Die Arbeit zeigt auf, dass Calcineurin sowohl am Wachstum, Differenzierung und Entwicklung des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum beteiligt ist. Die RNAi gesilencten Mutanten zeigten eine deutlich erhöhte Sensitivität gegenüber chemischen, ionischen und osmotischen Stress, sowohl im vegetativen als auch sozialen Zyklus. Eine mögliche Beteiligung von Calcineurin Untereinheiten an der Stressantwort der Zelle ist möglich.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1 Dictyostelium discoideum, ein Modellorganismus
1.2 Die Lebenszyklen von Dictyostelium discoideum
1.3 Äußere Faktoren, welche die Entwicklung von D. discoideum beeinflussen
1.4 Calcineurin
1.5 Calcineurin in Dictyostelium discoideum
1.6 Ziele dieser Arbeit
2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien
2.1.2 Geräte und Materialien
2.1.3 Antibiotika
2.1.4 Materialien der Molekularbiologie
2.1.5 Zelllinien
2.1.6 Plasmide und Konstrukte
2.1.7 Oligonukleotide ('Primer')
2.1.8 Medien und Puffer
2.1.9 Puffer und Gele
2.2 Methoden
2.2.1 Zellbiologische Methoden
2.2.2 Molekularbiologische Methoden
3. Ergebnisse
3.1 Calcineurin-Expression der RNAi gesilencten CNA und CNB Mutanten
3.2 Unter-Agarose-Chemotaxis Assay auf Folsäure
3.3 Differenzierung im Monolayer-Assay
3.4 Wachstum von CNA- und CNB Mutanten im Vergleich zum Wildtyp unter Einfluss von Lithiumchlorid
3.5 Entwicklung und Differenzierung von Calcineurin Mutanten auf SP-Agarplatten unter ionischem, osmotischen und chemischen Stress
3.6 Überprüfung der CNA und CNB-RNAi Mutanten
4. Diskussion
4.1 Unter-Agarose-Chemotaxis Assay auf Folsäure
4.2 Differenzierung im Monolayer-Assay
4.3 Wachstum von CNA- und CNB Mutanten im Vergleich zum Wildtyp unter Einfluss von Lithiumchlorid
4.4 Entwicklung und Differenzierung von Calcineurin Mutanten auf SP-Agarplatten unter ionischem, osmotischen und chemischen Stress
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht die funktionelle Rolle des Enzyms Calcineurin auf das Wachstum, die Zelldifferenzierung und die Entwicklung des Modellorganismus Dictyostelium discoideum. Im Fokus steht dabei die Analyse von RNAi-Silencing-Mutanten, um deren Reaktion auf verschiedene Stressfaktoren wie Lithiumchlorid, ionischen und osmotischen Stress sowie Coffein im Vergleich zum Wildtyp zu evaluieren und die zugrunde liegenden Signalwege besser zu verstehen.
- Charakterisierung von Calcineurin-RNAi-Mutanten in Dictyostelium discoideum
- Analyse der Chemotaxis unter Lithiumeinfluss
- Untersuchung der Zelldifferenzierung mittels Monolayer-Assay
- Evaluation des Wachstumsverhaltens und der Stressantwort auf osmotische und chemische Stimuli
Auszug aus dem Buch
1.1 Dictyostelium discoideum, ein Modellorganismus
Der eukaryotische Organismus Dictyostelium discoideum wurde zuerst 1935 von Kenneth Bryan Raper als auf verrottendem Pflanzenmaterial des Waldbodens lebende neue Schleimpilzart entdeckt und beschrieben. Zelluläre Schleimpilze waren allerdings bereits seit 1869 bekannt, als Brefeld die erste Art entdeckte (Bonner 1944). Der kleine Organismus (10-20μm) wird heute auch als soziale Amöbe bezeichnet, da er zwar hauptsächlich als unabhängige, bewegliche, einzelne amöboide Zelle lebt, aber sich unter Hunger-Bedingungen mit anderen Zellen seiner Art zusammen schließt (Annesley and Fisher 2009, Schaap 2011(a)). Er gehört zur Supergruppe der Amoebozoa und darin zur Gruppe der Dictyostelia, welche mittlerweile ca. 120 Arten umfassen. Diese werden in vier Hauptgruppen unterteilt, wobei Dictyostelium discoideum zu Gruppe 4 zählt (Schaap et al. 2006) auch wenn die genaue Einteilung in monophyletische Gruppen umstritten ist (Romeralo et al. 2009).
Das Verbreitungsgebiet der Dictyostelia reicht von arktischen Erdboden-Habitaten bis in tropische Gebiete, dabei werden auch Wüsten bewohnt (Schaap 2011(a)). In hoher Konzentration sind sie auf Laubstreu zu finden wo ihre Beute, andere Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefen, den Zersetzungsprozess von Pflanzenmaterial betreiben. Diese werden mittels Phagozytose inkorporiert und lysiert.
Dicytostelium discoideum hat ein haploides Genom, welches ca. 34 Megabasenpaare groß und auf sechs Chromosomen verteilt ist (Eichinger et al. 2005). Viele Gene des Organismus sind homolog zu denen höherer Eukaryoten. Er enthält sowohl Gene der Metazoa, als auch der Pilze und Amöben, was es somit ermöglicht die Dictyostelia als Bindeglied zu den Urlebewesen zu betrachten (Eichinger et al. 2005; Annesley and Fisher 2009).
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Dieses Kapitel stellt Dictyostelium discoideum als Modellorganismus vor, beschreibt seinen Lebenszyklus, die Bedeutung von Signalmolekülen wie cAMP und DIF-1 sowie die spezifische Rolle von Calcineurin.
2. Material und Methoden: Hier werden die verwendeten Chemikalien, Geräte, Zelllinien, Plasmide sowie die detaillierten Protokolle für die biochemischen und molekularbiologischen Experimente wie Transformation, Proteinextraktion und diverse Assays aufgeführt.
3. Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert die Daten zu Calcineurin-Expression, Chemotaxis-Versuchen, Monolayer-Assays zur Zelldifferenzierung und den Einfluss verschiedener Stressfaktoren auf Wachstum und Morphologie.
4. Diskussion: Die Ergebnisse werden interpretiert und in den Kontext bestehender wissenschaftlicher Literatur eingeordnet, wobei insbesondere auf die Mechanismen der Lithiumresistenz und die Rolle von Calcineurin bei der Stressantwort eingegangen wird.
Schlüsselwörter
Dictyostelium discoideum, Calcineurin, RNAi-Silencing, Zelldifferenzierung, Chemotaxis, Lithiumchlorid, Stressantwort, Signaltransduktion, cAMP, DIF-1, Stielzellen, Monolayer-Assay, Ionenhomöostase, Proteinphosphatase, Zellwachstum
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Diplomarbeit befasst sich mit der funktionalen Charakterisierung von Calcineurin-Mutanten im Modellorganismus Dictyostelium discoideum, um deren Einfluss auf Wachstum, Differenzierung und die Reaktion auf Stressfaktoren zu bestimmen.
Was sind die zentralen Themenfelder der Arbeit?
Die Arbeit fokussiert sich auf Zellbiologie, Signaltransduktion, Entwicklungsbiologie und die molekulare Stressantwort bei sozialen Amöben.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Ziel ist es, durch den Vergleich von RNAi-gesilencten Mutanten mit dem Wildtypstamm AX2 zu verstehen, wie Calcineurin die Entwicklung und Differenzierung des Organismus unter Stressbedingungen steuert.
Welche wissenschaftlichen Methoden wurden verwendet?
Zur Anwendung kamen molekularbiologische Methoden wie die Transformation von E. coli und D. discoideum, Plasmidisolierung, Western-Blot-Analysen zur Expressionskontrolle sowie zellbiologische Verfahren wie der Monolayer-Assay und Unter-Agarose-Chemotaxis-Assays.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Im Hauptteil werden experimentelle Daten zu Wachstumsraten unter Lithiumeinfluss, die Effizienz der Zelldifferenzierung in Stielzellen sowie die morphologische Entwicklung auf Agarplatten unter diversen chemischen Stressoren präsentiert.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind insbesondere Calcineurin, Dictyostelium discoideum, RNAi-Silencing, Zelldifferenzierung, Chemotaxis und Stressantwort.
Zeigen die Calcineurin-Mutanten eine veränderte Lithiumresistenz?
Ja, die Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine leicht veränderte Sensitivität gegenüber Lithiumchlorid, wobei sich die CNA- und CNB-RNAi-Mutanten in ihrer Wachstumsreaktion teilweise unterschiedlich zum Wildtyp verhielten.
Welchen Einfluss hat Coffein auf die Entwicklung der Zellen?
Die Coffein-Behandlung führt zu einer Verzögerung der Entwicklung, der Bildung kleinerer Aggregate sowie einer desorganisierten Kulmination und instabilen Fruchtkörpern.
Wie wirkt sich Calcineurin auf die Stielzellbildung aus?
Es konnte gezeigt werden, dass der Anteil der als Stielzellen identifizierten Zellen bei den untersuchten Calcineurin-RNAi-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp abweicht, was auf eine Beteiligung des Proteins an diesen Differenzierungsprozessen hindeutet.
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- Sebastian Schubert (Author), 2011, Funktionelle Charakterisierung von Calcineurin-Mutanten in Dictyostelium discoideum, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/190752
