik wurden sie im Bezug auf ausgewählte Schadstoffgruppen untersucht. Die beiden Elutionsmethoden zeigten keine Unterschiede bei der Anreicherung von Schadstoffen aus der Gruppe der polychlorierten Biphenyle, chlorierten Kohlenwasserstoffe oder Pestizide in den Eluaten. Die Biotestorganismen wurden durch die Eluate nur geringfügig beeinträchtigt. Die Gewässersedimente waren allerdings teilweise stark or­ganisch belastet. Da weder die Untersuchungen mit Biotests noch die Ergebnisse der chemischen Analysen ein Gefährdungspotential aufzeigten, konnten die Sedimente als unbedenklich einge­stuft werden.

Das wegen seiner geringen akuten Toxizität gegenüber Leuchtbakterien häufig eingesetzte Elu­tionsmittel Dimethylsulfoxid wurde durch die autochthonen Bakterienstämme der Sediment-Eluate metabolisiert. Die daraus entstandenen Produkte Dimethylsulfid und Dimethyldisulfid wirkten deutlich toxischer auf die Leuchtbakterien als das Ausgangsprodukt. DMSO war daher für die Untersuchung von Umweltproben mit Leuchtbakterientests nicht geeignet. Ein Einfluß auf die Ergebnisse im Algen- oder Daphnientest konnte hingegen nicht festgestellt werden.

Im Langzeit-Leuchtbakterientest LCK 486 ergaben sich bei der Untersuchung von Sediment-Eluaten erhebliche Schwierigkeiten. Die gleichzeitige Inter­pretation beider Testsignale (Leuchten und Wachstum/Trübung) führte zu widersprüchlichen Aussagen. So traten in manchen Ver­suchen Leuchthemmung und Wachstumsförderung oder Wachstums­hemmung und Leuchtför­derung gleichzeitig auf.

In Detailuntersuchungen zum Langzeit-Leuchtbakterientest konnten verschiedene Ursachen für diese widersprüchlichen Teilergebnisse aufgezeigt werden:

- Hemmung der Lumineszenz durch hohe Nährstoffkonzentration im Testansatz
- Inaktivierung des Autoinduktors durch 2-wertige Kationen
- Einfluß autochthoner Bakterienstämme auf das Wachstum der Leuchtbakterien und die op­tische Dichte
- Hemmung des Leuchtens durch Sauerstoffverknappung innerhalb der Inkubationszeit
- Fehlbestimmung des Leuchtens durch Sedimentation der Leuchtbakterien im Verlauf der In­kubationszeit Die Untersuchungen zeigen, daß dieser neue Test für ein Routinescreening von Sedimenten der­zeit noch nicht geeignet ist.

Bei der Untersuchung von Direkteinleiterproben wurde die unterschiedliche Sensitivi­tät der Testorganismen gegenüber verschiedenen Schadstoffgemischen besonders deutlich. Es zeigte sich weiterhin, daß eine zweckmäßige Riskoabschätzung nur durch die Kombination einer mög­lichst umfangreichen Biotestbatterie mit der chemischen Analytik möglich war.

2. Einleitung

Biotests werden herangezogen, um die Wirkung biologisch schädlicher Stoffe oder Stoffge­mi­sche unter standardisierten Bedingungen auf Testorganismen zu prüfen. Sie integrieren die Effekte aller wirksamen Schadstoffe, auch derjenigen, die bei der chemischen Analytik nicht be­rück­sich­tigt oder erfaßt werden (DECHEMA 1995).

Eine mögliche toxische Wirkung manifestiert sich in der Regel selektiv auf eine Gruppe von Or­ganismen, da diese spezielle Strukturen, Leistungen oder Organe besitzen, die durch einen Schad­stoff beeinträchtigt werden können (Gunkel 1994). Es gibt vier Organismengruppen unter­schiedli­cher Entwicklungsstufen, welche als Standard-Testorganismen in Biotests dienen. Bakterien befinden sich als Destruenten im Zentrum des C-Kreislaufes, Grünalgen führen als Primärproduzenten die Photosynthese durch. Daphnien stehen in aquati­schen Nahrungsketten als Konsumenten niederer Ordnung zwischen den Destruenten und Primärproduzenten einer­seits und den Konsumenten höherer Ordnung andererseits (DEV 1982). Fische sind als Wirbel­tiere hochgradig differenziert und besit­zen Organe.

Physikochemische Untersuchungen können die Toxizität von Umweltproben nicht ausreichend einschätzen, da Interaktionen zwischen den Probeninhaltsstoffen und der komplexen Matrix auftreten können (Ruiz et al. 1997). Biotests stellen somit eine Ergänzung der chemischen Ana­lytik dar. Nach § 7a des Wasser­haushaltsgesetzes (WWW 1998 a) werden Direkteinleiterproben mit Hilfe von Biotests auf Schadwirkungen geprüft. Diese Untersuchungen werden von staatli­chen Behör­den durchge­führt. Routinemäßig wird die akute Toxizität von Direkteinleiterproben und Oberflächenwässern durch Biotests mit Leuchtbakterien, Daphnien und Fischen bestimmt. Die Erfassung der akuten Toxizität stellt die erste Stufe der Biotestuntersuchungen von Ab­wässern, Stoffgemischen und Chemikalien dar. Untersuchungen zur chronischen Toxizi­tät und zum Verhalten unter ökosystemalen Verhältnissen werden dann notwendig, wenn sich Hinweise auf akut toxische Wirkungen ergeben (Gunkel 1994).

Im Laufe der letzten Jahre hat sich die Qualität der Oberflächenwässer und Abwässer aufgrund wei­tergehender Abwasserreinigung ständig verbessert. In der Routineprüfung werden jedoch immer noch Biotest mit Daphnien, Leuchtbakterien und Fischen angewandt, wobei immer we­niger Proben mit diesen Tests als toxisch eingestuft werden können (Datenbank SIGU Saar­brücken). Dies stellt einerseits eine positive Entwicklung dar, es ergibt sich jedoch andererseits auch die Notwendigkeit der Verbesse­rung bestehender Testsysteme im Hinblick auf eine Steige­rung der Empfindlichkeit und der Ent­wicklung neuer Biotests. Im Jahre 1995 wurde im Staat­lichen Institut für Gesundheit und Um­welt in Saar­brücken ein neu entwickelter Test auf Muta­genität mit speziellen Mutanten von Leuchtbakterien, sogenannten Black-Mutanten, erprobt (Ziehl 1995). Hierbei wurde über deren Rückmutation zu leuch­tenden Bakterien eine Gentoxi­zität manifestiert. Dieser von der Firma Azur Environmental^[1] (Carlsbad, CA) unter dem Namen MutatoxÓ vertriebene Biotest vereint offensichtliche Vorteile wie guter Korrelation mit dem Ames-Test, geringer Mate­rialaufwand und Messung eines de­finierten Parameters in sich. Es stellte sich jedoch heraus, daß der Test für die routinemäßige Anwendung nicht geeignet war. Die Testanleitung war schlecht verständlich und die Vorbe­reitung des Tests war sehr zeitintensiv.

Neue Biotests müs­sen intensiv mit Realproben geprüft werden, um zu standardisierten, re­pro­duzierbaren und aussagekräftigen Ergebnissen zu gelangen. Unzulänglichkeiten und Störeinflüsse auf das Testsystem lassen sich mit Chemikalientests kaum erkennen, zumal meist nur mit Ein-Komponenten-Systemen gearbeitet wird. Bisher liegen Untersuchungen zu Kombinations­wirkungen von Chemikalien auf das Biotestorganismen nur vereinzelt vor. Nagler et al. (1997) untersuchten Kombinationswirkungen von Metallen und Pestiziden auf das Wachstum von Pseu­domonas fluorescens und Bacillus subtilis.

Die Untersuchungen von Strüder et al. (1997) zur Kombinationswirkung von Pestiziden auf Daphnien zeigen, daß die Vorhersage des Effekts verschiedenartig wirkender Stoffe mit Un­sicherheiten behaftet ist und nicht immer korrekt durch mathematische Modelle beschrieben werden kann.

Bereits seit 1978 werden Leuchtbakterien zur routinemäßigen Überwachung von Abwässern oder Abwasserinhaltsstoffen auf wassergefährdende Eigenschaften verwendet (Krebs 1992 b). Seit März 1992 ist der Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b) zur Ermitt­lung des Technikniveaus bei der Abwasserreinigung und zur routinemäßigen Überwa­chung von Abwassereinleitungen in der Rahmen-Abwasser-Verwaltungsvorschrift verankert (Krebs 1992 b). Die ISO/CEN-Normung steht kurz vor dem Abschluß, und die neue euro­päische Norm wird die gegenwärtig noch gültige DEV-Richtline ablösen (schriftliche Mitteilung Steinhäuser).

Die Bezeichnung Leuchtbakterien steht für eine Gruppe verschiedener Bakteriengattungen, die in der Lage sind, unter bestimmten Umständen einen Teil der durch Stoffwechselreaktionen ge­wonnenen Energie in Form von Licht zu emittieren (Link 1992). Das Testkriterium beim Leuchtbakterientest ist die Abnahme der bakteriellen Lumineszenz innerhalb von 30 min Kon­taktzeit mit einer Probe. Leuchtbakterien sind gram-ne­gative, fakultative Anaerobier. Sie sind chemoorganotroph und polar begeißelt. Die meisten Arten sind halophil. Auch der im Test ver­wendete Organismus stammt aus einem marinen Habitat, weshalb die Proben auf einen be­stimmten osmotischen Wert eingestellt werden müssen.

Schulz (1987) erörtert die zahlreichen Änderungen bei der taxonomischen Einteilung der Leuchtbakterien. Die Gattungen Vibrio und Photobacterium sind phäno- und genotypisch so eng benachbart, daß es immer wieder zu unterschiedlichen Klassifikationen gekommen ist (Froehner 1997). Die Recherche bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zell­kulturen (WWW 1998 b) ergab keine eindeutige Auskunft; dort werden für den im Leucht­bakterientest verwendeten Stamm NRRL B-11177 sowohl die Bezeichnung Vibrio fischeri als auch Photobacterium phosphoreum angegeben. Das hier verwendete Bakterium wurde von der Fa. Dr. Bruno Lange GmbH (Düsseldorf) bezogen und trägt die Bezeichnung Vibrio fischeri Stamm NRRL-B 11177.

Die Vorteile des Leuchtbakterientests liegen in der geringen benötigten Probenmenge von etwa 10 ml und der kurzen Testzeit; innerhalb von weniger als einer Stunde steht das Ergebnis fest. Der Leuchtbak­terientest besitzt eine hohe Empfindlichkeit und ist schnell verfügbar; es ist keine aufwendige Kultivierung notwendig, da tiefgefrorene Bakterien verwendet werden können. Ein weiterer Vorteil gegenüber anderen Bakterientests ist die problemlose Entsorgung der Bakterien, da die Leuchtbakterien in die Risikogruppe 1 eingeteilt und bislang nicht als Krankheitserreger oder -überträger in Erscheinung getreten sind. Für Gentoxizitätstests mit anderen Bakterien, bei­spielsweise Salmonella typhimurium, sind hingegen spezielle Laboreinrichtungen zur Einhaltung strenger Sicherheitsvorschriften erforderlich.

Neben marinen Habitaten besetzen Leuchtbakterien auch Süßwasserhabitate; es wurden auch schon terrestrische Gattungen beschrieben (Schulz 1987).

Folgende Tabelle zeigt einen Über­blick über Lebensformen und Lebensräume bei Leucht­bakterien.

Tabelle 1 Lebensformen und Lebensräume von Leuchtbakterien (aus Hastings 1986)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Lumineszenz ist die Umwandlung chemischer Energie in elektronische Anregungsenergie. Die Lumineszenzreaktion benötigt FMNH2 als Reduktionsäquivalente. Diese werden durch die FMN-Reduktase des Citratcyclus bereitgestellt. Die bakterielle Luciferase, eine Monooxygenase, bildet zunächst einen Komplex mit FMNH2. Dieser wird durch Sauerstoff oxidiert und katalysiert in der Folge die Oxidation eines langkettigen Aldehyds (Tetradecanal) zu dessen korrespondieren­der Fettsäure (Tetradecansäure). Dabei geht der Komplex in den angeregten Zustand über. Bei der Rückkehr in den Grundzustand wird Energie in Form von Licht frei. Die Maxima der Licht­emission liegen je nach Leuchtbakterien­art zwischen 465 - 505 nm; das Maximum von Photobacte­rium phosphoreum wird bei 490 nm erreicht (Hastings und Nealson 1977).

Die Lumineszenzreaktion verläuft gemäß folgender Summenformel:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Regeneration des Aldehyds erfolgt über die Myristinsäure (Tetradecansäure)-Reduk­tase un­ter Verbrauch von NADPH2 und ATP im stöchiometrischen Verhältnis zur Anzahl der gebilde­ten Aldehydmoleküle (Nealson und Hastings 1979).

Von dem im Grundzustand befindlichen Emittermolekül wird zunächst Wasser abgespalten. Der verbleibende Luciferase-FMN-Komplex wird schließlich wieder zu Luciferase und FMN gespal­ten.

In Abbildung 1 ist das Reaktionsschema der bakteriellen Lumineszenz dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2 Reaktionsschema der bakteriellen Lumineszenz (aus: Krebs 1992 b)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die im Stoffwechsel gebildete Menge an NADH2 wird zu etwa 20 % für den bakteriellen Leucht­vorgang verbraucht (Krebs 1992 b). Stoffe und Milieubedingungen, die die Stoffwech­selreak­tionen der Leuchtbakterien hemmen, führen zu einer Reduzierung der Lichtemission (Popp et al. 1991). Gerade diese Tatsache erschließt dem Leuchtbakterientest ein breites An­wendungsfeld. Er wird inzwischen auch bei der Untersuchung von Textilien, Löschwässern, Grundwässern und Bodeneluaten (Frahne und Hartmann 1995; Wieneke 1995; Glund et al. 1995; Pfeifer und Sinder 1995) eingesetzt. Weitere Anwendungsfelder für den Leuchtbakterientest nennen Ruiz et al. (1997). Die Hemmung der Lichtemission kann durch geeignete Meßgeräte quantifi­ziert wer­den. Krebs (1983) stellt eine Testmodifikation vor, die sogar ohne elektronische Meßgeräte aus­kommt. Er beschreibt eine Testvariante mit einer erhöhten Bakterienkonzentration, so daß die Biolumineszenz mit dem Auge gesehen und Intensitätsänderungen direkt abgeschätzt werden können.

Die Regulation der bakteriellen Lumineszenz von Vibrio fischeri wurde eingehend untersucht. Sie unterliegt der Autoinduktion und Katabolitre­pression. Das Bakterium produziert eine diffun­dierbare Substanz, welche sich im Medium während des Wachstums anhäuft. Es handelt sich da­bei um [N-beta-keto-caproyl-homoserin-lacton]. Diese Substanz ist das chemische Signal für die Expression der Lumineszenz-Gene und die Bildung der Luciferase (Schlegel 1992).

Das Lumineszenzsystem von Vibrio fischeri wird durch einen Gen­cluster mit veränderlichem Transkriptionsschema codiert (Richardson 1993).

Ungünstige Bedingungen wie Nährstoffmangel oder Hitzeschock beschleunigten die Ausbildung der Lumineszenz in Vibrio fischeri oder in E. coli, welches das lux-System von V ibrio fischeri enthielt (Bulich 1992).

Bei Verwendung von Glycerin als C-Quelle wird das Leuchten am stärksten stimuliert, während zum Wachstum auch mehrwertige Alkohole wie beispielsweise Ethylenglycol, Erythrit, Penta­erythrit, Dul­cit, Mannit, Sorbit oder Kohlenhydrate verwendet werden können (Kranz 1970). Auch Acetat, Succinat, Citrat und Oxalat können von den Bakterien zum Wachstum genutzt werden (Kremmeter 1961).

Die hohe Sensitivität der Leuchtbakterien beruht auf der indirekten Abhängigkeit der Biolumi­neszenz von einer ausreichenden ATP-Produktion und deren direkter NADH-Verknüpfung (Krebs 1992 b). Stoffe, die selektiv auf die Komponenten der Atmungskette wirken, beispiels­weise Cyanid, bereiten jedoch Probleme bei der Ergebnisinterpretation. Cyanid bindet selektiv an die Cytochrome der Atmungskette und blockiert so den weiteren Elektronentransport zum Sauerstoff. Für den Biolumineszenz-Nebenweg stehen dann mehr Elektronen als vorher zur Ver­fügung, und somit steigt das Leuchten kurzfristig sogar an (Krebs 1983). Auch für die Unter­suchung schlecht wasser­löslicher Stoffe oder solcher, die schwerlich die Zellwand durchdringen können, ist der Test wenig geeignet. Durch die Zugabe organischer Lösemittel kann die Löslich­keit dieser Substanzen erhöht werden. Die in Biotests am häufigsten eingesetzten Lösungsver­mittler sind Ethanol, Methanol und Dimethylsulfoxid (Ruiz et al. 1997). Ein weiter Kritikpunkt am Leuchtbakterientest ist die Tatsache, daß das natürliche Habitat nicht mit der zu unter­suchenden Matrix übereinstimmt. Die Ergebnisse sind somit nur bedingt auf Süßwässer über­tragbar. Ein Ansatz zur Lösung dieses Problems ist ein von Kanne et al. (1986) entwickelter Test, der die Lumineszenzeigenschaften auf Bakterienisolate aus Kläranlagen überträgt. Die Empfindlichkeiten gegenüber Schadstoffen schwanken im Vergleich zu Leuchtbakterien jedoch sehr stark, was nicht im Sinne einer Standardisierung ist.

V ibrio fischeri dient auch bei verschiedenen Langzeit-Tests als Testorganismus. Kalnowski et al. (1992) verglichen Atmung, Wachstum und Lumineszenz von Pho­tobacterium phosphoreum anhand von Umweltchemikalien aus der Gruppe der chlorierten und ni­trierten Aro­maten, der Tenside und Lösemittel, der arsenorganischen Verbindungen und der Schwermetalle. Für diese unter­schiedlichen Reinsubstanzen konnten sie eine gute Korrelation zwischen Lumi­neszenz- und Wachstumshemmung demonstrieren.

Gellert und Stommel (1994) entwickelten einen Zellvermehrungshemmtest mit Photobacterium phosphoreum, der in den Grundzügen dem LCK 486-Test der Fa. Dr. Lange gleicht. Wichtige Un­terschiede zu diesem Test sind die Verwendung selbstgezüchteter Bakterien, die Reduzierung der Kontakt­zeit auf 16 ± 1 h und die alleinige Bewertung der Zellvermehrungshemmung ohne Be­stimmung des Leuchtens. Um Interferenzen mit der Lichtemission frischer Bakterienzellen zu vermeiden, erfolgte die Bestimmung der optischen Dichte bei 650 nm. Leuchtbakterien emittie­ren Licht innerhalb eines Wellenlängenbereiches von 420 bis 630 nm (Beckman 1980). Als Kontrolle wurde eine unbeimpfte Verdünnungsreihe der Probe inkubiert. Somit konnte das Wachstum von Fremdbakterien erfaßt und die optische Dichte der Testansätze entsprechend korrigiert werden.

Zieseniss und Grabert (1995) verglichen die akut-toxische und chronisch-toxische Wirkung verschiedener Chemikalien auf das Leuchten von Vibrio fischeri mit dem LCK 486-Test. Dieser neu entwickelte Lumineszenz-Hemmtest soll durch die Ausdehnung der Kontaktzeit von 30 min auf 24 h Aussa­gen über mögliche chroni­sche Effekte von (Ab-)Wasserproben, Eluaten fe­ster Proben sowie Chemikalien auf die Lichtemission der Leuchtbak­terien ermöglichen. Weiter­hin kann der Einfluß der Proben auf die Vermeh­rungsfähigkeit der Leucht­bakterien bestimmt wer­den (Dr. Lange GmbH 1997).

Beim Vergleich des chronischen Tests mit dem DIN-Test ergaben sich drei unterschiedliche Wirkkate­go­rien. Schwer­metallionen besaßen wesentlich höhere chronische Toxizitäten als akute, bei ver­schiedenen orga­nischen Verbindungen entsprach die chronische Toxizität der akuten Toxizität und bei den mei­sten phenolischen Verbindungen sowie bei Ammoniumacetat war die chroni­sche Toxizität viel ge­ringer als die akute Toxizität.

Über akut-toxi­sche Wirkungen von Chemikalien auf Leuchtbakterien liefern Kaiser und Ribo (1988), Walker (1988), Munkittrick und Power (1991) sowie Kaiser und Palabrica (1991) umfassende Da­ten. Angaben über chronische Wirkungen von Chemikalien gegenüber Leucht­bakterien liegen bisher nur von Zieseniss und Grabert (1995) sowie von Backhaus et al. (1997) vor.

Der chronische Leuchtbakterientest wurde im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt, nachdem sich gezeigt hatte, daß bei Sedimentuntersuchungen unter Verwendung der standardisierten Biotests mit Al­gen, Daphnien und Leuchtbakterien keine Hemmwirkungen auf die Testorganismen fest­gestellt werden konnten. Aufgrund der vorliegenden Informationen über die anthropogene Be­einflussung der Se­dimente wäre dies zu erwarten gewesen.

Es existieren auch Testsysteme für die kontinuierliche Gewässerüberwachung mit Vibrio fischeri. Der "Regensburger Leuchtbakterientest" ist eine Apparatur, die das genormte Verfahren auto­matisiert. In Abständen von einer halben Stunde wird eine neue Wasserprobe genommen und untersucht. Das Gerät ist für den unbeaufsichtigten Dauerbetrieb für die Dauer einer Woche in Gewässergütemeßstationen und an Kläranlagen konzipiert (WWW 1998 c). Auch die Firma Ko­libri Umweltanalytik GmbH vertreibt ein kontinuierlich betriebenes Leuchtbakterientoximeter (WWW 1998 e) mit ähnlichen Einsatzmöglichkeiten.

Daphnien sind Konsumenten niederer Ordnung. Sie stehen zwischen den Destruenten und Primär­produzenten einerseits und den Konsumenten höherer Ordnung andererseits (DEV 1989 a). In europäischen und nordamerikanischen Kleingewässern sind sie weit verbreitet (Fent 1998). Die hohe Durchsatzrate an Kiemenwasser bedingt eine große Empfindlichkeit; Daphnia magna kann innerhalb von zwei Minuten bis zu 80 % ihres Körperwassers austauschen (Meijering 1958). Die kurze Lebensdauer von nur etwa 40 Tagen bedingt eine schnellere Schad­stoffaufnahme und da­mit eine sehr viel höhere Empfind­lichkeit gegenüber Schwermetallen als beispielsweise bei Fischen (Meijering 1958). Durch die ge­ringe Größe der Tiere kann das ein­gesetzte Testvolu­men gering gehalten werden. Die Tatsache, daß Daphnien sich partheno­genetisch vermehren können, gewährleistet einheitliches genetisches Material und führt zu einer guten Reproduzier­barkeit des Tests. Ein weiterer Vorteil des Daphnientests liegt in der eindeu­tigen Testaussage; Testkriterium ist die Schwimmfähigkeit der Daphnien. Auch der Gerätebedarf für den Test ist relativ niedrig.

Bringmann und Kühn (1977 a; 1982) stellten grundlegende ökotoxikologische Untersuchungen für die Be­wertung von Vorflutern an und legten unter Verwendung ihrer Laborergebnisse Grenzwerte für wassergefährdende Stoffe fest. Neben Daphnien verwendeten sie auch Algen, Bakterien und Kleinkrebse zur Gefährdungsabschätzung (Bringmann und Kühn 1959; 1977 b). Knie (1983) führte an der Wupper Untersuchungen mit Daphnien durch. Er konstatierte, daß der Daphnientest die Ergebnisse der lim­nologisch-ökologischen Untersuchungen ergänzt und erweitert. Wilbois (1988) stellte ähnliche Untersuchungen an der mittleren Saar an. Bei der Ge­wässergütebeurteilung spielt die Daphnientoxizität eine wichtige Rolle. Krebs (1988) schlägt eine Bewertung anhand von pT-Werten (potentia toxicologicae) vor, während Knie (1983) eine Ein­teilung in Toxizitätsklassen über GD-Werte vornimmt. Bei neueren Daphnientests (Lee et al. 1997; Bitton et al. 1995) dienen Veränderun­gen im Freßverhalten der Tiere als Testkriterium. Beide Tests besitzen neben der kürzeren Expositionszeit eine höhere Sensitivität gegenüber 24 h oder 48 h-Daphnientests. Es wurden auch kontinuierliche Testverfahren zur Online-Über­wachung von Gewässern entwickelt, wobei der Meßparameter die Schwimmaktivität der Tiere ist (Hansen 1987; Umweltbundesamt 1995).

Algen spielen als Primärproduzenten in aquatischen Ökosystemen eine bedeutende Rolle. Sie sind photoautotroph und benötigen neben Licht und CO2 auch Stickstoff und Phosphor zum Wachstum. Damit sind sie auch geeignet, um Eutrophierungseffekte, die durch diese Nährstoffe hervorgerufen werden können, anzuzeigen. Algen werden auch zur Bestimmung von photosyn­thesehemmenden Herbizidrückständen in Böden und Gewässern sowie zur Trinkwasseruntersu­chung eingesetzt (Gunkel 1994). Algen können im Wasser gelöste Elemente und Verbindungen in erheblichem Maße - teilweise weit über den physiologischen Bedarf hinaus - aufnehmen und anreichern (Lorch et al. 1987). Da aufgrund mangelnder Selektionsprozesse neben Nährstoffen auch toxische Stoffe aufgenommen werden, besitzen Algen eine hohe Sensitivität gegenüber die­sen Stoffen.

Seit 1991 steht ein genormtes Verfahren zur Verfügung, um von (Ab-)Wässern ausgehende Hemm- oder Fördereffekte auf Algen erfassen zu können (DEV 1991 a). Der Wachstums­hemmtest mit Algen ist der zur Zeit am häufigsten durchgeführte Algenbiotest (Mingazzini et al. 1997). Das Testprinzip beruht auf der innerhalb von 72 h durch Schadstoffe hervorgerufenen Wachstumshemmung der Algen gegenüber einer Kontrolle. Das Wachstum der Algen ist ein sehr guter Parameter für die Erfassung toxischer Wirkungen, da die Photosynthese eine spezifische Leistung des pflanzlichen Stoffwechsels ist. Als Maß für die Algenbiomasse dient beim Test nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a) die in-vivo -Chlorophyll-Fluoreszenz. Sie wird bei 685 nm nach der Anregung der Chlorophyll-Moleküle mit monochromatischem Licht im blauen Spektralbe­reich (436 nm) bestimmt. Die Biomasse korreliert mit den Gehalten an ATP, DNA und Chloro­phyll-a nach Ethanol-Extraktion sowie der Zellzahl, so daß auch diese Parameter zur Biomasse­bestimmung herangezogen werden können. Auf das Testsystem können sowohl toxische Stoffe als auch Pflanzennährstoffe einen Einfluß ausüben. Toxische Stoffe verursachen eine Hemmung der Algenvermehrung, während Nährstoffe die Vermehrung fördern. Beide Effekte stellen schwerwiegende Eingriffe für ein Gewässer dar (Dannenberg 1993).

Bei der Interpretation der Ergebnisse ist auch die Möglichkeit der Überlagerung von Hemmung und Förderung des Wachstums zu beachten. So können toxische Wirkungen durch Nährstoff­zufuhr maskiert werden. Um eine gesicherte Aussage treffen zu können, ist es daher notwendig, den Verlauf der Hemm- oder Förderungswerte über mehrere Verdünnungsstufen zu verfolgen. In ökotoxikologischen Tests werden Algen der Gattungen Scenedesmus, Chlorella und Chlamydo­monas eingesetzt (Streit 1992). Die Prüfstufe I des Chemikaliengesetzes (WWW 1998 d) schreibt zur Prüfung der Ökotoxizität von Umweltchemi­kalien einen Algenwachstumshemmtest vor (Arndt et al. 1987). Ein von Chen und Lin (1997) entwickeltes Algentestverfahren erreichte unter Einsatz eines Chemostaten bei einer Kontaktzeit von 24 h im Vergleich zu Batch-Ansätzen eine höhere Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Mingazzini et al. (1997) entwickelten einen Kurzzeit-Algentest, der auf der Bestimmung der photosynthetischen O2-Entwicklung beruht. Die Sensitivität gegenüber Herbiziden war bei einer Kontaktzeit von lediglich 30 min mit der des Wachstumshemmtests nach 96 h vergleichbar.

Biotestverfahren mit Fischen gewährleisten wertvolle Aussagen bezüglich der Toxizität unbe­kannter Verbindungen, da hierbei sowohl organspezifische Wirkungen als auch neurotoxische Effekte erfaßt werden können (Gunkel 1994). Der Fischtest ist ein im Abwasserabgabengesetz rechtsverbindlich festgeschriebener Test. Die Höhe der Abwasserabgabe ist unter anderem von der Fisch­giftigkeit abhängig. Der Fischtest gehört zu den relativ häufig durchgeführten Routine­biotests in Behörden für die Abwasserkontrolle (Dannenberg 1993). Biotests mit Fischen wer­den zurecht aus Tierschutzgründen eingeschränkt. Das häufige Auftreten von Fischsterben führt jedoch die Notwendigkeit der Erfassung fischtoxischer Substanzen vor Augen. Der als Alterna­tive zum Fischtest diskutierte Fischzelltest ist unempfindlicher als der Fischtest und läßt des­weiteren keine weitere Differenzierung oder Wertung zu. Genau diese Differenzierung ist aber wichtig für die Festsetzung der Abwasserabgabe (Dannenberg 1993).

Ein Ersatz des Fischtests durch andere Biotests, beispielsweise durch den Leuchtbakterientest ist nicht immer möglich, da viele Toxine selektiv auf verschiedene Organismen wirken. Die von Krebs (1983) angegebenen Empfindlichkeitsverhältnisse der EC50 von Leuchtbakterien zur LC50 von Fischen variieren für Einzelsubstanzen in einem Bereich von 1:590 für Pb2+ bis 1:0,015 bei CN-. Die Ergebnisse dieser beiden Biotests sind nicht aufeinander übertragbar und somit sind die Tests auch nicht gegenseitig ersetzbar.

Sedimente als Zustandsindikatoren. Die Zusammensetzung von Sedimenten spiegelt litholo­gische Verhältnisse eines Gewässers, zivilisatorische Einflüsse und die Wechselwirkungen zwi­schen Feststoffpar­tikeln und gelösten Substanzen wieder (Reichert und de Haar 1982). Sedi­mente spielen eine bedeutende Rolle im Stoffhaushalt der Gewässer; sie können Quellen für Nähr- oder Schadstoffe sein. Limnogeologische und sedimentologische Untersuchungsverfahren wurden be­reits vor über 75 Jahren angewandt, um die anthropogene Beeinflussung des Stoff­haushaltes in einem See nach­zuweisen (Reichert und de Haar 1982). Mitte der 50er Jahre zeigte Züllig (1956) in einer umfassenden Studie, daß verschiedene äu­ßere Einflüsse auf aquati­sche Systeme von deren Sedimentablagerungen konser­viert werden. In den 60er Jah­ren erhielt die Analyse der Beziehungen zwischen Wasserkörper, Bodensediment und Organis­men durch das Problem der Gewässereutrophierung eine besondere Aktualität. Daran schloß sich die Unter­suchung und Erfassung von umweltrelevanten organi­schen und an­organischen Stoffen an. In neueren Studien werden Sedimente vor allem im Hin­blick auf eine mögliche Re­mobilisierung und die Auswirkungen der enthaltenen (Schad-)Stoffe untersucht. Diese Untersu­chungen sollen schließlich eine umfassende Sedimentgütebewertung ähnlich der Gewässer­gütebewertung er­möglichen, welche über ein einheitliches Bewertungs­system gewährleistet werden soll (münd­liche Mitteilung Schlungbaum).

Es existieren verschiedene physikalisch-chemische Bewertungsverfahren für Baggergut oder Sedimente. Aufgrund der komplexen Rechtslage und dem weiten Spektrum an Schutzgütern und Nutzungen beim Umgang mit Baggergut und Bodenschlämmen gibt es bislang keine bun­deseinheitlich abge­stimmten Beurteilungswerte für die Verwendung, Verwertung und Beseiti­gung dieser Materialien (ATV 1997). Es existieren mittlerweile zahlreiche Prüflisten, die von Hösel et al. (1996) zusam­mengestellt wurden. Die Erarbeitung eines Bundesbodenschutz­gesetzes und den Bodenschutz­gesetzen der Länder soll im Rahmen einer untergesetzlichen Re­gelung ebenfalls Bodenwerte festlegen. Vor der Beurteilung von Baggergut oder Sedimenten an­hand dieser Prüfwerte sollte die regionale Hintergrundbelastung bekannt sein; im Bereich von Erzvorkommen können bestimmte Stoffe geogen bedingt erhöht sein (ATV 1997).

In all diesen Richtlinien sind jedoch keinerlei Grenzwerte für Biotestuntersuchungen angegeben. Calmano (1996) stellt ein 5-stufiges Bewertungsverfahren für Sedimente dar, das in modifizier­ter Form auch in dieser Arbeit Anwendung findet. Zunächst werden vorliegende Informationen aufbereitet, wobei sowohl chemische als auch biologisch-ökologische Untersuchungsergebnisse zu beachten sind. In der zweiten Stufe werden grundlegende Parameter des Untersuchungsgutes bestimmt. Dies sind unter anderem pH-Wert, Korngrößenverteilung, Gehalt an organischem Kohlenstoff, Ge­halt an Ammoniak etc. Die dritte Stufe sieht Untersuchungen in der Belastungs­zone vor. Da sol­che Untersuchungen jedoch sehr aufwendig sind, wurde in dieser Arbeit direkt die Stufe vier an­gewandt. Sie sieht den Nachweis der Sedimenttoxizität durch Eluattests vor. Auf diese Tests und die Auswahl einer geeigneten Elutionsmethode wurde besonderer Wert gelegt, da sie im Gegen­satz zu den Untersuchungen der Stufe drei relativ schnell durchführbar und auch im Rah­men einer Routineüberwachung einsetzbar sind. Die Stufe fünf sieht weitere Biotests vor, um zu­sätzliche Expositionswege, auch auf den Menschen, zu untersuchen. Hierzu gehören bei­spielsweise Gen­toxizitätstests. Da in Umweltproben in der Regel keine Einzelstoffbelastungen, sondern Schad­stoffgemische vorliegen, sollte die unterschiedliche Sensi­tivität der Testsysteme genutzt werden, um das Ziel einer Schadstofferkennung zu erreichen (Ahlf et al. 1991).

Die Aussagekraft von chemischen Analysen für biologische Wirkungen ist sehr begrenzt, da we­niger als 1 % aller chemischen Stoffe auf ihre Toxizität für aquatische Organismen untersucht sind (Martel et al. 1988). Der Vergleich der Arten und Zahl von Organismen aus belasteten und unbelasteten Sedimenten bringt einige Schwierigkeiten mit sich, da kurzfristige chemische und physikalische Änderungen auftreten können (beispielsweise Sauerstoffverarmung), ohne toxische Rückstände im Sediment zu hinterlassen. Aussagen über tieferliegende Schichten sind ebenfalls nicht möglich, da diese meist nicht besiedelt sind. Es ist sinnvoller und darüber hinaus weni­ger zeitintensiv, Eluate der Sedimente in Biotests zu untersuchen. Wäßrige Elutionen simulieren Re­suspensionsvorgänge, die besonders beim Ausbaggern von Gewässern auftreten (Ahlf 1995). Die Inhaltsstoffe dieser Eluate entsprechen somit dem bioverfügbaren Anteil der (Schad-)Stoffe. Die Mobilität von Metallen kann durch die Anwendung verschiedener Elutionsverfahren deutlich beeinflußt werden (Sommerfeld und Schwedt 1996). Die Metallmobilisierung nimmt mit stei­gendem pH-Wert ab, ist jedoch weitgehend unabhängig von der Herkunft des Sediments (Gräbe und Frimmel 1996). Die Kenntnis der Exposition eines Schadstoffes ist nötig, reicht aber allein nicht aus, um Umweltgefährdungen voraussagen zu können (Ahlf et al. 1991). Es können auch Eluate unter Zusatz von Lösungsvermittlern (Scheibel et al. 1991; Stoll 1997; Ahlf et al. 1991) gewonnen werden. Es muß jedoch ausgeschlossen werden, daß der Lösungsvermittler ei­nen Effekt auf die Testorganismen ausübt. Die biologische Untersuchung liefert nützliche In­formationen bei der Bewertung des Sedimentzustandes für Maßnahmen zur Umlagerung oder Deponierung und bei der regionalen und großräumigen Gewässergütekartierung.

Die Untersuchung von Fließgewässersedimenten erfolgte im Rahmen des Screenings und der Kartierung regionaler "hot spots". Durch regelmäßige Sedimentuntersuchungen an Belastungs­schwerpunkten könnte eine zusätzliche Kontrolle erreicht und die bestehende Überwachungs­strategie somit verbessert werden. Abwassereinlei­tungen sind nicht immer kontinuierlich und beinhalten stets unterschiedliche Schadstofffrachten. Sedimente können diese Einleitungsvor­gänge zeitlich summieren. Parallel angelegte Untersuchungen von Sedimenten und Oberflächen­wässern ermöglichen Aussagen über Schadstoffakkumulationen im Sediment. Wenn im Ober­flächen­wasser keine toxischen Einflüsse feststellbar sind, könnte das Sediment eine Belastungs­quelle darstellen. Sollten aber auch vom Sediment keine toxischen Einflüsse ausgehen, so kann eine Gefährdung ausgeschlossen werden.

In der vorliegenden Arbeit sollte neben den bereits bekannten und genormten Biotests mit Leuchtbakterien, Daphnien und Algen ein neu entwickelter 24 h-Leuchtbakterientest auf seine Praxistauglichkeit für den Einsatz im Rahmen der Routineüberwachung geprüft werden. Des weite­ren sollten die vorlie­genden Biotest­ergebnisse der Direkteinleiter-Untersuchungen zu­sätzlich mit dem chronischen Leuchtbakterientest untersucht werden, um die Empfindlichkeit der Testsysteme untereinander zu vergleichen.

Durch die Untersuchung ausgewählter Probestellen sollte ein erster Überblick über die Belastung der Sedimente in saarländischen Gewässern gewonnen werden. Die Sedimentunter­suchung mit Biotests wurde durch die chemische Analyse der Proben vervollständigt.

3. Material und Methoden

3.1 Nährmedien

3.1.1 Algen

3.1.1.1 Mineralnährmedium nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a), modifiziert

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten^[2]

3.1.2 Daphnien

3.1.2.1 Künstliches Süßwasser nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.1.2.2 M4- Medium (Elendt 1990)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.1.3 Leuchtbakterien

3.1.3.1 Salted-Sea-Water-Kulturmedium mit C-Quelle (SSWC, Nealson 1978)

SSWC-Agar-Platten und SSWC-Flüssigmedium wurden zur Wachstumskontrolle von autochtho­nen Bakterienstämmen in Sedimentproben, sowie für die Anzucht der Bakterien für Foto- und TEM-Aufnahmen eingesetzt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zur Herstellung von Agarplatten wurden 15 g Agar/l Nährmedium zugesetzt. Das Nährmedium wurde anschließend 20 min lang bei 121 °C autoklaviert. Das Flüssigmedium wurde bei 4 °C auf­bewahrt, und die Agarplatten wurden nach dem Verfestigen bei gleicher Temperatur gelagert.

3.1.3.2 Artificial-Sea-Water-Medium für Leuchtbakterien (ASW, Krebs 1992 a)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.2 Probestellen

Es wurden insgesamt 15 Sedimentproben an 13 verschiedenen Stellen im Rahmen von drei Kampagnen im Januar, April und Juni des Jahres 1997 entnommen.

Die Auswahl der Probestellen erfolgte anhand von Erfahrungswerten hinsichtlich einer mög­lichen starken lokalen Belastung ("hot spots"). Dies kann hervorgerufen werden durch Ab­wassereinleitungen von Industrieanlagen wie Chemiewerken, Kokereien oder Eisen- und Stahl­verarbeitungsanlagen. Im Rahmen der beiden ersten Probenahmekampagnen wurde eine Vor­auswahl von Probestellen getroffen, und es wurden verschiedene Elutionsmethoden für den Einsatz in Biotests geprüft.

Im Rahmen der dritten Kampagne dieser Arbeit wurden am 20.6.1997 sieben Stellen beprobt. Die Sediment- und Oberflächenwasserproben der Probestellen „Saar-Altarm in Saarlouis“, „Hei­nitzbach bei Neunkir­chen“ und „Rossel bei Emmersweiler“ wurden umfassend mittels Biotests und chemischer Analytik untersucht. An der Probestelle „Prims bei Dillingen“ wurde Ober­flächenwasser zur Unter­suchung mit Biotests ent­nommen.

3.2.1 Charakterisierung der Probestellen

3.2.1.1 Saar-Altarm in Saarlouis

Die Probestelle liegt in Saarlouis auf der Mitte der Brücke der St. Nazairer Allee, die über das Gewässer führt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2 Saar-Altarm in Saarlouis; Blick von St. Nazairer Allee in Richtung City

Der Altarm verläuft im Bereich der Probestelle gestreckt mit einer gleichmäßigen Breite von etwa 15 m und einer Tiefe von etwa 2,5 -3 m. Beim Saar-Altarm in Saarlouis handelt es sich um ein nahezu stehendes Gewäs­ser. Die Uferneigung zu beiden Seiten ist flach, die Uferhöhe beträgt rechts und links jeweils etwa 0,5 m. Der Uferbewuchs setzt sich zum überwiegenden Teil aus Bäumen und Sträuchern zu­sammen. Gräser, Kräuter und Brennesseln sind in geringem Maße vertreten. Das Gehölz verursacht eine ge­ringe Beschattung des Gewässers. In unmittelbarer Nähe der Probestelle befinden sich Er­holungs- und Verkehrsflächen. In den Saar-Altarm mün­den sowohl Regenentlastungsbauwerke als auch der Ablauf einer kommunalen Kläranlage. Der Saar-Altarm ist als naturnah zu bezeichnen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3 Saar-Altarm in Saarlouis; Blick von St. Nazairer Allee in Rich­tung City

Als Substrat fand sich vor allem Schlamm und pflanzlicher Detritus. Von dem schwarzen Schlamm ging ein fauliger Geruch aus. Durch die Probenahme traten schwarze Sedimentpartikel an die Wasseroberfläche. Das Oberflächenwasser war klar und geruchsfrei. Zum Zeitpunkt der Probenahme herrschte trockene Witterung.

3.2.1.2 Heinitzbach bei Neunkirchen

Die Probestelle liegt an der Grubenstraße zwischen Heinitz und Neunkirchen gegenüber der Ein­fahrt zur dortigen kommunalen Kläranlage. Der Heinitzbach ist ein gestreckt verlaufender Bach mit einer Gewässerbreite von weniger als 5 m und einer Tiefe von weniger als 1 m. Das Gewässer fließt ruhig mit einer Geschwindigkeit von weniger als 0,2 m/s. Die Uferneigungen zu beiden Seiten sind flach, die Uferhöhe beträgt jeweils etwa 30 - 50 cm. Das Ufer ist mit Buchen, Sträu­chern, Brennesseln, Gras und Kräutern bewachsen. Es erfolgt eine starke Beschattung durch das Gehölz. Im Umkreis der Probestelle befinden sich Laubwald, Ruderalflächen und Verkehrs­flächen. In den Heinitzbach werden häusliche und gewerbliche ungeklärte Abwässer eingeleitet.

Als Substrat traten vornehmlich Sand und Schlamm auf, Geäst war nur in geringem Ausmaß zu finden. Die Gewässerführung kann als naturnah angesehen werden. Das Was­ser war klar, ver­breitete jedoch starken Abwasser- und Fäkalgeruch. Zum Zeitpunkt der Probenahme herrschte trockene Witterung.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4 Heinitzbach bei Neunkirchen; Blick in Fließrichtung nach Neunkirchen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5 Heinitzbach bei Neunkirchen unmittelbar nach Probenahme mit Sedimentschöpfer

Durch die Probenahme wurden auch hier schwarz gefärbte Sedimentpartikel aufgewirbelt und trübten das Wasser (Abbildung 5).

3.2.1.3 Rossel bei Emmersweiler

Die Probestelle liegt in der Forbacher Straße an der über die Rossel führenden Brücke, unmittel­bar unterhalb des dort vorhandenen Pegels.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6 Rossel bei Emmersweiler; Blick entgegen der Fließrichtung nach Frankreich

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7 Rossel bei Emmersweiler; Blick in Fließrichtung

Die Rossel ist ein gewundener kleiner Fluß mit einer Gewässerbreite von etwa 5 m. Die Ge­wässertiefe beträgt etwa 2 m. Das Wasser fließt turbulent mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 m/s. Die Uferneigung ist zu beiden Seiten mäßig steil, die Uferhöhe beträgt jeweils etwa 1 m. Der Uferbewuchs setzt sich aus Ahorn- und Weidenbäumen sowie Brennesseln und Gras zu­sammen. Das Gewässer wird durch das Gehölz gering beschattet. Im Umkreis der Probestelle finden sich Laubwald, Ruderalflächen, bebaute Flächen und Verkehrsflächen. In die Rossel wer­den unge­klärte häusliche und gewerbliche Abwässer eingeleitet. In unmittelbarer Nähe befinden sich mehrere Chemiewerke, die vorwiegend Düngemittel herstellen. Die Rossel kann als naturnah an­gesehen werden. Als Substrat traten vorherrschend Sand und Schlamm auf, vereinzelt fanden sich größere Steine sowie Geäst. Das Wasser war klar, jedoch war ein leicht fauliger Geruch fest­zu­stellen. Bei der Probenahme herrschte bedeckte Witterung.

3.2.1.4 Prims bei Dillingen

Die Prims ist ein gewundener Fluß mit einer Gewässerbreite von weniger als 50 m und einer wechselnden Gewässertiefe von weniger als 50 cm bis mehr als zwei Meter. Das Gewässer fließt mit kleinen Turbulenzen bei einer Geschwindigkeit von etwa 1 m/s. Die Uferneigung bei­der Ufer ist mäßig steil, die Uferhöhe beträgt jeweils etwa zwei Meter. Der Uferbewuchs besteht aus Gräsern, Kräutern, Brennesseln, Bäumen und Sträuchern. Durch Bäume erfolgt eine geringe Be­schattung. Im Umkreis der Probestelle befinden sich Ruderalflächen, bebaute Flächen und Ver­kehrsflächen. Die Prims wird etwa 1200 m flußaufwärts von der Probestelle im Bereich einer ei­senverar­beitenden Industrieanlage zum Löschen von Schlacke benutzt. In das Gewässer werden ferner mechanisch-biologisch gereinigte Abwässer einer Kokerei eingeleitet. Auch Regen­über­läufe münden in die Prims. Die Prims kann als naturnah bezeichnet werden. Als Substrat fand sich vor allem Grobkies und Steine. In untergeordnetem Maß waren Schlamm und Sand vor­handen. Das Wasser war klar und ge­ruchs­frei. Zum Zeitpunkt der Probenahme herrschte sonnige Witterung.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 8 Prims bei Dillingen, unmittelbar vor der Mündung in die Saar; Blick entgegen der Strö­mung in Richtung Dillingen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 9 Prims bei Dillingen; Blick auf die Mündung in die Saar

Tabelle 2 Übersicht über die Sediment-Probestellen im Saarland

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Probestellen sind im Kartenteil in Anhang 1 eingezeichnet.

3.3 Probenahme, Probenvorbereitung und Elutionen

3.3.1 Probenahme und Probenvorbereitung nach DIN 38 414 Teil 11 (DEV 1987)

Die Sedimentproben wurden in der Regel mit einem Sedimentgreifer (Fa. Hydro-Bios Apparate­bau GmbH, Kiel) entnommen. An einigen Probestellen waren die örtlichen Ge­gebenheiten je­doch so ungünstig, daß ein herkömmlicher Schöpfer (Abbildung 10) ein­gesetzt werden mußte. Die entnommene Sedimentmenge betrug jeweils etwa 2 Liter.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 10 Schöpfer zur Probenahme von Sediment

Mit einem Edelstahl-Analysensieb der Maschenweite 10 mm (Fa. Kurt Retsch GmbH, Haan) wurden gröbere Bestandteile wie Blätter oder Geäst von der Probe abgetrennt.

Die gesiebten Sedimentproben wurden in PE-Weithalsflaschen mit einem Nennvolumen von 5 l gefüllt, in Thermoboxen verstaut und noch am gleichen Tag wei­terverarbeitet. Oberflächen­wasser wurde mit Hilfe eines Kunststoffeimers entnommen. Vor Ort wurden pH-Wert, Leit­fähigkeit, O2-Gehalt und Temperatur des Ober­flächenwassers bestimmt.

3.3.2 Elutionsverfahren

3.3.2.1 Bestimmung der Eluierbarkeit mit Wasser im Schüttelversuch ("Präzisierte DEV S 4-Methode") (Sievers 1996)

Diese Methode war zum Zeitpunkt ihrer Anwendung noch nicht von der LAGA verabschiedet, stellt aber gegenüber der alten Vorschrift eine deutliche Verbesserung dar (Sievers 1996).

- Schlämme mit Feuchtegehalt > 90 % werden nicht eluiert, es erfolgt lediglich eine Phasen­trennung.
- Die Korngröße wird auf < 10 mm eingestellt.
- Das Wasser-Feststoff-Verhältnis beträgt 1: 10, Elutionsmittel ist deionisiertes Wasser.
- Die Elution erfolgt in einer Weithalsflasche für 24 h bei Raumtemperatur in einem Über­kopfschüttler mit 1 - 20 Upm, mit einem Horizontalschüttler bei etwa 50 -150 Upm
- Nach Beendigung der Elution werden Temperatur, pH-Wert und elektrische Leitfähigkeit gemessen.
- Vor Beginn der Phasentrennung erfolgt eine 15 minütige Sedimentation, danach wird der Überstand in Zentrifugenbecher überführt und 30 min lang bei RZB 2000 g zentrifugiert.
- Nach Beendigung der Zentrifugation wird der Überstand dekantiert und über ein Membran­filter der Porenweite 0,45 µm abgesaugt.
- Nach Beendigung der Filtration erfolgt eine photometrische Trübungsmessung.

3.3.2.2 Elution mit 1 %iger DMSO- und 2 %iger NaCl-Lösung nach Scheibel et al. (1991)

- Die Probe wird auf eine Korngröße von 2 mm ausgesiebt.
- Das Wasser-Feststoff-Verhältnis beträgt 1:5 oder 1: 10.
- Die Elution erfolgt mit 1 %iger DMSO- und 2 %iger NaCl-Lösung.
- Die Suspension wird über einen Zeitraum von 24 h auf einem Horizontalschüttler mit 100 Upm bei Raumtemperatur in Schraubverschlußflaschen mit Deckel eluiert.
- Der pH-Wert im Überstand wird auf 7,0 eingestellt.
- Eine Zentrifugation erfolgt nur bei trübem Überstand.

3.3.2.3 Elution modifiziert nach Stoll (1997)

- Das Wasser-Feststoff-Verhältnis beträgt 1: 10, Elutionsmittel ist deionisiertes Wasser
- Die Suspension wird 2 h lang auf einem Horizontalschüttler mit 160 Upm bei Raumtem­peratur in Schraubverschlußflaschen mit Deckel eluiert.
- Nach der Elution schließt sich eine Zentrifugation für 20 min bei RZB 7000 g und 4 °C an.
- Nach der Zentrifugation wird der Überstand dekantiert und im Biotest untersucht.

3.3.2.4 Elution nach Daniels et al. (1989)

- Das Wasser-Feststoff-Verhältnis beträgt 1:4, Elutionsmittel ist deionisiertes Wasser
- Auf einem Überkopfschüttler werden die Proben bei 4 Upm 1 h lang eluiert.
- Die Proben werden für mindestens 6 h bei 4 °C gelagert.
- Die wäßrige Phase wird 30 min lang bei 10 000 Upm in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert.
- Der Überstand wird durch einen vorgewaschenen Membranfilter (Porenweite 0,45 µm) fil­triert.

Alle Elutionen wurden in 1000-ml-Duran-Glasflaschen (Fa. Schott, Mainz) durchgeführt, welche bis zu einem Volumen von etwa 800 ml mit dem Sediment-Wasser-Gemisch befüllt waren. Zur Elution wurden Horizontal- (Typ 3020, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) oder Überkopfschüttler (Typ 124/ 12 Kz, Fa. Guwina-Hofmann GmbH) eingesetzt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 11 Überkopfschüttler zur Elution der Sedimentproben

Von allen Eluaten wurde der pH-Wert, der O2-­Gehalt, die elektrische Leitfähigkeit und die Temperatur nach dem Absetzen, unmittelbar vor der Zentrifugation, bestimmt.

Alle Eluate wurden in einer Kühlzentrifuge (Typ Varifuge RF, Fa. Heraeus, Osterode am Harz) zentrifugiert (30 min bei 5000 Upm), anschließend dekantiert und über ein Faltenfilter (Typ 598 ½ Æ 320 mm, Schleicher & Schüll, Dassel) vorfiltriert. Daran schloß sich eine Filtration mit ei­nem Druckfiltrationsgerät (Typ SM 16274, Fa. Sartorius, Göttingen ) mit zugehöriger Pumpe (Typ SM 16617, Fa. Sartorius, Göttingen) über ein Membranfilter (Typ NC 45 mit Porenweite 0,45 µm, Schleicher & Schüll, Dassel) mit Glasfaser-Vorfilter (Typ GF 92, Schleicher & Schüll, Dassel) an.

Vor der Untersuchung in den Biotests wurde der pH-Wert kontrolliert und gegebenenfalls mit 1 M HCl oder 1 M NaOH, entsprechend den Erfordernissen des jeweiligen Biotests, eingestellt.

3.4 Charakterisierung der Wasserproben

3.4.1 Abwässer

3.4.1.1 Temperatur

Die Temperatur beeinflußt die Sauerstofflöslichkeit in wäßrigen Systemen. Daneben wirkt sie sich grundlegend auf die Geschwindigkeit von Stoffwechselreaktionen aus.

Sie wurde zusammen mit dem Sauerstoffgehalt mit Hilfe des Oximeters OXI 196 (Fa. WTW, Weilheim) mit integrierter Sauerstoffsonde vom Typ EOT 196 gemessen.

3.4.1.2 pH-Wert

Der pH-Wert ist der negative dekadische Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration einer Lösung. Er wurde mit dem pH-Meter pH 196 (Fa. WTW, Weilheim) mit einer pH-Sonde des Typs SonTix 97 T mit integriertem Temperaturfühler bestimmt.

3.4.1.3 Leitfähigkeit

Die Leitfähigkeit ist von der Art und Konzentration der Ionen im Wasser abhängig; sie ist ein un­spezifisches Gesamtmaß für deren Gesamtkonzentration in einem Wasserkörper.

Die Bestimmung der elektrolytischen Leitfähigkeit erfolgte mit dem Feldgerät LF 196 (Fa. WTW, Weilheim) mit einer Sonde vom Typ Tetracon 96 –1,5.

3.4.1.4 O2-Gehalt

Da die Löslichkeit von Gasen und die Geschwindigkeit chemischer Reaktionen temperatur­abhängig sind, ist die Temperaturermittlung von Fließgewässern von grundlegender Bedeutung. Der Sauerstoffgehalt wurde mit Hilfe des Oximeters OXI 196 (Fa. WTW, Weilheim) mit inte­grierter Sauerstoffsonde vom Typ EOT 196 gemessen.

3.4.1.5 Weitergehende analytische Untersuchungen

Entsprechend den jeweiligen Verwaltungsvorschriften über die Mindestanforderungen an das Einleiten von Abwasser in Gewässer (Bundesministerium der Justiz 1996) wurden weitere chemische Analysen durch die Abwasserabteilung des SIGU Saarbrücken durchgeführt. Die Er­gebnisse dieser Untersuchungen sind in Anhang 2 beigefügt.

3.4.2 Begleitende Analytik bei Oberflächenwässern und Sediment-Eluaten

Bei den Oberflächenwässern und Sediment-Eluaten wurden die Gehalte an Nährstoffen, Metallen, Pestiziden und chlorierten Kohlenwasserstoffen im Rahmen von Routinemeß­programmen untersucht. Dies erfolgte in den chemischen Labors des SIGU Saarbrücken.

Tabelle 3 Übersicht über die Untersuchungsparameter und verwendeten Bestimmungsmethoden bei Oberflächenwässern und Sediment-Eluaten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten^[3]

3.5 Sedimentuntersuchungen

3.5.1 Korngrößenverteilung

Zur Bestimmung der Korngrößenverteilung wurden die Sedimentproben 24 h in einem Trocken­schrank (Typ KT 500, Fa. Heraeus, Osterode am Harz) bei 120 °C getrocknet. Danach wurden sie in einem Tiegel mit einem Porzellanmörser homogenisiert, abgewogen und anschließend auf eine Siebmaschine (Typ Analysette, Fa. Frisch) mit 7 Edelstahl-Analysesieben aufgegeben. Die Maschenweiten der Siebe betrugen 2 mm, 1 mm, 0,5 mm, 0,25 mm, 0,2 mm, 0,1 mm und 0,09 mm. Das Sieben der Proben dauerte etwa zwei Minuten. Die aufgefangenen Fraktionen wurden mittels einer Analysenwaage (Typ universal, Fa. Sartorius, Göttingen) ausgewogen. Die Auftra­gung der Massenanteilsumme erfolgte über die Korngröße.

3.5.2 Bestimmung des Wassergehaltes und des Trockenrückstandes nach DIN 38 414 Teil 2 (DEV 1985 a)

Wassergehalt und Trockenrückstand sind Bezugsgrößen für die Angabe von Stoffkonzen­trationen in den Sedimenten benötigt. Des weiteren waren sie notwendig zur korrekten Angabe der mit Wasser eluierbaren Stoffe.

Die Bestimmung von Wassergehalt und Trockenrückstand erfolgte mittels eines Trocken­schrankes. Bei einer Temperatur von 105 °C wurden die Proben in Porzellantiegeln mit einem Durchmesser von 35 mm oder 55 mm getrocknet. Anschließend wurden sie auf einer Analysen­waage (Typ AS 120 S -01, Fa. Sartorius, Göttingen) ausgewogen. Der Wassergehalt einer Sedi­mentprobe wurde nach folgender Formel berechnet:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Trockenrückstand derselben Probe ergibt sich aus:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.5.3 Bestimmung des Glührückstands und des Glühverlusts nach DIN 38 414 Teil 3 (DEV 1985 b)

Glührückstand und Glühverlust geben Auskunft über den nicht flüchtigen, anorganischen Teil einer Sedimentprobe. Die Bestimmung des Glühverlusts erlaubt unter Umständen auch eine Aussage über den Gehalt an organischer Substanz. Glührückstand und Glühverlust wurden nach der Bestimmung des Trockenrückstands in Porzellantiegeln durch Glühen in einem Glühofen (Typ MR 170 E, Fa. Heraeus, Osterode am Harz) be­stimmt. Zum Auswiegen der Proben kam eine Analysenwaage (Typ AS 120 S -01, Fa. Sarto­rius, Göttingen) zum Einsatz.

Der Glührückstand einer Sedimentprobe wird nach folgender Formel berechnet:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der Glühverlust der Trockenmasse ergibt sich aus:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.6 Lagerung der Proben

3.6.1 Eluate und Oberflächenwasserproben

Diese Proben wurden, soweit möglich, ohne Zeitverzug in den Biotests eingesetzt. War eine di­rekte Weiterverarbeitung nicht möglich, wurden sie entweder wenige Tage bei 4 °C im Dunkeln in den für die Elution benutzten Glasflaschen aufbewahrt oder bei –18 °C in 5-l-PE-Weithals-Schraubflaschen tiefgefroren. Bereits aufgetaute Proben wurden nicht wieder eingefroren, son­dern bei 4 °C im Dunkeln in den entsprechenden Gefäßen gelagert und zügig verarbeitet.

3.6.2 Direkteinleiterproben

Die Direkteinleiterproben stammten aus der Routineüberwachung des SIGU und wurden am Tag der Probenahme bei – 18 °C eingefroren. Nach dem vollständigen Auftauen wurde der pH-Wert kontrolliert und gegebenenfalls eingestellt. Sofern aufgetaute Proben nicht am gleichen Tag in allen Biotests verwendet werden konnten, wurden sie bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt und da­nach innerhalb von 2 Tagen verarbeitet.

3.6.3 Referenzproben

Chemikalienlösungen wurden in der Regel bei 4 °C im Dunkeln gelagert.

3.7 Biologische Testmethoden

3.7.1 Algentest modifiziert nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)

3.7.1.1 Testorganismus und Grundlage des Verfahrens

Im Algentest wurde die einzellige Grünalge Scenedesmus subspicatus CHODAT 8681 SAG (Chloro­phyceae) verwendet. Sie wurde vom Pflanzenphysiologischen Institut in Göttingen bezogen. Es wird die Wirkung von (Ab-)Wässern und wäßrigen Eluaten auf die Vermehrung der Algen unter­sucht. Dazu werden die Änderungen der Zellzahlen über die Ermittlung der in-vivo -Fluoreszenz nach einer Inkubationszeit von 72 h in den Kontroll- und Testansätzen miteinander verglichen.

3.7.1.2 Anzucht und Stammhaltung

Die Anzucht der Algen erfolgte unter sterilen Bedingungen durch Überimpfen in 10-fach kon­zentrierte Nährlösung (Abschnitt 3.1.1.1).

Nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a) sollen die Vorkulturen unter gleichen Bedingungen wie die Testkulturen inkubiert werden. Die Bedingungen in der Klimakammer konnten jedoch kein ausreichendes Algenwachstum in den Vorkulturen gewährleisten. Daher wurde die Algenkultur vor Testbeginn über mehrere Tage am Fenster bei Raumtemperatur inkubiert, wodurch ein aus­reichendes Wachstum erreicht werden konnte. Einmal wöchentlich wurde die Kultur in eine frische 10-fach konzentrierte Nährlösung überimpft. Um ein Absetzen der Algen zu vermeiden, wurde die Suspension mit einem Magnetrührer in Bewegung gehalten. Diese Suspension diente während des gesamten Untersuchungszeitraums als Stammkultur.

3.7.1.3 Inkubationsbedingungen

Die Inkubation der Test- und Kontrollansätze erfolgte in 300-ml-Erlenmeyerkolben in einem Gesamtvolumen von 100 ml. Die Gefäße waren durch Wattestopfen verschlossen. In der be­nutzten Klimakammer herrschte eine Temperatur von 23 ± 2 °C. Die Beleuchtung erfolgte durch 10 Leuchtstoffröhren (Typ F 25 universal white, 58 W, Fa. Osram), die 30 cm über den Kultur­gefäßen angebracht waren. Hierdurch wurde eine Raumbestrahlungsstärke von etwa 10000 Lux gewährleistet. Die Beleuchtungsstärke wurde mit Hilfe eines Luxmeters (Panlux Electronic, Gossen) kontrolliert. Mit einem Horizontalschüttler (Typ HT, Fa. Infors AG, Schweiz) wurden die Inkubationsgefäße bei 100 Upm in Bewegung gehalten. Die Inkubationsdauer im Test betrug 72 h.

3.7.1.4 Probenvorbereitung

Die Proben wurden zunächst kräftig geschüttelt, und der pH-Wert wurde mit 1 M NaOH oder 1 M HCl auf 7,0 ± 0,2 eingestellt. Des weiteren wurde die Eigenfluoreszenz der Proben bestimmt. Auf eine Filtration der Abwasserproben wurde verzichtet, um auch partikelgebundene Schad­stoffe erfassen zu können.

3.7.1.5 Herstellung der Vorkultur

Aus der sich im Wachstum befindlichen Stammkultur wurde die Zellzahl mit 10-fach konzen­trierter Nährlösung so verdünnt, daß sich im Testansatz etwa 104 Zellen/ml befanden. Die Be­stimmung der Zellzahl erfolgte mittels einer Zählkammer nach Neubauer.

3.7.1.6 Testdurchführung

Die Testdurchführung erfolgte in Anlehnung an die DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a). Auf­grund der Probleme mit dem Algenwachstum wurde die Menge an 10-fach konzentrierter Nähr­lösung von 10 ml auf 30 ml pro Ansatz erhöht, so daß sich folgendes Pipettierschema ergab:

Tabelle 4 Pipettierschema für den Algentest, modifiziert nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten^[4]

Jede Verdünnungsstufe und der Kontrollansatz wurden in 3 Parallelansätzen untersucht. Die ent­sprechenden Mengen an Verdünnungswasser (deionisiertes Wasser) wurden in Erlenmeyerkolben mit einem Nennvolumen von 300 ml gefüllt und 20 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurden Inoculum, die 10-fach konzentrierte Nährlösung und die Probe zugege­ben.

3.7.1.7 Messung

Bei allen Test- und Kontrollansätzen wurden zu Beginn des Tests die Eigenfluoreszenzen be­stimmt. Nach 72 h Inkubationszeit wurde die in-vivo -Chlorophyll-Fluoreszenz gemessen.

Die Messung der Fluoreszenz erfolgte mit einem Filterphotometer (Typ 1101 M, Fa. Eppendorf, Hamburg) gegen die unbewachsene 10-fach konzentrierte Nährlösung (T = 0); die Kalibrierung der Transmissionsskala für T = 1 erfolgte mit einer Algensuspension mit einer Zellzahl von etwa 107 Zellen /ml (Peter 1993).

Die Anregung erfolgte in einem Wellenlängenbereich zwischen 405 und 436 nm (Primärfilter HG 405 - 436 nm für Fluorimetrie, Fa. Eppendorf, Hamburg). Die Emissionsstrahlen der fluoreszie­renden Algenzellen wurden nach dem Durchtritt durch ein Sekundärfilter (Fa. Laser Optik Tech­nologie GmbH, Riedberg) in einem Photomultiplier aufgefangen.

Das vorgeschaltete Sekundär­filter ließ die Emissionsstrahlen der Wellenlänge l=682,5 nm mit einer Bandbreite von 9,2 nm durch. Aufgrund der geringen Empfindlichkeit des Photometers mußte die Fluoreszenzstrahlung bei Wellenlängen oberhalb von 650 nm verstärkt werden (Bedienungsanleitung Eppendorf-Fluoreszenzzusatz 1030, Fa. Eppendorf, Hamburg). Dies geschah durch die Einstellung des Stu­fenreglers auf Stufe II/12. Die Messung erfolgte in Halbmicroküvetten aus optischem Spezial­glas.

3.7.1.8 Auswertung und Gültigkeitskriterium

Für jede Verdünnungsstufe wurde die Hemmwirkung auf die Biomasseproduktion, ausgedrückt als Minderung der in-vivo -Chlorophyll-Fluoreszenz, gesondert berechnet. Dies erfolgte durch den Vergleich der Fluoreszenz des Testansatzes FG mit der des Kontrollansatzes FK nach folgender Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Als Ergebnis kann neben der prozentualen Hemmung der GA-Wert angegeben werden. Der GA-Wert ist der kleinste Wert der Verdünnungsstufe G des Testansatzes, in dem eine Hemmwirkung der Biomasseproduktion von weniger als 20 % gemessen wird, sofern bei höheren Verdünnungs­stufen keine Hemmung von mehr als 20 % festgestellt wird (DEV 1991 a).

Wachstumsförderungen im Algentest wurden mit einem negativen Vorzeichen gekennzeichnet.

3.7.1.9 Gültigkeitskriterium

Der Test wird nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a) als gültig angesehen, wenn sich die in - vivo -Chlorophyll-Fluoreszenz im Kontrollansatz innerhalb von 72 h um mindestens das 30-fache er­höht hat.

3.7.2 Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 30 (DEV 1989 a)

3.7.2.1 Testorganismus und Grundlage des Verfahrens

Als Testorganismus dient Daphnia magna STRAUS. Als Vertreter des Zooplanktons stellt er das Bindeglied zwischen den Destruenten (Bakterien und Pilzen) und Primärproduzenten (Algen) ei­nerseits und den Konsumenten höherer Ordnung (Fische) andererseits in aquatischen Nahrungs­ketten dar.

Als Maß für die summarische Wirkung von (Ab-)Wasserinhaltsstoffen dient die Angabe der Ver­dünnungsstufe GD, bei der nach einer Expositionszeit von 24 h weniger als 5 % der Daphnien schwimmunfähig geworden sind. Als Kontrolle dient künstliches Süßwasser (Abschnitt 3.1.2.1).

3.7.2.2 Anzucht und Stammhaltung

Für die Durchführung der Daphnientests wurde eine aus der Zucht des SIGU Saarbrücken her­vorgehende eigene Zucht angelegt.

Die Tiere wurden in quaderförmigen Kunststoffschüsseln mit einem Volumen von 5 l (Typ 1230, Fa. Ehret GmbH, Emmendingen) gehalten. Die Schüsseln waren etwa zur Hälfte mit Nährlösung gefüllt waren. Die Individuenzahl wurde so bemessen, daß sich in jeder Schüssel ungefähr 200 Tiere befanden.

Die Inkubation erfolgte in einem und beleuchteten Thermoschrank (Typ KBK/OL 9, Fa. Ehret GmbH, Emmendingen) bei 20 °C. Es wurde ein Hell-Dunkel-Rhythmus eingestellt, bei dem auf 13 h Licht eine Dunkelheitsperiode von 11 h folgte.

Die Daphnien wurden alle 2-3 Tage mit einer Grünalgensuspension aus Scenedesmus subspicatus -Zellen gefüttert. Die nicht für Tests benutzten Jungtiere wurden abgesammelt und zur Nach­zucht verwendet. 2 mal pro Woche wurden die Tiere in frisches Zuchtwasser umgesetzt. Die Zucht der Futteralgen für die Daphnien erfolgte auf einem Horizontalschüttler (Typ 3020, Ge­sellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) bei 80 Upm in 6 Fernbachkolben. Diese wurden mittels einer Aquarienpumpe über 3 zwischengeschaltete Waschflaschen belüftet. Die Zucht­lösungen für die Algen wurden gemäß DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a) angesetzt.

3.7.2.3 Probenvorbereitung

Die Proben wurden zunächst kräftig geschüttelt, und der pH-Wert wurde mit 1 M NaOH oder 1 M HCl auf 7,0 ± 0,2 eingestellt.

3.7.2.4 Gewinnung geeigneter Testtiere

Da zum Test nur Tiere mit einem Alter zwischen 2 h und 26 h verwendet werden dürfen, muß­ten einen Tag vor Testbeginn die Jungtiere aus einer Zuchtschüssel mit einer Pipette abge­sammelt werden. Am darauffolgenden Tag wurden erneut die vorhandenen Jungtiere abgetrennt. Diese Tiere waren nun höchstens 24 h alt.

Nach dem Absammeln sollten sich die Testtiere noch etwa 2- 3 Stunden erholen können, bevor sie zum Test eingesetzt wurden. Am zweckmäßigsten war es, die Tiere morgens auszusortieren und den Test am Nachmittag zu beginnen.

3.7.2.5 Testdurchführung

Von den Proben wurden Verdünnungsstufen zwischen 1:2 und 1:64 in Kristallisierschälchen in jeweils vierfachem Ansatz hergestellt. Zusätzlich wurde die unverdünnte Probe getestet. Als Kontrolle diente ein Ansatz mit Verdünnungswasser (künstliches Süßwasser).

Tabelle 5 Pipettierschema für den Daphnientest nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.7.2.6 Auswertung

Nach 24 h wurde die Schwimmfähigkeit der Daphnien überprüft. Schwimmfähig waren solche Tiere, die nach Anticken des Kristallisierschälchens noch eine aktive Schwimmbewegung zeigten. Am Boden liegende oder sich nicht mehr bewegende Tiere galten als schwimmunfähig.

Als Ergebnis wurde bei Chemikalienlösungen der EC50-Wert angegeben; er kann sowohl rechne­risch über lineare Regression als auch zeichnerisch bestimmt werden. Bei Realproben wurde der GD-Wert angegeben; der GD-Wert ist ein Maß für die Giftigkeit der Probe gegenüber Daphnien und entspricht der Verdünnungsstufe, bei der 95-100 % der Tiere schwimmfähig sind.

3.7.2.7 Gültigkeitskriterien

Der Test ist nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a) gültig, wenn die natürliche Mortalität der Daphnien kleiner als 10 % ist. Der EC50-Wert der Referenzchemikalie Kaliumdichromat muß zwischen 0,9 und 1,9 mg/l liegen, da die Empfindlichkeit verschiedener Klone aufgrund unter­schiedlicher Laborbedingungen schwankt.

3.7.3 Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b)

3.7.3.1 Testorganismus und Grundlage des Verfahrens

Die in den Leuchtbakterientests verwendeten Leuchtbakterien sind vom Stamm NRRL B-11177 (Vibrio fischeri) und wurden in den Testkits LCK 482 (für Test nach DIN 38 412 Teil 34) und LCK 486 (für 24 h-Test) von der Firma Dr. Lange GmbH Düsseldorf bezogen.

3.7.3.2 Probenvorbereitung

Da im Test marine Bakterien eingesetzt werden, müssen die Proben auf 2 % NaCl-Gehalt aufge­salzen werden, um isotonische Bedingungen zu gewährleisten. Nach Sellner und Dau (1992) entfällt eine Aufsalzung der Proben bei elektrischen Leitfähigkeiten von mehr als 15 mS/cm. Der pH-Wert der Proben ist auf 7,0 ± 0,2 einzustellen. Dazu wurde 1 M HCl oder 1 M NaOH ver­wendet.

3.7.3.3 Testdurchführung

Die Proben wurden in Schritten von 1:1 und 1:1,5 einer geometrischen Reihe folgend in Rund­küvetten in einem Thermoblock (Typ LUMIStherm LTG053, Fa. Dr. Lange GmbH, Düsseldorf) ver­dünnt. Als Verdünnungslösung diente 2 %ige NaCl-Lösung (pH 7,0), die im Test auch als Kontrollansatz eingesetzt wurde.

Die flüssiggetrockneten Leuchtbakterien wurden in der mitgelieferten Lösung nach Anleitung re­konstituiert und nach einer Angleichzeit von mindestens 15 min bei 15 °C in einem Thermoblock (Typ LUMIStherm LTG 053, Fa. Dr. Lange GmbH, Düsseldorf) für den Test verwendet. Da­nach wurden jeweils 0,5 ml der Suspension mit den rekonstituierten Bakterien in die ent­sprechenden Küvetten im Luminometer (Typ M 500 Toxicity Analyzer, Fa. Azur Environmental, Carlsbad, USA) pipettiert, worauf sich erneut eine Angleichzeit von 15 Minuten anschloß. Die Test­ansätze setzten sich folgendermaßen zusammen:

Tabelle 6 Zusammensetzung der Testansätze für den Leuchtbakterientest nach DIN 38 412 Teil 34 (DEV 1991 b)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zu Beginn des Tests wurden die Leuchtintensitäten aller Ansätze mit Hilfe des Luminometers bestimmt. Danach wurden jeweils 0,5 ml der Testansätze in zwei Parallelen zu den Leucht­bak­teriensuspensionen pipettiert.

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^[1] ehemals Microbics Corporation

^[2] Die nach DIN 38 412 Teil 33 (DEV 1991 a) angegebene Menge von 3 g NaHCO3 wurde nach mehreren Optimie­rungsversuchen auf 6 g NaHCO3 verdoppelt.

^[3] als Summe bestimmt

^[4] Unter Berücksichtigung der Volumina für Nährlösung und Inoculum beträgt die kleinste Verdünnungsstufe 1:1,67.