Für das durchgeführte anwendungsbezogene "Screening" (Immunmonitoring) wesentlicher, an der Pathogenese der Multiplen Sklerose beteiligter immunologischer Parameter (Zytokine, -rezeptoren, Adhäsionsmoleküle) wurde ein geeignetes System der quantitativen "real-time" RT-PCR entwickelt und mit ELISA-Testsystemen kombiniert. Damit wurde die immunologische Situation im Vergleich verschiedener Patientenkollektive auf Gen- und Proteinebene unter Einfluss einer rekombinanten ß-Interferontherapie (rIFN-ß) mit den Zielen verfolgt, Wirkmechanismen der rIFN-ß aufzudecken und prognostische Marker bezüglich der Aktivität der Erkrankung und eines Therapieeffektes zu finden.
Die entwickelte RT-PCR Methodik ist gekennzeichnet durch eine hohe Sensitivität und Reproduzierbarkeit, zeichnet sich sowohl in der cDNA-Synthese als auch in der PCR-Amplifikation durch eine über weite Konzentrationsbereiche bestehende Linearität aus, und ist durch die Verwendung von importierten Standardkurven für die Quantifizierung von mRNA-Targets aus verschiedenen PCR-Läufen besonders für das "Screening" eines Parameters in einer Vielzahl von Proben geeignet.
Der Vergleich der Expressionsprofile der immunologischen Parameter über den Zeitverlauf von 12/24 Monaten in allen MS-Patientenkollektiven zeigte im Hinblick auf potentielle Wirkmechanismen der rIFN-ß Therapie immunologisch betrachtet eine Zunahme von sICAM-1, sVCAM-1 und sTNF-R2, klinisch betrachtet eine ca. 30%ige Reduktion der Schubrate in den therapierten Kollektiven. Des weiteren wurden potentielle für die MS-Erkrankung typische immunologische Parameter-konstellationen in der Form einer Abnahme von IL-4, sIL-4R, IFN-ß und sTNF-R1 in allen Kollektiven unabhängig von der Therapie erkennbar. Bezüglich der Aktivität der Erkrankung ergaben sich für die RR-MS Patienten deutliche positive Korrelationen zwischen sICAM-1, sVCAM-1 sowie sTNF-R2 und dem Grad der Behinderung (EDSS) bei Untersuchungsbeginn, so dass diese als prognostische Marker des weiteren MS-Verlaufs herangezogen werden könnten. Des weiteren hat sich ein deutlicher Zusammenhang der Konzentration von sIL-4R, dessen Rolle in der MS hier zum ersten Mal überhaupt betrachtet wurde, mit dem Risiko eines Patienten einen Schub zu erleiden gefunden, womit sich, ebenfalls für den sIL-4R eine deutliche konzentrationsabhängige Reduktion der Responderwahrscheinlichkeit auf die rIFN-ß Therapie nachweisen ließ. [...]
Inhaltsverzeichnis
I. ZUSAMMENFASSUNG
II. EINLEITUNG
Teil A: Multiple Sklerose als Erkrankung
1. Autoimmunität: Reaktionen gegen körpereigene Antigene
2. Morphologische Veränderungen und daraus resultierende Symptome
3. Wesentliche Klinische Verlaufsformen
4. Ätiologische Faktoren
5. Molekulare Pathogenese
6. Therapie mit rekombinantem Beta-Interferon (rIFN-ß)
6.1. Wirkhypothese des rIFN-ß
7. Heterogenität
8. Prognostische Surrogat-Marker
Teil B: Labor-Methoden für das Screening immunologischer Surrogat-Marker
1. Die Polymerase-Ketten-Reaktion
2. „Real-Time” und „On-Line“ PCR
3. Prinzip der „real-time“ PCR zur Bestimmung einer Startkopienzahl
3.1. Unterschied zur konventionellen PCR
3.2. Der CP-Wert
4. Das LightCycler®-System
5. Fluoreszenz-basierte Detektionsformate
5.1. Unspezifische Detektion mittels SYBR®- Green I
5.2. Hybridisierungssonden für eine Sequenz-spezifische Detektion
6. Schmelzkurvenanalyse
7. Reverse Transkription - Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)
8. RT-PCR Quantifizierungsprinzipien
Teil C: Ziele der Arbeit
III. MATERIAL UND METHODEN
Teil A: Der klinische Bereich
1. Allgemeines Design der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie
2. Untersuchte Patientenkollektive
2.1. Untherapiertes Kollektiv (Kontrollgruppe)
2.2. ß-Interferon Therapierte Kollektive (Therapiegruppen)
2.2.1. rIFN-ß1a (Rebif®) Therapiertes Kollektiv
2.2.2. rIFN-ß1b (Betaferon®) Therapiertes Kollektiv
2.3. Gesundenkollektiv
2.4. Verwandtschaftsbeziehungen von Patienten der untersuchten Kollektive
3. Dokumentation von Patientendaten aus dem klinischen und wissenschaftlichen Bereich: Entwicklung eines EDV-gestützten Dokumentationssystems zur Erfassung von Patientendaten (Access-Datenbank)
4. Klinische Methoden
4.1. Klinische Untersuchungen
4.2. Schübe
4.3. EDSS
Teil B: Der labormethodische Bereich
1. Material
1.1. Chemikalien
1.2. Materialien
1.3. Humanes Probenmaterial
2. Molekularbiologische Arbeiten
2.1. Von der RNA-Isolation zur Reversen Transkription
2.1.1. Vorbereitung der Proben während der MS-Sprechstunde
2.1.2. RNA-Isolation mit Durchführung eines DNase-Verdaus
2.1.3. Konzentrationsbestimmung der RNA im Photometer
2.1.4. cDNA-Synthese
2.2. Messung der Genexpression mittels quantitativer „Real-Time“ RT-PCR
2.2.1. Strategie für die RT-PCR Optimierungen
2.2.2. Oligonukleotide
2.2.3. Plasmid-Standards
2.2.4. Externe Standardkurven für den Import in verschiedene PCR-Läufe
2.2.5. „Real-Time“ PCR unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender Schmelzkurvenanalyse
2.2.6. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von SYBR-Green I mit anschließender Schmelzkurvenanalyse
2.2.7. Quantitative „Real-Time“ PCR unter Verwendung von „Hybridization Probes“
2.2.8. PCR Amplifikationsprotokoll unter Verwendung von „Hybridization Probes“
2.2.9. Gel-Elektrophorese
3. Immunologische Arbeiten
3.1. Prinzip
3.2. sIL-4R
3.3. „ModuleSets®“ (TNF-beta; sICAM-1; sVCAM-1) und „CytoSets®“ (sTNF-R1, sTNF-R2)
4. Statistische Analysen
IV. ERGEBNISSE
Teil A: Quantitative „Real-Time“ und „On-Line“ RT-PCR
1. Etablierung und Validierung der quantitativen 2-step „Real-Time“ RT-PCR
1.1. RNA-Isolation und Reproduzierbarkeit der cDNA-Synthese
1.2. Linearitätsbestimmung der cDNA-Synthese
1.3. Allgemeine Optimierungen der PCR-Reaktionen
1.4. Reproduzierbarkeit der „Real-Time“ PCR: Intra- und Inter-Assay Variationen
1.5. Konstruktion von externen Plasmid-Standardkurven
1.6. Reproduzierbarkeit der importierten Plasmid-Standardkurven
1.7. Dynamischer Bereich der Quantifizierung mittels kinetischer Analyse
1.8. PCR Amplifikationseffizienzen von Plasmid-Standard im Vergleich zu Patienten-cDNA
1.9. PBGD als Referenz für die relative Quantifizierung von Zytokin-mRNAs
1.9.1. Einfluss einer ß-Interferon Therapie auf die Expression von PBGD
Teil B: Ergebnisse aus der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie
1. Ausgangssituation: Einschätzung der von vornherein bestehenden Unterschiede zwischen den Kollektiven bei Studienbeginn (Baseline)
1.1. Homogenitätsprüfungen der demographischen Daten und der gemessenen immunologischen Parameter
1.1.1. Strukturvergleich aller MS-Patienten mit den gesunden Probanden
1.1.2. Strukturvergleich der Kollektive mit unterschiedlicher Verlaufsform: Schubförmig-remittierend (RR-MS) mit sekundär chronisch-progredient (SP-MS)
1.1.3. Strukturvergleich der drei RR-MS Kollektive: Untherapiert mit Rebif mit Betaferon
1.1.3.1. Strukturvergleich der untherapierten Patienten mit den Patienten des Rebif- bzw. Betaferon-Kollektivs
1.1.3.2. Strukturvergleich der Rebif-Gruppe mit der Betaferon-Gruppe
1.2. Überprüfung auf Einflussfaktoren genereller und MS-spezifischer Art auf die Expression immunologischer Parameter
2. Prospektiver Bereich: Längsschnittanalyse untherapierter und therapierter MS-Patienten
2.1. Natürlicher MS-Verlauf bei untherapierten RR-MS Patienten
2.1.1. Aufteilung der untherapierten RR-MS Patienten in die Untergruppe A (Completers) und Untergruppe B (Wechsler)
2.1.2. Weitere Charakterisierung der Untergruppen A (Completers) und B (Wechsler)
2.2. MS-Verlauf bei ß-Interferon therapierten MS-Patienten
2.2.1. Verlauf der immunologischen Parameter bei RR-MS im Vergleich zweier Behandlungsformen (rIFN-ß1a [Rebif]; rIFN-ß1b [Betaferon])
2.2.2. Verlauf der immunologischen Parameter unter Behandlung mit Betaferon im Vergleich zweier MS-Verlaufsformen (schubförmig-remittierend [RR-MS]; sekundär chronisch-progredient [SP-MS])
2.2.3. Verlauf der immunologischen Parameter bei RR-MS unter Behandlung mit Betaferon im Vergleich des ersten und zweiten Behandlungsjahres
2.3. Vergleich der klinischen Krankheitsaktivität (EDSS/ Progressionsindex/ Schübe) in den untersuchten MS-Patientenkollektiven
2.4. Korrelationen der Expression immunologischer Parameter mit der klinischen Krankheitsaktivität (EDSS/ Progressionsindex/ Schübe)
2.5. Zusammenhang der Expression immunologischer Parameter mit einer Therapieresponse
2.5.1. Definition von Therapierespondern
2.5.2. Immunologische Profile nach Einteilung der MS-Patienten in Responder und Nonresponder
2.6. Expression immunologischer Parameter als prognostische Marker bei der MS
2.6.1. Prognostischer Marker bezüglich des klinischen Verlaufs im Zusammenhang mit dem Auftreten von Schüben
2.6.2. Prognostischer Marker bezüglich einer Therapieresponse
V. DISKUSSION
Teil A: Bewertung der quantitativen 2-step „Real-Time“ RT-PCR als Methode zur Untersuchung differentieller mRNA-Expression
1. RNA-Isolation und cDNA-Synthese
2. „Real-Time“ PCR
2.1. Allgemeine Optimierungen der PCR
2.2. Konstruktion von externen Plasmid-Standardkurven
2.3. Reproduzierbarkeit beim Import von externen Standardkurven in verschiedene PCR-Läufe
2.4. Reproduzierbarkeit der „Real-Time“ PCR
2.5. Vergleich der PCR Amplifikationseffizienzen von Plasmidstandards und Patienten-cDNA
2.6. PBGD als Referenz für die relative Quantifizierung der Zytokin mRNA-Expression
Teil B: Wissenschaftliche MS-Patientenstudie
1. Design der wissenschaftlichen MS-Patientenstudie
2. Bewertung der Ausgangssituation: Homogenitätsprüfungen zur Einschätzung der von vornherein bestehenden Unterschiede zwischen den Kollektiven bei Studienbeginn (Baseline)
3. Prospektive Längsschnittanalyse untherapierter und therapierter MS-Patienten
3.1. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation im natürlichen MS-Verlauf bei untherapierten RR-MS Patienten und bei deren Aufteilung in die Untergruppen der Completers und Wechsler
3.1.1. Unterschiede zwischen Completers und Wechslern
3.1.2. Zusammenhänge mit der klinischen Situation
3.2. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation bei ß-Interferon therapierten MS-Patienten
3.2.1. Situation bei RR-MS Patienten im Vergleich zweier Behandlungsformen (rIFN-ß1a [Rebif®]; rIFN-ß1b [Betaferon®]) unter Einbeziehung der Langzeitwirkungen von rIFN-ß1b über 24 Monate
3.2.2. Situation bei Betaferon-therapierten Patienten im Vergleich zweier MS-Verlaufsformen (schubförmig-remittierend [RR-MS]; sekundär-chronisch progredient [SP-MS])
3.3. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation im Vergleich untherapierter und therapierter MS-Patienten
3.3.1. Potentielle allgemeine Erkrankungsmechanismen
3.3.2. Potentielle Wirkmechanismen einer MS-Therapie mit ß-Interferonen
4. Immunologische Parameter als Aktivitätsmarker der MS
4.1. Korrelationen der immunologischen Situation mit dem EDSS
4.2. Korrelationen der immunologischen Situation mit der Schubrate und dem Progressionsindex
5. Zusammenhang der Expression immunologischer Parameter mit einer Therapieresponse
5.1. Immunologische Profile im Vergleich der Responder und Nonresponder
6. Besonderheiten beim IL-4 Rezeptor (IL-4R) / löslichen IL-4R (sIL-4R)
6.1. Bewertung der immunologischen und klinischen Situation bei MS-Patienten im Zusammenhang mit dem IL-4R / sIL-4R
6.2. sIL-4R als prognostischer Marker bei der MS
6.2.1. Prognose bezüglich des weiteren klinischen Verlaufs (Auftreten von Schüben)
6.2.2. Prognose bezüglich einer Therapieresponse
7. Kritische Betrachtungen der erhobenen Daten
VI. AUSBLICK
Zielsetzung und thematische Schwerpunkte
Die vorliegende Arbeit untersucht die immunologische Situation von Patienten mit Multipler Sklerose (MS) unter Therapie mit Beta-Interferonen (rIFN-ß). Ziel ist es, durch ein serielles Immunmonitoring Wirkmechanismen der Therapie zu entschlüsseln und immunologische Surrogat-Marker zu identifizieren, die eine genauere Prognose über den Krankheitsverlauf sowie das individuelle Ansprechen auf die Behandlung ermöglichen.
- Entwicklung und Validierung einer sensitiven, quantitativen „Real-Time“ RT-PCR zur Analyse relevanter Zytokin-mRNA-Spiegel.
- Kombinierter Einsatz molekularbiologischer und immunologischer Methoden (RT-PCR und ELISA) zum Nachweis von Gen- und Proteinexpressionen.
- Prospektive Längsschnittanalyse untherapierter und verschiedener Beta-Interferon-therapierter MS-Patientenkollektive über 12 bis 24 Monate.
- Korrelation immunologischer Profile mit klinischen Aktivitätsmarkern (EDSS, Schubrate) zur Prognose einer Therapieresponse.
- Untersuchung der spezifischen Rolle des IL-4 Rezeptors (sIL-4R) als möglicher prognostischer Marker bei der MS.
Auszug aus dem Buch
Die Polymerase-Ketten-Reaktion
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) wurde Anfang der 80er Jahre von Kary Mullis (Saiki et al.,1985; Mullis et al.,1986; Mullis et al.,1987) entwickelt. Die PCR hat die gesamte molekularbiologische Forschung revolutioniert und ist heutzutage zu einer Standardmethode geworden, die in einem großen Bereich von Forschungsprojekten angewendet wird sowie zur Verbesserung der routinemäßigen Diagnostik von Pathogenen und Krankheiten von medizinischer und veterinärmedizinischer Wichtigkeit beigetragen hat.
Die Anwendungsmöglichkeiten reichen vom rein qualitativen Nachweis bakterieller- oder viraler Infektionen in der Virologie und Mikrobiologie bis zur quantitativen Genexpressionsanalyse (RT-PCR), von der Erstellung des „genetischen Fingerabdrucks“ für die Überführung von Tätern in der Kriminalistik (T-RFLP) und forensischen Medizin bis hin zur Entschlüsselung des humanen Erbgutes im Humangenomprojekt.
Darüber hinaus hat die PCR aber auch für eher spektakuläre Bereiche Anwendung gefunden. So wurde sie in der molekularen Archäologie u.a. für den Nachweis von DNA in 4000 Jahre alten ägyptischen Mumien herangezogen (Pääbo, 1985) sowie für die Aufklärung historischer Rätsel wie im Falle von Kasper Hauser (Weichhold et al., 1998) eingesetzt.
Zusammenfassung der Kapitel
I. ZUSAMMENFASSUNG: Kurzer Überblick über die methodische Entwicklung einer quantitativen Real-Time RT-PCR und die zentralen Ergebnisse der Studie im Hinblick auf Wirkmechanismen von Interferon-beta und prognostische Marker.
II. EINLEITUNG: Darstellung der klinischen Grundlagen der Multiplen Sklerose, ihrer Pathogenese und der aktuellen Therapiemöglichkeiten sowie theoretischer Hintergrund zur PCR-Technologie.
III. MATERIAL UND METHODEN: Detaillierte Beschreibung der Patientenkohorten, der klinischen Parameter und der labortechnischen Protokolle zur Genexpressionsanalyse und Proteinkonzentrationsbestimmung.
IV. ERGEBNISSE: Präsentation der Studiendaten zur Validierung der PCR-Methode sowie der Analyse immunologischer Profile in verschiedenen Patientenkollektiven über den Beobachtungszeitraum.
V. DISKUSSION: Kritische Interpretation der Studienergebnisse im Kontext der MS-Pathogenese, der Wirkweise von Interferonen und der Eignung immunologischer Parameter als Surrogat-Marker.
VI. AUSBLICK: Diskussion zukünftiger Forschungsansätze zur Verbesserung der individuellen Patientencharakterisierung und Therapieprognose.
Schlüsselwörter
Multiple Sklerose, Immunmonitoring, Beta-Interferone, Real-Time RT-PCR, Zytokine, Adhäsionsmoleküle, sIL-4R, Genexpression, EDSS, Schubrate, Therapieresponse, Prognostische Marker, Neuroimmunologie.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit?
Die Dissertation befasst sich mit dem Immunmonitoring von MS-Patienten unter einer Behandlung mit rekombinanten Beta-Interferonen, um Wirkmechanismen besser zu verstehen und klinisch relevante Surrogat-Marker zu identifizieren.
Welche zentralen Themenfelder werden abgedeckt?
Die Arbeit verknüpft klinische Verlaufsbeobachtungen (EDSS, Schubrate) mit molekularbiologischen Daten (Zytokin-mRNA) und Proteinkonzentrationen (ELISA), um ein umfassendes Bild der Immunmodulation unter MS-Therapie zu zeichnen.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das primäre Ziel ist es, biologische Marker zu finden, die vorhersagen können, wie ein Patient auf eine Interferon-Therapie ansprechen wird (Responder vs. Non-Responder) und wie der weitere klinische Verlauf prognostiziert werden kann.
Welche wissenschaftliche Methode kommt zum Einsatz?
Der methodische Schwerpunkt liegt auf der Etablierung und Anwendung einer quantitativen „Real-Time“ RT-PCR zur präzisen Messung der Genexpression sowie der Durchführung von Sandwich-ELISAs zur Proteinanalytik.
Welche Aspekte werden im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine methodische Validierung (Methodik der quantitativen RT-PCR) und eine prospektive Längsschnittstudie, in der Patientenkollektive unter untherapierten und therapierten Bedingungen über bis zu 24 Monate analysiert werden.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit am besten?
Die Arbeit wird durch Begriffe wie Multiple Sklerose, Immunmonitoring, Beta-Interferone, Real-Time RT-PCR, Zytokine und sIL-4R charakterisiert.
Welche Rolle spielt der IL-4-Rezeptor in dieser Studie?
Der lösliche IL-4R (sIL-4R) wird als neuer, potenzieller prognostischer Marker untersucht; die Arbeit konnte zeigen, dass hohe Konzentrationen von sIL-4R mit einem erhöhten Risiko für Schübe korrelieren und die Wahrscheinlichkeit einer Therapieresponse senken.
Wie unterscheiden sich die Responder- von den Non-Responder-Profilen?
Responder zeigten im Studienverlauf tendenziell andere Expressionsmuster spezifischer Marker wie sVCAM-1 und sTNF-R2 im Vergleich zu Non-Respondern, was darauf hindeutet, dass das immunologische Profil zur frühzeitigen Differenzierung genutzt werden kann.
- Citar trabajo
- Benedikte Sabina Kühne (Autor), 2003, Immunmonitoring bei Patienten mit Multipler Sklerose unter Therapie mit ß-Interferonen - Aufdecken von Wirkmechanismen und Suche nach prognostischen Markern, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/19367
