Die Alzheimer Krankheit (AD) ist die häufigste neurodegenerative Erkrankung der westlichen Welt, die Hauptursache von Demenz und daher mit enormen Kosten für das Gesundheitssystem verbunden. Dem Amyloid Precursor Protein (APP) kommt dabei eine Schlüsselrolle zu: Über Prozessierung durch BACE1 und anschließend durch die γ-Sekretase werden daraus Aβ Peptide gebildet, die in den für die Erkrankung typischen senilen Plaques akkumulieren. Dafür werden sowohl APP als auch BACE1 von der Zelloberfläche über Clathrin-vermittelte Endocytose (CVE) aufgenommen und zur amyloidogenen APP-Prozessierung in intrazelluläre Kompartimente transportiert.
Kürzlich konnten in mehreren genomweiten Assoziationsstudien SNPs im PICALM-Locus mit der AD signifikant assoziiert werden. PICALM ist homolog zum Clathrin-Adaptorprotein AP180 und wohl am Prozess der CVE beteiligt, da diese durch PICALM-Überexpression gehemmt wird. Welche Rolle PICALM hierbei zukommt ist noch nicht vollständig geklärt.
Um erste Einsichten in den Zusammenhang zwischen der AD und PICALM zu erlangen wurde in dieser Arbeit die Interaktion zwischen PICALM und APP auf Proteinebene untersucht. Dazu wurde über Klonierung zunächst ein Plasmid-Expressionsvektor etabliert, mit dem sich PICALM in HEK- und N2A-Zellen überexprimieren ließ. In Übereinstimmung mit der Literatur zeigte sich per Fluoreszenzmikroskopie eine hauptsächlich perinukleäre Häufung von überexprimiertem PICALM. Es konnte gezeigt werden, dass zunehmende Mengen des Proteins zu einer stetigen Abnahme der endogenen APP-Proteinlevel in HEK-Zellen führen, was umgekehrt jedoch nicht der Fall war. Kolokalisationsstudien von PICALM und APP lassen darauf schließen, dass beide Proteine eher nicht direkt miteinander interagieren.
Schließlich ist dies die erste Studie, in der ein direkter Zusammenhang zwischen PICALM und APP gezeigt werden konnte. Welche genauen molekularen Mechanismen diesem zugrunde liegen bleibt jedoch noch zu klären. Möglicherweise könnte überexprimiertes PICALM durch Hemmung der CVE die APP-Internalisierung hemmen, damit dessen nicht-amyloidogenen Prozessierungsweg fördern und so letztlich zu einer geringeren Produktion und Freisetzung von Aβ führen.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Alzheimer Erkrankung
1.1.1 Epidemiologie und Pathologie
1.1.2 Genetische Risikofaktoren
1.1.3 Histopathologie und Amyloid-Hypothese
1.2 Amyloid Precursor Protein
1.2.1 Prozessierung und intrazellulärer Transport von APP
1.3 PICALM
1.3.1 Expressionsmuster und zelluläre Lokalisation von PICALM
1.3.2 Assoziation von PICALM mit AD
1.4 Zielsetzung
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Zelllinien
2.1.2 Bakterienstämme
2.1.3 Kulturmedien
2.1.4 Antibiotika
2.1.5 DNA-Vektoren
2.1.6 Oligonukleotide
2.1.7 Labormaterialien und –chemikalien
2.1.8 Puffer
2.1.9 Kits
2.1.10 Antikörper
2.1.11 DNA- und Proteinstandards
2.1.12 Enzyme
2.1.13 Geräte
2.1.14 Software
2.2 Methoden
2.2.1 Zellkulturmethoden
2.2.2 Proteinmethoden
2.2.3 DNA-Methoden und Klonierung
3 Ergebnisse
3.1 Klonierung und Überexpression von PICALM
3.1.1 Expressionstest C-terminal getagter PICALM-Konstrukte
3.1.2 Klonierung von PICALM
3.1.3 Toxizitätsvergleich N- und C-terminal getagter Konstrukte
3.2 Interaktionstudien von PICALM mit APP
3.2.1 Einfluss der PICALM Überexpression auf endogene APP-Level
3.2.2 Einfluss der APP Überexpression auf endogene PICALM-Level
3.3 Fluoreszenzmikroskopie
3.3.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM
3.3.2 Untersuchung möglicher Kolokalisation von PICALM und APP
4 Diskussion
4.1 Verwendete Zelllinien
4.2 Klonierung und Überexpression von PICALM
4.3 Interaktionstudien von PICALM mit APP
4.4 Fluoreszenzmikroskopie
4.4.1 Zelluläre Lokalisation von PICALM
4.4.2 Kolokalisationsstudien von PICALM und APP
5 Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Das primäre Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der molekularen Interaktion zwischen PICALM und dem Amyloid Precursor Protein (APP) im Kontext der Alzheimer-Krankheit. Die Forschungsarbeit geht dabei der Hypothese nach, ob die bei der Alzheimer-Erkrankung als genetischer Risikofaktor identifizierten PICALM-Varianten die APP-Prozessierung oder deren zellulären Transport beeinflussen.
- Klonierung und stabile Überexpression von PICALM in murinen und humanen Zelllinien
- Analyse des Einflusses von PICALM-Überexpression auf endogene APP-Level
- Untersuchung der zellulären Lokalisation von PICALM mittels Fluoreszenzmikroskopie
- Prüfung einer möglichen Kolokalisation von PICALM und APP in der Zelle
- Evaluierung der Zytotoxizität verschiedener PICALM-Konstrukte
Auszug aus dem Buch
3.2.1 Einfluss der PICALM Überexpression auf endogene APP-Level
Um einer mögliche Interaktion zwischen PICALM und APP nachzugehen wurde zunächst der Einfluss zunehmender Mengen an PICALM auf die endogenen APP-Level untersucht. Dafür wurden HEK-Zellen mit 1,0 μg bis 3,0 μg GFP-PICALM transfiziert, wobei die DNA-Mengen jeweils um 0,5 μg gesteigert wurden. Als Kontrolle wurden 1,0 μg GFP-myc verwendet. Die Zelllysate wurden im Western Blot aufgetragen (Abb. 10).
Über den anti-CALM- und anti-GFP-AK wurde zunächst die erfolgreiche Erstellung der Konzentrationsreihe von GFP-PICALM auch auf Proteinebene nachgewiesen (Abb. 10), was Voraussetzung dieses Experiments war. Speziell der anti-APP-AK, der den C-Terminus des Proteins erkennt, zeigt deutlich, dass die endogenen Level beider APP Isoformen (ca. 100 kDa und 120 kDa, dritte Isoform nicht unterscheidbar) mit zunehmenden Mengen GFP-PICALM abnehmen. Die Pixel-basierte Quantifizierung des Western Blots in Abbildung 11A verdeutlicht dies zusätzlich; hier ist auch eine Abnahme der APP-Menge bei bereits 1,0 μg GFP-PICALM gegenüber der Kontrolle in gleicher Konzentration zu erkennen. Dieses Ergebnis konnte so repliziert werden (N=2), auch von unabhängiger Seite.
Außerdem wurden vor der Zelllyse die Medien gesammelt und bei -20°C eingefroren, um später eventuell mögliche Veränderungen in der APP-Prozessierung über die sAPPα/β- bzw. Aβ-Konzentrationen im Überstand über einen ELISA-Assay bestimmen zu können.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Dieses Kapitel gibt einen Überblick über die Epidemiologie und Pathologie der Alzheimer-Krankheit, beschreibt die Amyloid-Hypothese, die Funktionen des Amyloid Precursor Proteins (APP) sowie die Rolle von PICALM als Clathrin-Adaptorprotein.
2 Material und Methoden: Hier werden die verwendeten Zelllinien (N2A, HEK), die molekularbiologischen Methoden zur Klonierung, Transfektion, Proteinanalytik (Western Blot, ICC) sowie die verwendeten Puffer, Antikörper und Geräte detailliert aufgelistet.
3 Ergebnisse: Die Ergebnisse präsentieren die erfolgreiche Klonierung von PICALM-Konstrukten, zeigen, dass eine Überexpression von PICALM zu einer Reduktion endogener APP-Level führt, und untersuchen die zelluläre Lokalisation mittels Fluoreszenzmikroskopie.
4 Diskussion: In diesem Teil werden die Resultate kritisch bewertet, wobei insbesondere der einseitige Effekt von PICALM auf APP und die möglichen Auswirkungen auf den endocytotischen Transport des Proteins im Kontext der Alzheimer-Pathogenese diskutiert werden.
5 Zusammenfassung: Das letzte Kapitel fasst die zentralen Befunde der Arbeit zusammen, wonach eine direkte funktionelle Verbindung zwischen PICALM und APP besteht, die wahrscheinlich über eine Beeinflussung der Clathrin-vermittelten Endocytose (CVE) vermittelt wird.
Schlüsselwörter
Alzheimer-Krankheit, PICALM, APP, Amyloid-beta, Clathrin-vermittelte Endocytose, Klonierung, Überexpression, Western Blot, Fluoreszenzmikroskopie, Zellkultur, HEK-293, N2A, Signaltransduktion, Neurodegeneration, Transportmechanismen.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Bachelorarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht die molekulare Verbindung zwischen dem Protein PICALM und dem Amyloid Precursor Protein (APP) im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit.
Welches sind die zentralen Themenfelder der Arbeit?
Die Arbeit fokussiert sich auf die Alzheimer-Pathologie, die Clathrin-vermittelte Endocytose (CVE), die molekularbiologische Klonierung von Proteinkonstrukten sowie die Analyse von Proteininteraktionen in Zellmodellen.
Was ist das primäre Ziel der Forschungsarbeit?
Das Hauptziel ist zu klären, ob PICALM die Menge oder den Transport von APP beeinflusst, da beide Proteine mit der Entstehung von Alzheimer-Plaques assoziiert sind.
Welche wissenschaftlichen Methoden wurden verwendet?
Es wurden molekularbiologische Standardtechniken wie PCR, Klonierung und bakterielle Transformation, sowie zellbiologische Methoden wie die Calcium-Phosphat-Transfektion, Western Blot Analyse, BCA-Proteinkonzentrationsbestimmung und Fluoreszenzmikroskopie (ICC) angewandt.
Welche Inhalte werden im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die Klonierung der PICALM-cDNA, die anschließende Überexpression in N2A- und HEK-Zellen, sowie die Durchführung von Interaktionsstudien und mikroskopische Analysen zur Lokalisation der Proteine.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Wichtige Begriffe sind PICALM, APP, Alzheimer-Krankheit, Clathrin-vermittelte Endocytose, Proteininteraktion und Überexpression.
Welche Auswirkung hat die Überexpression von PICALM auf die APP-Level?
Die Arbeit zeigt, dass eine Erhöhung der PICALM-Konzentration in den Zellen zu einer stetigen Abnahme der endogenen APP-Proteinlevel führt.
Ist der Effekt der PICALM-APP-Interaktion wechselseitig?
Nein, die Ergebnisse zeigen, dass steigende Mengen von APP keinen signifikanten Einfluss auf die endogenen PICALM-Level haben, der Effekt ist also einseitig.
Sind PICALM und APP direkt miteinander interagierende Partner?
Die Kolokalisationsstudien deuten darauf hin, dass die Proteine zwar teilweise in ähnlichen Zellbereichen vorliegen, eine direkte, starke Bindung jedoch eher unwahrscheinlich ist; der Effekt wird vermutlich über andere Adaptorproteine vermittelt.
- Citation du texte
- Simon Schwörer (Auteur), 2011, Klonierung des Phosphatidylinositol binding clathrin assembly proteins (PICALM) und Untersuchung der Interaktion mit dem Protein APP in Verbindung mit der Alzheimer Krankheit, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/190555
