Funktionelle Charakterisierung von Calcineurin-Mutanten in Dictyostelium discoideum

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung
1.1 Dictyostelium discoideum, ein Modellorganismus
1.2 Die Lebenszyklen von Dictyostelium discoid
1.3 Äußere Faktoren, welche die Entwicklung von D. discoideum beeinflussen
1.4 Calcineurin
1.5 Calcineurin in Dictyostelium discoideum.
1.6 Ziele dieser Arbeit

2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien
2.1.2 Geräte und Materiali
2.1.3 Antibiotika
2.1.4 Materialien der Molekularbiologie
2.1.5 Zelllinien
2.1.6 Plasmide und Konstrukte
2.1.7 Oligonukleotide (' Primer ')
2.1.8 Medien und Puffe
2.1.9 Puffer und Gel
2.2 Methoden
2.2.1 Zellbiologische Methode
2.2.2 Molekularbiologische Method

3. Ergebnisse
3.1 Calcineurin-Expression der RNAi gesilencten CNA und CNB Mutan
3.2 Unter-Agarose-Chemotaxis Assay auf Folsäur
3.3 Differenzierung im Monolayer-Assay
3.4 Wachstum von CNA- und CNB Mutanten im Vergleich zum Wildtyp unter Einfluss von Lithiumchlorid
3.5 Entwicklung und Differenzierung von Calcineurin Mutanten auf SP-Agarplatten unter ionischem, osmotischen und chemischen Stres
3.6 Überprüfung der CNA und CNB-RNAi Mutant

4. Diskussion
4.1 Unter-Agarose-Chemotaxis Assay auf Folsäu
4.2 Differenzierung im Monolayer-Ass
4.3 Wachstum von CNA- und CNB Mutanten im Vergleich zum Wildtyp unter Einfluss von Lithiumchlorid
4.4 Entwicklung und Differenzierung von Calcineurin Mutanten auf SP-Agarplatten unter ionischem, osmotischen und chemischen Stres

5. Quellenverzeichn
- Alphabetisch sortiert -

1 Einleitung

1.1 Dictyostelium discoideum, ein Modellorganismus

Der eukaryotische Organismus Dictyostelium discoideum wurde zuerst 1935 von Kenneth Bryan Raper als auf verrottendem Pflanzenmaterial des Waldbodens lebende neue Schleimpilzart entdeckt und beschrieben. Zelluläre Schleimpilze waren allerdings bereits seit 1869 bekannt, als Brefeld die erste Art entdeckte (Bonner 1944). Der kleine Organismus (10- 20μ m) wird heute auch als soziale Amöbe bezeichnet, da er zwar hauptsächlich als unabhängige, bewegliche, einzelne amöboide Zelle lebt, aber sich unter Hunger-Bedingungen mit anderen Zellen seiner Art zusammen schließt (Annesley and Fisher 2009, Schaap 2011(a)). Er gehört zur Supergruppe der Amoebozoa und darin zur Gruppe der Dictyostelia, welche mittlerweile ca. 120 Arten umfassen. Diese werden in vier Hauptgruppen unterteilt, wobei Dictyostelium discoideum zu Gruppe 4 zählt (Schaap et al. 2006) auch wenn die genaue Einteilung in monophyletische Gruppen umstritten ist (Romeralo et al. 2009).

Das Verbreitungsgebiet der Dictyostelia reicht von arktischen Erdboden-Habitaten bis in tropische Gebiete, dabei werden auch Wüsten bewohnt (Schaap 2011(a)). In hoher Konzentration sind sie auf Laubstreu zu finden wo ihre Beute, andere Mikroorganismen wie Bakterien oder Hefen, den Zersetzungsprozess von Pflanzenmaterial betreiben. Diese werden mittels Phagozytose inkorporiert und lysiert.

Dicytostelium discoideum hat ein haploides Genom, welches ca. 34 Megabasenpaare groß und auf sechs Chromosomen verteilt ist (Eichinger et al. 2005). Viele Gene des Organismus sind homolog zu denen höherer Eukaryoten. Er enthält sowohl Gene der Metazoa, als auch der Pilze und Amöben, was es somit ermöglicht die Dictyostelia als Bindeglied zu den Urlebewesen zu betrachten (Eichinger et al. 2005; Annesley and Fisher 2009).

Für die Forschung ist D. discoideum ein geeigneter Modellorganismus, da er innerhalb der Dictyostelia die am besten untersuchte Art ist. Im Labor kann der Organismus auf Bakterienrasen oder in Flüssigmedien gehalten werden. Seine Generationszeit beträgt 3h auf Bakterien odh in axenischen Flüssigkulturen (Böckeler et al. 2006; Annesley and Fisher 2009; Maeda 2011). Er ist in Experimenten einfach zu handhaben, lässt sich gentechnisch leicht verändern und steuern. Der Entwicklungszyklus von D. discoideum dauert ca. 24h. Da seine multizellulären Strukturen transparent sind, lassen sich Entwicklungsstadien gut verfolgen.

Aus diesen Eigenschaften heraus lassen sich wesentliche Prozesse der Zellbiologie, wie Chemotaxis, Zytokinese, Phagozytose, Zelldifferenzierung (Form- und Strukturgebung) multizellulärer Entwicklung und Signaltransduktion, untersuchen (Gerisch and MüllerTaubenberger 2003, Annesley and Fisher 2009).

1.2 Die Lebenszyklen von Dictyostelium discoideum

Der vegetative Zyklus von D. discoideum beginnt mit der Keimung der Spore (siehe Abb.2). Die amöboiden Zellen ernähren sich in der Natur vor allem von Bakterien, welche sie chemotaktisch wahrnehmen, jagen, diese umfließen, internalisieren und verdauen (Raper and Fennell 1952, Annesley and Fisher 2009). Mittels kontinuierlicher Aus- und Einstülpungen der Membran (Pseudopodien) bewegen sich die Amöben in Richtung der Beute, die sie bspw. über einen steigenden Folsäuregradienten wahrnehmen können (Loomis 1975). Folsäure ist ein Stoffwechselprodukt von Bakterien und wird von ihnen ausgeschieden. (Brown et al. 1961; Kesbeke et al. 1991). Die Aufnahme extrazellulärer Partikel und deren Inkorporation bezeichnet man als Phagozytose (Silverstein 1995). Für das Zellwachstum bis zur mitotischen Teilung, benötigt die einzelne D. discoideum Zelle ca. 1000 Bakterienzellen (Film von Gerisch). Des Weiteren gibt es D. discoideum Stämme, die in der Lage sind, in flüssigen, axenischen Nährmedien mittels Macropinocytose zu wachsen. Der Prozess bezeichnet die Aufnahme von nährstoff-enthaltender Flüssigkeit aus der Umgebung in die Zelle mittels Vesikeln (Aderem and Underhill 1999, Cardelli 2001). Das Wachstum in Nährlösung dieser Laborstämme wird als axenisch bezeichnet. Ihren unabhängigen Status behält die einzelne Amöbe solange bei, bis Veränderungen im Lebensraum sie zu anderen Strategien zwingen. Für die Reaktion auf veränderte Umweltbedingungen haben die Dictyostelia drei verschiedene Strategien evolviert:

Die Erste ist, dass die Zelle sich vor hoher Osmolarität oder hohen Ammoniumspiegel schützen kann in dem sie sich einkapselt und Mikrozysten bildet (Raper 1984). Diese Strategie ist bei D. discoideum allerdings verloren gegangen (Schaap 2011 (a)). Zweitens, Amöben gegensätzlichen Paarungstyps können eine Zygote formen (geschlechtlicher Zyklus, siehe Abb. 1), welche dann die sie umgebenden arteigenen Amöben phagozytiert (Kannibalismus).

Mit den zusätzlichen Ressourcen wird unter anderem eine dickwandige Kugel geformt, genannt Macrocyste. In D. mucoroides wird der zu Grunde liegende Mechanismus durch Ethylen gesteuert (Amagai et al. 2007), welches als Hormon wirkt.

Einkapselung und Macrocystenbildung sind Prozesse, welche im Dunkeln und/ oder unter Wasser stattfinden können (Raper 1984, Li and Purugganan 2011).

Die dritte Möglichkeit nutzt der Organismus bei Nahrungsmangel. Um die Konsequenzen von Hunger zu vermeiden, initiiert Dictyostelium ein Entwicklungsprogramm, dabei stellen die Zellen ihr Teilungswachstum ein (Raper and Fennell 1952).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: Die drei Lebenszyklen von Dictyostelium discoideum (Abbildung aus Li und Purugganan, 2011)

In einem einige Millimeter großen Bereich bilden einige hundert bis mehrere hunderttausend Zellen eine multizelluläre Masse (Loomis 1975; Thompson and Kay 2000). Dafür ändert sich das genetische Expressionsprofil der Amöben. Gene die für Wachstum, Nahrungsaufnahme und Teilung wichtig waren, werden herunter reguliert und Gene für Aggregation und Entwicklung werden aktiviert. Dies resultiert in differenzierten polaren Amöben, die chemotaktisch aktive niedermolekulare Substanzen sekretieren und darauf reagieren. Das extrazelluläre Signalmolekül cyclisches Adenosin-3‘,5‘-monophosphat (cAMP), welches als Pheromon wirkt, wird bereits wenige Stunden nach Beginn der Hungerphase in Pulsen von D. discoideum sezerniert (Konijn 1968). Das cAMP bindet an Rezeptoren und bewirkt über eine Signalkaskade, dass die Rezipienten sich in Richtung steigender cAMP Konzentration bewegen und ihrerseits cAMP sekretieren.

Der beim Strömen auftretende Doppler Effekt bewirkt, dass die Amöben kontinuierlich auf das ruhende Zentrum zu kriechen und sich nicht an den cAMP Signalen der anderen Zellen orientieren (Gerisch 1971). Weiterhin sorgen auf der Zelloberfläche gebundene und ins Medium sezernierte Phosphodiesterasen für die hydrolytische Spaltung des gebundenen cAMP und halten so die Hintergrundkonzentration niedrig (Malchow and Gerisch 1974; Gross 2009; Schaap 2011(a)). Nachdem der Vorgang des Strömens abgeschlossen ist, entwickelt das multizelluläre Aggregat apikale Polarität und wird als ‚ tipped mound ‘ bezeichnet (Siegert and Weijer 1995). Die Spitze des Zellhaufens emittiert weiterhin Wellen von cAMP zu den Zellen unterhalb der Spitze und bewirkt damit eine Aufwärtsbewegung der Zellen. Die dann entstehende Struktur wird als ‚ first finger ‘ bezeichnet (Gross 2009). Diese fingerähnliche Struktur kann sich auf das Substrat legen und zu wandern beginnen. Geleitet von Signalen wie Licht, Temperatur und Gasgradienten migriert das Pseudoplasmodium (jetzt als slug bezeichnet) in die oberen Lagen des Bodens (Raper and Fennell 1952; Poff and Skokut 1977; Schlenkrich et al. 1995; Bonner and Lamont 2005). Der wandernde slug ist eine polare Zellmasse, welche in eine anteriore und eine posteriore Region eingeteilt wird.

Im anterioren (vorderen) Bereich befinden sich die Prästielzellen, welche ca. 20% der gesamten Zellmasse des slug ausmachen. Die verbleibenden 80% der Zellen differenzieren sich zu Präsporenzellen (Raper 1940, Gross 2009). Hat der slug eine geeignete Stelle zur Fruchtkörperbildung gefunden, so differenzieren sich die Prästielzellen zu Stielzellen, die absterben und die Präsporenzellen zu keimungsfähigen Sporen aus. Dabei richtet der slug sein anteriores Ende auf und die Prästielzellen wandern in die obere Mitte und bilden den sogenannten mexican hat. Während der Fruchtkörperbildung bilden die Prästielzellen zuerst einen zentralen Kanal aus Zellulose, in diesen kriechen sie dann hinein und differenzieren sich zu Stielzellen aus. Bei diesem Prozess vakuolisieren die Zellen, lagern auf ihre Zellmembran Zellulose auf und sterben ab (Raper and Fennell 1952). Die Präsporenzellen „klettern“ an dem neugeformten Stiel nach oben, initiieren die Sporenbildung und bilden einen runden Sporenkörper aus (Schaap 2011 (a)). Die Sporen aus dem Sorus können dann einen neuen Lebenszyklus anfangen (Abb. 1).

1.3 Äußere Faktoren, welche die Entwicklung von D. discoideum beeinflussen

Sowohl die Differenzierung, als auch die Morphogenese von D. discoideum ist abhängig von vielen Faktoren, welche im Zusammenspiel wirken. Es gibt allerdings drei Signalmoleküle, die Hauptregulatoren für das Wachstum und die Entwicklung sind (O’Day 2009). Diese sollen hier kurz beschrieben werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: A = Schema der wichtigsten extrazellulär wirkenden Signalmoleküle, welche die

Zelldifferenzierung von Dictyostelium discoideum beeinflussen (nach O’Day et al. 2009). B = Differentiation-Inducing-Factor-1, ein chloriniertes Hexaphenon (aus Fukuzawa 2011)

Bei der Untersuchung des Entwicklungszyklus von D. discoideum fiel Town, Gross und Kay auf, dass es neben dem cyclischen Adenosin Monophosphat (cAMP) noch einen oder mehrere andere Faktoren geben muss, welche die Stielzellbildung im untersuchten D. discoideum Stamm V12M2 verstärken (Town et al. 1976). Diese als Differentiation Inducing Factor 1 (DIF-1) bezeichnete Substanz ist ein chloriniertes Hexaphenon (siehe Abb. 2B). Man fand heraus, dass DIF-1 als binärer Schalter für die Differenzierung zu Sporen- oder Stielzellen wirkt, in dem es die Expression der Prästielzellgene induziert und die Expression der Präsporenzellen inhibiert (Kay et al. 1989, Berks and Kay 1990, Thompson und Kay 2000). Diese vorläufige Differenzierungsentscheidung ist reversibel und die Zellen können sich dedifferenzieren oder in den anderen Zelltypus umdifferenzieren (Fukuzawa 2011).

Zu der DIF-1 Signalkette gehören auch Transkriptionsfaktoren, welche als Regulatoren für die Prästielzell-Differenzierung wirken und somit für die Umwandlung (Transduktion) des DIF-1 Signals in variable Expression von Zielgenen mit verantwortlich sind (Fukuzawa 2011). Das cyclische Adenosin Monophosphat (cAMP) kontrolliert als sekretiertes Signalmolekül die Zellbewegung (Chemotaxis) der Amöbe und deren Differenzierung während des Entwicklungsprogramms, also die Fruchtkörpermorphogenese (Schaap 2011

(b)). Extrazelluläres cAMP steuert auch die Genexpression, während der verschiedenen Entwicklungsstadien. Die Signalmoleküle cAMP und DIF-1 bewirken via cross-talk die Prästielzelldifferenzierung, während bei den Präsporenzellen eine Verschaltung von intrazellulärem cAMP und extrazellulärem cAMP für die Differenzierung sorgt. Wenn der slug in Richtung Substratoberfläche kriecht, bewirkt einfallendes Licht die Freisetzung von Ammonium (NH3) aus der Spitze des slug.Ammonium wird in großen Mengen beim Abbau der Proteine in der hungernden Zelle produziert. Dort verhindert es die Umwandlung vom slug in den Fruchtkörper und die Reifung der Stielzellen (Schindler und Sussman 1977). Der Verlust von Ammonium initiiert die Bildung der Zellwand in Stielzellen. Ammonium wirkt also als DIF-1 Antagonist. Des Weiteren bewirkt eine hohe Konzentration an Ammoniumphosphat eine Erhöhung der Osmolalität der Sporenmasse und verhindert die Keimung der Sporen (Cotter et al. 1999).

Sowohl von cAMP als auch von DIF-1 ist bekannt, dass intrazelluläre Calciumionen als Antwort in der Signaltransduktion dienen (Abe and Maeda 1991). Je nach Zellzyklusphase, in der sich die Zellen zum Zeitpunkt des Hungerns befinden, ist die zytoplasmatische Calciumkonzentration verschieden. So konnte gezeigt werden, dass Zellen der SynthesePhase (S-Phase) oder der frühen vormitotischen Phase (G2-Phase) im Zytosol eine hohe Ca² + Konzentration haben, welche wichtig für die Induktion von Prästielzellgenen ist und die Zellen dazu neigen Stielzellen auszubilden (Abe and Maeda 1991; Azhar et al. 2001; Maeda 2011). Zellen die sich in der mittleren oder späten G2 Phase befinden, haben niedrigere Calciumspiegel und bilden tendenziell Sporen (Maeda 2011).

Des Weiteren ist Ca² + wichtig für die Zellbewegung während der Chemotaxis, da eine Reihe von Actinbindeproteinen für ihre Funktion auf eine hohe Calciumkonzentration angewiesen ist (Noegel and Schleicher 2000, Pikzak et al. 2005).

Ein weiteres Protein Calcium abhängiger Signaltransduktionswege, ist Calmodulin.

Calmodulin ist ein kleines, saures, Calcium bindendes Protein, mit einer hoch konservierten Struktur, welches in allen untersuchten eukaryontischen Lebensformen vorkommt. !

Es ist in D. discoideum an Prozessen wie Zellbeweglichkeit, Chemotaxis, Sporenreifung und Ionenhomöostasis beteiligt (Catalano and O’Day 2008, Chen et al. 2010). Ein Schlüsselprotein, welches den Ca² +/Calmodulin gestarteten Informationsfluss weiterträgt ist das Calcineurin.

1.4 Calcineurin

Das Enzym Calcineurin ist eine Proteinphosphatase, welche spezifisch die Aminosäuren Serin/Threonin in Zielproteinen dephosphoryliert. Sie gehört zur Klasse der Serin/Threonin- Proteinphosphatasen des Typs 2B (PrP-2B) (Stemmer and Klee, 1991). Ihre Aktivität im Zytosol ist hauptsächlich abhängig vom zweiwertigen Kation Calcium und dem Protein Calmodulin, es kann aber auch durch ungesättigte langkettige Fettsäuren, wie Arachidonsäure, aktiviert werden (Kessen et al. 1999). Der Name Calcineurin wurde 1979 von Klee et al. auf Basis seiner Calcium bindenden Eigenschaft und seinem gehäuften Vorkommen in neuronalem Gewebe geprägt (Klee, Crouch and Krinks 1979, Wei et al. 2002). Das Protein selbst kommt allerdings in bisher allen untersuchten eukaryotischen Organismen außer Pflanzen vor und dient dort Calcium vermittelter Signaltransduktion (Li et al. 2011). Seine Primärsequenz und die heterodimere Quartärstruktur (funktionelle Zusammenlagerung der UE) sind hochgradig konserviert.

Calcineurin besteht aus der katalytischen Untereinheit A (CNA) und der regulatorischen Untereinheit B (CNB). Sequenzvergleiche der Aminosäuren zeigten bspw. für die CNA-UE von Saccharomyces cerevisiae eine 54%ige Übereinstimmung mit der von Mäusen (Hemmenway and Heitman 1999). Auch zeigt Calcineurin A einen hohen Übereinstimmungsgrad mit anderen Mitgliedern der Proteinphosphatase Familie (Rusnak and Mertz 2000). Ebenso wie CNA, zeigt auch die regulatorische Untereinheit B hohe Grade an Sequenzhomologie. So stimmt die Aminosäureabfolge von CNB aus Säugerzellen zu 86% mit der von Drosophila melanogaster überein und zu 54% mit Saccharomyces cerevisiae (Rusnak and Mertz 2000).

Calcineurin A besteht aus verschiedenen Domänen; einem CNB Bindebereich (Sikkink et al. 1995), der Calmodulin Bindedomäne (Kincaid et al. 1990) und der autoinhibitorischen Domäne (Hashimoto, Perrino and Soderling 1990), welche in Abwesenheit von Ca² +/Calmodulin in der „ active site “ Lücke bindet. Im inaktiven Zustand liegen also die beiden Untereinheiten von Calcineurin, miteinander assoziiert vor.

Steigt die Calciumkonzentration im Zytosol auf Grund extrazellulärer Stimuli, wird Calmodulin durch Binden von Ca² + aktiviert. An der Calcineurin B Untereinheit binden derweil Ca² + Ionen an die vier „ EF-Hand “-Bindemotive (Kakalis et al. 1995). Dies führt zu einer Konformationsänderung und die autoinhibitorische Domäne von Calcineurin A löst sich, das Enzym ist teilaktiviert (siehe Abb.3). Ca² +/Calmodulin kann jetzt an das freigewordene Calmodulin Bindemotiv von Calcineurin A binden, dies bewirkt eine weitere Konformationsänderung in die katalytisch aktive Form. Das Holoenzym ist jetzt vollständig aktiviert (siehe Abb. 3) (Klee et al. 1998; Rusnak and Mertz 2000; Li et al. 2011). Substrate können nun an das aktive Calcineurin binden und die Steuerung von unterschiedlichen Prozessen begleiten.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3: 3D Modell von Calcineurin und seine Aktivierung durch Ca² + und Ca² +/Calmodulin Der grüngefärbte Bereich ist Calcineurin B und die roten Pfeile markieren die Ca² + Bindestellen. Die schwarzen Kugeln stellen die Calciumionen dar. Das orangegefärbte Protein ist das aktive Ca² +/Calmodulin. Das rotegefärbte ist die Calcineurin A Untereinheit.

(Abbildung aus Li, Huiming et al. 2011)

In Säugetieren hat Calcineurin vielfältige Aufgaben, so ist es zum Beispiel für die T-Zell Aktivierung wichtig. Dort dephosphoryliert es die zytosolische Komponente des Transkriptionsfaktors NFAT (Nuclear Factor of Activated T-Cells), was eine Translokation in den Nucleus bewirkt und die Expressionsrate u.a. von Interleukin 2 steigert (Liu, Jun et al. 1991).

Des Weiteren ist es wesentlich an der Erregungsweiterleitung in Nervenzellen beteiligt, in dem es Calciumionenkanäle der Plasmamembran oder Proteine des dopaminergen Systems dephosporyliert (Armstrong 1989, Pittman 2011).

Aber auch Neuroplastizität, Formen neuronaler Strukturen und die Antwort auf synaptische Stimulation sind Prozesse, an denen Calcineurin beteiligt ist (Kim et al. 2009). Wesentlich für die medizinische Forschung ist die Erkenntnis, dass es in Entwicklungsstörungen des Gehirns, neurodegenerativen Erkrankungen und bipolaren Störungen (bspw. Depressionen) beteiligt ist (Miyakawa et al. 2003).

In niederen Eukaryonten wie S. cerevisiae ist Calcineurin wichtig um die Zellen aus der Pheromon induzierten G0 Phase (Ruhephase) zu holen. In Neurospora crassa, ist es am Wachstum der Hyphen beteiligt. Im humanpathogenen Pilz Cryptococcus neoformans ist Calcineurin A (Odom et al. 1997, a+b).

Auch für andere humanpathogene Pilzarten ist bekannt, dass das Blockieren von Calcineurin ein wirksames Mittel zur Behandlung von Infektionen ist, da es sowohl Virulenz als auch Pathogenität herabsetzt (Reedy et al. 2009, Chen et al. 2011).

1.5 Calcineurin in Dictyostelium discoideum

Über die exakten Funktionen von Calcineurin in D. discoideum Signalprozessen ist nur sehr wenig bekannt. Winckler, Dammann und Mutzel zeigten 1991, dass dieses Protein ebenso wie in höheren Eukaryonten Ca² +/Calmodulin bindet, dies aber nur in Abhängigkeit von Ca² + tut. Um zu verstehen welche Proteinphophatasen in D. discoideum vorhanden sind, wurden u.a. spezifische Phosphatase-Inhibitoren wie Okadasäure (ein Muschelgift) eingesetzt (Simon et al. 1992).

Calcineurin A von D. discoideum hat mit ca. 81kDa ein signifikant höheres Molekulargewicht, als alle anderen eukaryontischen Organismen, weil an seinem N- und C- terminalen Ende Extra-Domänen enthalten sind. Allerdings zeigten Dammann et al. 1996, dass die enzymatischen Eigenschaften der Untereinheit A denen aus anderen Organismen sehr ähnlich sind.

Die Phosphatase-Aktivität ist auch in D. discoideum von zweiwertigen Kationen abhängig und seine Überexpression führt zu keiner phänotypischen Änderung (Hellstern et al. 1997). Mittels der Calcineurininhibitoren FK506 und Cyclosporin A konnten Horn und Gross 1996 zeigen, dass Calcineurin in beiden Signalwegen der Differenzierung (Stiel- oder Sporenzelle) involviert ist.

Im Gegensatz zu anderen Organismen werden die beiden Calcineurin Untereinheiten von nur jeweils einem Gen in D. discoideum kodiert.

Calcineurin A (CNA) wird vom Gen canA kodiert, welches am stärksten während des vegetativen Zyklus und nach der Aggregation exprimiert wird. Die Expressionsrate ist also abhängig vom Entwicklungsstadium (Dammann et al. 1996).

Die regulatorische Untereinheit von Calcineurin (CNB) wird von einem Gen (cnbA) kodiert, welches in eine mRNA transkribiert wird, die durch einen noch nicht aufgeklärten Prozessierungsmechanismus in zwei Isoformen überführt und dann in zwei unterschiedlich große Protein-Isoformen übersetzt wird (Aichem und Mutzel 2001). Die kleinere Form (18 kDa), auch als CNBS (Calcineurin B Short) bezeichnet, akkumuliert in der Zelle am stärksten während der frühen Phase der Aggregation. Dagegen ist die Expression der größeren Form (20,5 kDa), auch als CNBL (Calcineurin B Long) bezeichnet, konstitutiv während der Wachstumsphase angeschaltet (Aichem and Mutzel 2001).

Durch die spezifische Inhibierung von Calcineurin in D. discoideum mit Gossypol waren die Wachstumsraten stark reduziert und die Entwicklung verzögert. Eine Mutante, welche Calcineurin A überexprimierte, zeigte verstärkte Resistenz gegenüber Gossypol (Weissenmayer et al. 2005).

Mehrere Versuche eine Calcineurin ‚ knock out ‘ Mutante zu erzeugen schlugen fehl, was darauf hindeutet, dass dieses Protein essentiell ist. Mittels Erzeugung von RNA-Interferenz (RNAi) Mutanten konnte die Expression der CNB-Untereinheit jedoch herunterreguliert werden. Diese ‚ knock down ‘ Mutanten zeigten verzögerte Entwicklung und einen abberanten Phänotyp. Bei CNB-RNAi Mutanten zeigten die Untersuchungen Fruchtkörper mit kurzen Stielen und Sporenköpfe mit ‚ ectopic tips ‘. Weiterhin wurde bei den Stielzellen eine unvollständige Vakuolisierung und eine verringerte Expressionsrate des stielzellspezifischen Gens ecmB festgestellt (Boeckeler et al. 2006).

1.6 Ziele dieser Arbeit

Da über den genauen Einfluss von Calcineurin auf Wachstum, Differenzierung und Entwicklung von Dictyostelium discoideum noch wenig bekannt ist, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Auswirkungen des RNAi Silencing im Vergleich zum Wildtypstamm AX2 untersucht.

Um Unterschiede in der Differenzierung näher untersuchen zu können sollte der Monolayer- Zelldifferenzierungs-Assay nach Robert R. Kay von 1987 etabliert werden. Der Versuch ermöglicht es die Differenzierung von Zellen in Sporen- oder Stielzelle zu analysieren (Kay 1987).

Aus Vorarbeiten von Park 2010 ist eine leichte Resistenz der RNAi Silencing Mutanten gegenüber Lithium bekannt, daher wurden in Wachstumsversuchen die Generationszeiten untersucht. Des Weiteren ist bekannt, dass Lithium in Amöben die Chemotaxis inhibiert, dementsprechend sollte auch hier eine eventuelle Resistenz mittels Unter-Agarose- Chemotaxis Assay untersucht werden.

Zur weiteren Analyse der Stressantwort wurde die Entwicklung auf Agarplatten, in Gegenwart verschiedener Faktoren (MgCl2, KCL, LiCl, NaCl, Sorbitol, Coffein und CaCl2), untersucht.

2. Material und Methoden

2.1.1 Chemikalien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.2 Geräte und Materialien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.3 Antibiotika

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.4 Materialien der Molekularbiologie

2.1.4.1 Enzyme für die Molekularbiologie

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.4.2 Standards für Agarosegele

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.5 Zelllinien

2.1.5.1 Dictyostelium discoideum Zelllinien

Tab.1: D. discoideum Zelllinien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.6 Plasmide und Konstrukte

Tab.2: Plasmide

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.7 Oligonukleotide ('Primer') siehe Diplomarbeit Park, 2010

2.1.8 Medien und Puffer

Sämtliche angesetzte Medien und Puffer wurden direkt nach dem Ansetzen und vor Benutzung für 20 Minuten bei 121°C autoklaviert. Für feste Medien wurde entweder 2% Agar oder 1% Agarose zugesetzt.

2.1.8.1 Medien und Puffer für D. discoideum

HL5-Medium (AX-Medium)

22g HL5-Medium (Formedium, Norwich, England) 18g Maltose

auf 1l mit H2O bidest auffüllen

Sørensen Phosphat Puffer (SP-Puffer) 1,997g KH2PO4

0,715g Na2HPO4 x 12 H2O auf 1l mit H2Obidest auffüllen,

mit 17mM KH2PO4 den pH-Wert auf 6,0 einstellen

SP-Platten

20 g Agar

1,997 g KH2PO4 0,715 g Na2HPO4

mit H2Obidest auf 1 l auffüllen,

den pH-Wert mit 17 mM KH2PO4 auf 6,0 einstellen

MES-HL5

5 g Hefeextrakt (Difco)

10 g Bacto Proteose Peptone Nr. 3 (Difco)

14 g Glucose

0,976 g MES

ad 1 l mit H2Obidest , den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 einstellen. Nach dem Autoklavieren den pH-Wert überprüfen und gegebenenfalls mit steriler NaOH korrigieren.

SM-Medium (400ml)

4g Glucose

4g Bactopepton

0,4g Hefeextrakt

0,4g MgSO4 x 7H2O 0,88g KH2PO4

0,52g K2HPO4

auf 400ml Volumen mit H2Obidest auffüllen

!

PDF-Puffer (500ml) 1,25g K2HPO4

0,9g KH2PO4 0,75g KCl

auf 500ml mit H2Obidest auffüllen

pH-Wert auf 6,4 einstellen (NaOH oder KOH) autoklavieren

500μl einer sterilen 1M CaCl2 Lösung

1,25ml einer sterilen 1M MgSO4 Lösung

Sporulationsmedium (400ml) nach Serafimidis, Kay 2005 0,781g MES

0,596g KCl 0,468g NaCl 0,058g CaCl2 0,081g MgCl2

auf 400ml Volumen mit H2Obidest auffüllen pH-Wert mit 5M NaOH auf 6,2 einstellen

Stielsalz-Stocklösung (400ml, 100fach) nach Kay 1987 29,824g KCl

4,675g NaCl 5,88g CaCl2

auf 400ml Volumen mit H2Obidest auffüllen

Sporulationssalz-Stocklösung (400ml, 100fach) nach Kay 1987 59,648g KCl

46,75g NaCl 5,88 CaCl2 8,12g MgCl2

auf 400ml Volumen mit H2Obidest auffüllen

10mM MES (400ml)

0,078g MES

auf 400ml Volumen mit H2Obidest auffüllen pH-Wert auf 6,2 einstellen

1M Stocklösungen von Salzen

Lithiumchlorid (LiCl), Kaliumchlorid (KCl), Magnesiumchlorid (MgCl2), Natriumchlorid (NaCl), Calciumchlorid (CaCl2) in H2Obidest. gelöst

2.1.8.2 Medien für E.coli

LB-Medium

10 g Bactotrypton

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl mit H2Obidest auf 1 l auffüllen,

pH-Wert auf 7,3 einstellen

2.1.8.3 Medienzusätze

Ampicillin 100 g/ml (für E. coli und D. discoideum)

G418 20 g/ml (für D. discoideum)

2.1.9 Puffer und Gele

2.1.9.1 Puffer und Gele für biochemische Methoden

5 x Gel Probenpuffer für Proteingele (GSB)

500 mM Tris-HCl

10% SDS

50% Glycerin

0,025% Bromphenolblau

5 mM EDTA

mit HCl den pH-Wert auf 6,8 einstellen vor Gebrauch 2 x GSB herstellen: 400 l 5 x GSB

50 l -Mercaptoethanol

550 l H2Obidest

10 x Running Buffer (Stocklösung)

30,3 g Tris-HCl

144 g Glycin

10 g SDS

auf 1 l mit H2Obidest auffüllen

1 x Puffer für SDS-Gele wurde aus der Stammlösung mit H2Obidest hergestellt

4 x Lower Gel Buffer

182 g Tris-HCl

4 g SDS

auf 1 l mit H2Obidest auffüllen,

den pH-Wert auf 8,8 einstellen

[...]