Durch die Entstehung immer neuer Resistenzen und Bildung multiresistenter Stämme von Bakterien gegen herkömmliche Antibiotika, hat die Bedeutung der Erforschung und Evaluierung von Antibiotikawirkorten und –Mechanismen zur Entwicklung neuer Antibiotika zugenommen. Dazu können antibakteriell wirkende Stoffe auf ihre molekularen Funktionen hin untersucht werden, um z.B. Verbesserungen zu erreichen, aber auch potentielle Wirkorte für die Entwicklung neuer Antibiotika lokalisiert werden. Um diese molekularen Interaktionen untersuchen zu können, bedient man sich der modernen Proteomanlayse. Hierbei spielt die zweidimensionale, elektrophoretische Auftrennung von Proteinen (2D-Gelelektrophorese) eine große Rolle.
In diesem Praktikum wurden Carrier-Ionophoren verwendet: Ionomycin, ein Ionophor, der in Streptomyces conglobatus vorkommt und vor allem Ca2+ durch Membranen transportiert. Calcimycin, das mehrere zweiwertige Kationen (Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ >> Sr2+ > Ba2+) durch Zellmembranen transportieren kann und z.B. dafür sorgt, dass die Atmungskette entkoppelt wird. Und Nigericin, das H+, K+ und Pb2+ durch Zellmembranen befördern kann, aber meistens als H+-K+-Antiporter vorliegt. Ionophore werden, nicht nur als Antibiotikum, in vielen Bereichen der Forschung eingesetzt, sondern kommen auch in der industriellen Viehzucht zum Einsatz. Des Weiteren sollte während des Praktikums eine Konditional-Mutante für essentielle Zellteilungsgene von B. Subtilis erstellt werden, um mit anschließender Proteomanalyse mögliche Wirkorte für Antibiotika zu evaluieren.
Inhaltsverzeichnis
- 1. Einleitung
- 2. Material und Methoden
- 2.1 Material
- 2.1.1 Medien und Antibiotika
- 2.1.2 Puffer und Lösungen
- 2.1.2.1 Puffer und Lösungen zur Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
- 2.1.2.2 Puffer und Lösungen zur Probenaufbereitung
- 2.2 Methoden
- 2.2.1 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
- 2.2.2 Transformation
- 2.2.3 Bakterienanzucht
- 2.2.4 Bestimmung des Bakterienwachstums
- 2.2.5 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
- 2.2.6 Durchführung von Wachstumstests
- 2.1 Material
- 3. Ergebnisse
- 3.1 Bestimmung der MHK verschiedener Antibiotika
- 3.2 Wachstumstest
- 3.2.1 Wachstumstest mit Ionomycin
- 3.2.2 Wachstumstest mit Calcimycin
- 3.2.3 Wachstumstest mit Nigericin
- 3.3 Erstellung einer B. subtilis-Konditionalmutante
- 3.3.1 Isolation chromosomaler DNA von B. subtilis und B. megaterium
- 3.3.2 Vermehrung und Isolation des Klonierungsvektors pDG1731
- 4. Diskussion
- 4.1 Bestimmung der MHK und Wachstumstests
- 4.2 Erstellung einer B. subtilis-Konditionalmutante
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Das Praktikum zielt darauf ab, vorbereitende Versuche für anschließende 2D-Gelektrophoretische-Auswertungen durchzuführen. Dabei soll die Stressantwort von B. subtilis auf Proteinebene durch Einsatz von Antibiotika induziert werden. Die Untersuchung fokussiert sich auf die Wirkungsweise von Ionophoren, einer Klasse von Antibiotika, die die Membranpermeabilität für Ionen verändern. Die Ergebnisse sollen die Auswahl einer optimalen Antibiotikakonzentration für die Proteomananalyse mit 2D-Gelektrophorese ermöglichen.
- Wachstumstests mit B. subtilis unter Verwendung von Ionophoren
- Induktion einer Stressantwort auf Proteinebene
- Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) verschiedener Antibiotika
- Erstellung einer Konditional-Mutante für essentielle Zellteilungsgene von B. subtilis
- Evaluierung potentieller Wirkorte für Antibiotika
Zusammenfassung der Kapitel
- Kapitel 1: Einleitung: Die Einleitung erläutert die Bedeutung der Forschung zu neuen Antibiotika aufgrund der zunehmenden Resistenzentwicklung bei Bakterien. Sie beschreibt die Rolle der Proteomanalyse, insbesondere der 2D-Gelektrophorese, bei der Untersuchung von Antibiotikawirkorten und -mechanismen.
- Kapitel 2: Material und Methoden: Dieses Kapitel listet die verwendeten Materialien, einschließlich Medien, Puffer, Lösungen und Antibiotika, auf. Außerdem werden die Methoden beschrieben, die für die Herstellung kompetenter E. coli-Zellen, Transformation, Bakterienanzucht, Bestimmung des Bakterienwachstums und die Durchführung von Wachstumstests verwendet wurden.
- Kapitel 3: Ergebnisse: Dieser Abschnitt präsentiert die Ergebnisse der durchgeführten Experimente. Er umfasst die Bestimmung der MHK verschiedener Antibiotika sowie die Ergebnisse der Wachstumstests mit den Ionophoren Ionomycin, Calcimycin und Nigericin. Außerdem werden die Schritte zur Erstellung einer Konditional-Mutante für essentielle Zellteilungsgene von B. subtilis beschrieben.
- Kapitel 4: Diskussion: Die Diskussion interpretiert die Ergebnisse der Experimente und beleuchtet die Bedeutung der gefundenen Daten für die weitere Forschung. Sie behandelt sowohl die Ergebnisse der MHK-Bestimmung und Wachstumstests als auch die Erstellung der Konditional-Mutante im Hinblick auf ihre Relevanz für die zukünftige Entwicklung neuer Antibiotika.
Schlüsselwörter
Die wichtigsten Schlüsselwörter des Textes sind: Antibiotika, Resistenzentwicklung, Proteomanalyse, 2D-Gelektrophorese, Ionophore, Membranpermeabilität, Wachstumstests, minimale Hemmkonzentration (MHK), Konditional-Mutante, essentielle Zellteilungsgene, B. subtilis.
- Citar trabajo
- Jens Abrigata (Autor), 2008, Wachstumsstudien mit membranaktiven Antibiotika in B. subtilis und Erstellung von Konditional-Mutanten mit essentiellen Genen der Zellteilung, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/190622
