Durch die Entstehung immer neuer Resistenzen und Bildung multiresistenter Stämme von Bakterien gegen herkömmliche Antibiotika, hat die Bedeutung der Erforschung und Evaluierung von Antibiotikawirkorten und –Mechanismen zur Entwicklung neuer Antibiotika zugenommen. Dazu können antibakteriell wirkende Stoffe auf ihre molekularen Funktionen hin untersucht werden, um z.B. Verbesserungen zu erreichen, aber auch potentielle Wirkorte für die Entwicklung neuer Antibiotika lokalisiert werden. Um diese molekularen Interaktionen untersuchen zu können, bedient man sich der modernen Proteomanlayse. Hierbei spielt die zweidimensionale, elektrophoretische Auftrennung von Proteinen (2D-Gelelektrophorese) eine große Rolle.
In diesem Praktikum wurden Carrier-Ionophoren verwendet: Ionomycin, ein Ionophor, der in Streptomyces conglobatus vorkommt und vor allem Ca2+ durch Membranen transportiert. Calcimycin, das mehrere zweiwertige Kationen (Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ >> Sr2+ > Ba2+) durch Zellmembranen transportieren kann und z.B. dafür sorgt, dass die Atmungskette entkoppelt wird. Und Nigericin, das H+, K+ und Pb2+ durch Zellmembranen befördern kann, aber meistens als H+-K+-Antiporter vorliegt. Ionophore werden, nicht nur als Antibiotikum, in vielen Bereichen der Forschung eingesetzt, sondern kommen auch in der industriellen Viehzucht zum Einsatz. Des Weiteren sollte während des Praktikums eine Konditional-Mutante für essentielle Zellteilungsgene von B. Subtilis erstellt werden, um mit anschließender Proteomanalyse mögliche Wirkorte für Antibiotika zu evaluieren.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Medien und Antibiotika
2.1.2 Puffer und Lösungen
2.1.2.1 Puffer und Lösungen zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
2.1.2.2 Puffer und Lösungen zur Probenaufbereitung
2.2 Methoden
2.2.1 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
2.2.2 Transformation
2.2.3 Bakterienanzucht
2.2.4 Bestimmung des Bakterienwachstums
2.2.5 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
2.2.6 Durchführung von Wachstumstests
3. Ergebnisse
3.1 Bestimmung der MHK verschiedener Antibiotika
3.2 Wachstumstest
3.2.1 Wachstumstest mit Ionomycin:
3.2.2 Wachstumstest mit Calcimycin:
3.2.3 Wachstumstest mit Nigericin:
3.3 Erstellung einer B. subtilis-Konditionalmutante
3.3.1 Isolation chromosomaler DNA von B. subtilis und B. megaterium
3.3.2 Vermehrung und Isolation des Klonierungsvektors pDG1731
4. Diskussion
4.1 Bestimmung der MHK und Wachstumstests
4.2 Erstellung einer B. subtilis-Konditionalmutante
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel der Arbeit besteht darin, optimale Bedingungen für die proteomanalytische Auswertung von Antibiotikastress bei B. subtilis zu etablieren und die Grundlagen für die Erstellung einer Konditionalmutante für essentielle Zellteilungsgene zu schaffen.
- Optimierung von Wachstumstests unter Einsatz verschiedener Ionophore (Ionomycin, Calcimycin, Nigericin).
- Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) für die untersuchten Antibiotika.
- Entwicklung einer Strategie zur Erstellung einer B. subtilis-Konditionalmutante mittels des Xylose-Operons.
- Isolation chromosomaler DNA sowie Vermehrung spezifischer Klonierungsvektoren (pDG1731).
- Evaluierung von Methoden zur Stressinduktion als Vorbereitung für vergleichende 2D-Gelelektrophorese.
Auszug aus dem Buch
2.2.6 Durchführung von Wachstumstests
Bei den durchgeführten Wachstumstests wurden mehrere Kölbchen mit 10ml Minimalmedium mit einer ÜN-Kultur von B. subtilis angeimpft (Anfangs-OD500 ca. 0,05) und im Wasserbadschüttler bis zu einer OD500 von 0,3 – 0,4 angezogen. Im Anschluss wurden die Kölbchen mit einem Vielfachen der MHK des jeweiligen Antibiotikums versetzt. Die Wachstumskurven wurden durchgehend bis zur stationären Phase alle 30 Minuten aufgenommen. Das optimale Vielfache der MHK war erreicht, wenn bei der Wachstumskurve der Probe mit Antibiotikum im Vergleich zur Kontroll-Probe eine kurzfristige Eindämmung des Wachstums zu erkennen war, und sich die Zellen bis zur stationären Phase wieder in der Zellzahl an die Kontroll-Probe angeglichen hatten (Siehe Abb.2).
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Erläutert die Bedeutung der Proteomanalyse mittels 2D-Gelelektrophorese zur Erforschung neuer Antibiotikawirkorte angesichts zunehmender Resistenzen.
2. Material und Methoden: Beschreibt die verwendeten Medien, Puffer und experimentellen Verfahren wie Transformation, Bakterienanzucht und die Durchführung von Wachstumstests.
3. Ergebnisse: Präsentiert die ermittelten MHK-Werte der drei Antibiotika sowie die Ergebnisse der Wachstumstests und die Fortschritte bei der Erstellung der Konditionalmutante.
4. Diskussion: Reflektiert die methodische Durchführung der Versuche, diskutiert Herausforderungen beim Zellaufschluss von B. subtilis und fasst die erzielten Teilziele zusammen.
Schlüsselwörter
B. subtilis, Antibiotika, Ionophore, Proteomanalyse, 2D-Gelelektrophorese, Konditionalmutante, Zellteilung, Xylose-Operon, minimale Hemmkonzentration, MHK, Wachstumstest, pDG1731, Transformation, Stressantwort, Genregulation.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung der Stressantwort von B. subtilis gegenüber membrananaktiven Antibiotika und der methodischen Etablierung zur Generierung konditionaler Mutanten für essentielle Zellteilungsgene.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die Arbeit fokussiert auf mikrobiologische Wachstumsstudien, die Bestimmung von Antibiotika-Hemmkonzentrationen sowie molekularbiologische Techniken zur genetischen Modifikation von Bakterien.
Was ist das primäre Ziel der Studie?
Das Ziel ist die Optimierung von Versuchsbedingungen für die anschließende Proteomanalyse sowie die Vorbereitung einer Mutante, bei der essentielle Gene kontrolliert an- oder abgeschaltet werden können.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?
Es kommen Verfahren wie die 2D-Gelelektrophorese, photometrische Wachstumsbestimmung, DNA-Isolation, Vektorklonierung und die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration zum Einsatz.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die detaillierte Beschreibung der Labormethoden, die Dokumentation der Wachstumstests mit Ionomycin, Calcimycin und Nigericin sowie die Dokumentation der molekularen Arbeiten zur Konstruktion der Konditionalmutante.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind B. subtilis, Proteomanalyse, Antibiotika, Konditionalmutante, Xylose-Operon, MHK und 2D-Gelelektrophorese.
Warum ist der Aufschluss von B. subtilis für die Proteomanalyse eine besondere Herausforderung?
Da B. subtilis ein grampositives Bakterium mit einer stabilen Zellwand ist, gestaltet sich der Aufschluss schwieriger als bei anderen Bakterien, was spezielle Methoden wie die Lysozymbehandlung erfordert.
Wie genau lässt sich die Expression essentieller Gene in der geplanten Mutante steuern?
Durch die Integration des Xylose-Operons kann die Expression durch Xylose induziert und durch Glucose-Zugabe (Repression der Operator-Region) wieder abgeschaltet werden.
- Quote paper
- Jens Abrigata (Author), 2008, Wachstumsstudien mit membranaktiven Antibiotika in B. subtilis und Erstellung von Konditional-Mutanten mit essentiellen Genen der Zellteilung, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/190622
