Die Alzheimer Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung der westlichen Welt, die Hauptursache von Demenz und daher mit enormen Kosten für das Gesundheitssystem verbunden. Dem Amyloid Precursor Protein (APP) kommt dabei eine Schlüsselrolle zu: Über Prozessierung durch BACE1 und anschließend durch die γ-Sekretase werden daraus Aβ Peptide gebildet, die in den für die Erkrankung typischen senilen Plaques akkumulieren. Dafür werden sowohl APP als auch BACE1 von der Zelloberfläche über Clathrin-vermittelte Endocytose (CVE) aufgenommen und zur amyloidogenen APP-Prozessierung in intrazelluläre Kompartimente transportiert.
Kürzlich konnten in mehreren genomweiten Assoziationsstudien SNPs im PICALM-Locus mit der AD signifikant assoziiert werden. PICALM ist homolog zum Clathrin-Adaptorprotein AP180 und wohl am Prozess der CVE beteiligt, da diese durch PICALM-Überexpression gehemmt wird. Welche Rolle PICALM hierbei zukommt ist noch nicht vollständig geklärt.
Um erste Einsichten in den Zusammenhang zwischen der AD und PICALM zu erlangen wurde in dieser Arbeit die Interaktion zwischen PICALM und APP auf Proteinebene untersucht. Dazu wurde über Klonierung zunächst ein Plasmid-Expressionsvektor etabliert, mit dem sich PICALM in HEK- und N2A-Zellen überexprimieren ließ. In Übereinstimmung mit der Literatur zeigte sich per Fluoreszenzmikroskopie eine hauptsächlich perinukleäre Häufung von überexprimiertem PICALM. Es konnte gezeigt werden, dass zunehmende Mengen des Proteins zu einer stetigen Abnahme der endogenen APP-Proteinlevel in HEK-Zellen führen, was umgekehrt jedoch nicht der Fall war. Kolokalisationsstudien von PICALM und APP lassen darauf schließen, dass beide Proteine eher nicht direkt miteinander interagieren.
Schließlich ist dies die erste Studie, in der ein direkter Zusammenhang zwischen PICALM und APP gezeigt werden konnte. Welche genauen molekularen Mechanismen diesem zugrunde liegen bleibt jedoch noch zu klären. Möglicherweise könnte überexprimiertes PICALM durch Hemmung der CVE die APP-Internalisierung hemmen, damit dessen nicht-amyloidogenen Prozessierungsweg fördern und so letztlich zu einer geringeren Produktion und Freisetzung von Aβ führen.
Inhaltsverzeichnis
- Inhaltsverzeichnis
- Datenblatt.
- Abkürzungsverzeichnis
- 1 Einleitung.
- 1.1 Alzheimer Erkrankung.….…………….….…...
- 1.1.1 Epidemiologie und Pathologie..
- 1.1.2 Genetische Risikofaktoren
- 1.1.3 Histopathologie und Amyloid-Hypothese.
- 1.2 Amyloid Precursor Protein...........
- 1.2.1 Prozessierung und intrazellulärer Transport von APP.
- 1.3 PICALM................
- 1.3.1 Expressionsmuster und zelluläre Lokalisation von PICALM.
- 1.3.2 Assoziation von PICALM mit AD.
- 1.4 Zielsetzung......
- 2 Material und Methoden
- 2.1 Material...............
- 2.1.1 Zelllinien..............
- 2.1.2 Bakterienstämme......
- 2.1.3 Kulturmedien
- 2.1.4 Antibiotika.
- 2.1.5 DNA-Vektoren.
- 2.1.6 Oligonukleotide
- 2.1.7 Labormaterialien und -chemikalien.
- 2.1.8 Puffer.
- 2.1.9 Kits..............
- 2.1.10 Antikörper............
- 2.1.11 DNA- und Proteinstandards............
- 2.1.12 Enzyme..........\li>
- 2.1.13 Geräte............
- 2.1.14 Software........…………..\li>
- 2.2 Methoden
- 2.2.1 Zellkulturmethoden..
- 2.2.2 Proteinmethoden .......
- 2.2.3 DNA-Methoden und Klonierung.
- 3 Ergebnisse.….………………………….
- 3.1 Klonierung und Überexpression von PICALM.
- 3.1.1 Expressionstest C-terminal getagter PICALM-Konstrukte.
- 3.1.2 Klonierung von PICALM.
- 3.1.3 Toxizitätsvergleich N- und C-terminal getagter Konstrukte..............
- 3.2 Interaktionstudien von PICALM mit APP.
- 3.2.1 Einfluss der PICALM Überexpression auf endogene APP-Level ...............
- 3.2.2 Einfluss der APP Überexpression auf endogene PICALM-Level..............
- 3.3 Fluoreszenzmikroskopie……………………….
- 3.3.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM.
- 3.3.2 Untersuchung möglicher Kolokalisation von PICALM und APP..\n..................
- 4 Diskussion..............
- 4.1 Verwendete Zelllinien
- 4.2 Klonierung und Überexpression von PICALM.
- 4.3 Interaktionstudien von PICALM mit APP
- 4.4 Fluoreszenzmikroskopie
- 4.4.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM..
- 4.4.2 Kolokalisationsstudien von PICALM und APP.......
- 5 Zusammenfassung ....
- Literaturverzeichnis
- Eidesstattliche Erklärung.
- Danksagung........
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Bachelorarbeit untersucht die Rolle des Phosphatidylinositol binding clathrin assembly proteins (PICALM) im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit. Ziel ist es, die Interaktion von PICALM mit dem Amyloid Precursor Protein (APP) aufzuklären und die Bedeutung dieser Interaktion für die Entstehung der Krankheit zu untersuchen.
- Klonierung und Überexpression von PICALM in Zellkultur
- Untersuchung der Interaktion zwischen PICALM und APP mittels verschiedener Methoden
- Analyse der zellulären Lokalisation von PICALM und dessen möglicher Kolokalisation mit APP
- Bedeutung der PICALM-APP-Interaktion für die Entstehung der Alzheimer-Krankheit
- Potenzial von PICALM als Zielmolekül für die Entwicklung neuer Therapieansätze
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung führt in die Thematik der Alzheimer-Krankheit ein und beschreibt die Rolle von APP sowie PICALM in diesem Kontext. Kapitel 2 beschreibt die verwendeten Materialien und Methoden. Kapitel 3 präsentiert die Ergebnisse der Klonierung und Überexpression von PICALM, die Interaktionstudien mit APP und die Ergebnisse der Fluoreszenzmikroskopie. Die Diskussion analysiert die gewonnenen Daten und setzt sie in den Kontext bestehender Forschungsergebnisse. Schließlich fasst die Zusammenfassung die wichtigsten Ergebnisse zusammen und gibt einen Ausblick auf zukünftige Forschungsrichtungen.
Schlüsselwörter
Alzheimer-Krankheit, Amyloid Precursor Protein (APP), Phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein (PICALM), Klonierung, Überexpression, Interaktion, Zellkultur, Fluoreszenzmikroskopie, Kolokalisation, Pathogenese, Therapieansätze.
- Citation du texte
- Simon Schwörer (Auteur), 2011, Klonierung des Phosphatidylinositol binding clathrin assembly proteins (PICALM) und Untersuchung der Interaktion mit dem Protein APP in Verbindung mit der Alzheimer Krankheit, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/190555
