Die Wirkung intrathekaler Baclofenapplikation auf die Aussschüttung von Adrenalin, Noradrenalin und Homovanillinsäure aus dem Nucleus paraventricularis hypothalami der Ratte

Inhaltsverzeichnis

Verzeichnis der Abkürzungen

1. Einleitung
1.1. Die Ausgangshypothesen
1.2. Die anatomischen, physiologischen und pharmakologischen Grundlagen
1.2.1. Der Nucleus paraventricularis hypothalami
1.2.2. GABA - Rezeptoren
1.2.3. Baclofen
1.2.4. Noradrenalin, Adrenalin und Homovanillinsäure (HVA)

2. Material und Methoden
2.1. Materialien
2.1.1. Chemikalien
2.1.1.1. Chemikalien für die Mikrodialyse
2.1.1.2. Chemikalien für die HPLC
2.1.1.2.1. Chemikalien für die Herstellung der Standards für die Katecholamin/Hydroxyindol - Anlage
2.1.1.2.2. Chemikalien für die Mobile - Phase: elektrochemische Detektion
2.1.2. Materialien
2.1.2.1. Materialien für die Mikrodialyse
2.1.2.2. Materialien für die HPLC
2.1.3. Geräte
2.1.3.1. Geräte für die Mikrodialyse
2.1.3.2. Geräte für die HPLC
2.1.3.2.1. Geräte für die elektrochemische Detektion
2.1.4. Tiere und Tierhaltung
2.2. Methoden
2.2.1. Operationsverfahren
2.2.1.1. Narkose
2.2.1.2. Stereotaxie
2.2.1.3. Implantation der Kanülen
2.2.2. Mikrodialyse
2.2.2.1. Vorbemerkungen
2.2.2.2. Mikrodialyse im Ncl. paraventricularis hypothalami mit/ohne intraventrikuläre Baclofenapplikation
2.2.3. HPLC
2.2.3.1. Grundzüge
2.2.3.2. Untersuchungsmaterial
2.2.3.3. Elektrochemische Detektion zum Nachweis von Katecholamin/Hydroxyindol Transmittern
2.3. Auswertung der gewonnenen Daten der HPLC
2.4. Statistische Bearbeitung der Daten

3. Ergebnisse
3.1. Qualitätskontrolle HPLC
3.2. Ergebnisse der Transmitteruntersuchungen
3.2.1. Übersicht
3.2.2. Adrenalin
3.2.3. Homovanillinsäure
3.2.4. Noradrenalin

4. Diskussion
4.1. Zur Methode
4.1.1. Vergleich von in - vivo - Messmethoden
4.1.2. Narkoseverfahren
4.1.3. Tiermodell
4.2. Auswirkung der intrathekalen Baclofenapplikation auf Adrenalin, Noradrenalin und Homovanillinsäure
4.2.1. Noradrenalin und Adrenalin
4.2.2. Homovanillinsäure
4.3. Schlussfolgerung

5. Zusammenfassung

6. Literaturverzeichnis

7. Lebenslauf

8. Verzeichnis der akademischen Lehrer

9. Danksagung

Verzeichnis der Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1. Einleitung

1.1. Die Ausgangshypothesen

Den Anlass für das in dieser Arbeit dargestellte Untersuchungsprojekt gab die Beobachtung an Patienten, die durch cerebrale oder supranukleäre Schädigung an einer Spastik wie auch an vegetativen Regulationsstörungen in Form von arterieller Hypertonie, Tachykardie, Hyper-hidrose, Hypersalivation, bronchialer Hypersekretion und motorischer Unruhe litten. Sowohl die Spastik, als auch die vegetativen Regulationsstörungen wurden durch intrathekale Baclofen-applikation gelindert (Becker, 1999). Dass diese positive Beeinflussung vor allem bei intra-ventrikulärer Injektion auftritt, lässt vermuten, dass vegetative Kerngebiete, darunter auch der Nucleus paraventricularis hypothalami, der weiter unten noch näher dargestellt wird, als Angriffspunkt eine wichtige Rolle spielen. Der genaue Mechanismus ist noch nicht ausreichend erklärt.

Da diverse Studien gezeigt hatten, dass Baclofen auch zu einer blutdrucksteigernden Wirkung im Tierversuch geführt hatte, was aber in der klinischen Beobachtung am Patienten nicht beobachtet wurde, war es wichtig, nochmals der Fragestellung nachzugehen, wie sich der Blutdruck bei intrathekaler Baclofenapplikation verhält.

Des weiteren sollten die exzitatorischen Neurotransmitter im Mikrodialysat auswertet werden, da experimentell ein inhibitorischer Einfluss von Baclofen nachgewiesen wurde (Goudreau, 1994; Wagner, 1994; Westerink, 1992).

Aus diesen klinischen Beobachtungen ergaben sich folgende Hypothesen:

- Intrathekale Baclofeninjektion (ITB) senkt den arteriellen Blutdruck der Ratte
- Intrathekale Baclofeninjektion (ITB) senkt im Mikrodialysat des Nucleus paraventricularis hypothalami exzitatorische Neurotransmitter.

Diese Ausgangshypothesen wollten der Verfasser et al. in einem Gemeinschaftsprojekt untersuchen.

In der vorliegenden Arbeit geht es nun um die Frage, ob intrathekale Baclofeninjektion die Neurotransmitter Adrenalin, Noradrenalin und den Katecholaminmetaboliten Homovanillinsäure senkt.

1.2. Die anatomischen, physiologischen und pharmakologischen Grundlagen

1.2.1. Der Nucleus paraventricularis hypothalami

Der Nucleus paraventricularis hypothalami gehört zur vorderen (rostralen) Gruppe des Hypo-thalamus und liegt in enger Nachbarschaft zum 3. Ventrikel.

Die Abbildung 1.1 zeigt die anatomischen Verhältnisse im Gehirn der Ratte und die wichtigen Verbindungen des Nucleus paraventricularis hypothalami zu anderen Kerngebieten, die an der Steuerung des Blutdruckes teilhaben.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.1: Der Nucleus paraventricularis hypothalami der Ratte und seine Verbindungen aus Swanson, 1986

Histologisch besteht das Kerngebiet aus einem magnozellulären und einem parvozellulären Anteil. Aufgrund ihrer unterschiedlich Expression von Kalium- und Calciumkanälen an ihrer Oberfläche, werden die Neurone des magnozellulären Anteils als Typ I, die des parvozellulären Anteils als Typ II Neurone bezeichnet (Luther, 2000). In den Neuronen des magnozellulären Anteils werden die Hormone Oxytozin und Vasopressin produziert, wobei jede Zelle nur ein Hormon synthetisiert, welche die Neurohypophyse über den Tractus supraopticohypophysialis erreichen.

Die Informationen zur Vasopressinausschüttung erhält das Kerngebiet über Osmorezeptoren, aber auch über sympathische noradrenerge Fasern, die aus den noradrenergen Gruppen A1, A2, A6 und C2 stammen (Saphier, 1993). Oxytozin regelt die Milchejektion, spielt eine Rolle beim Geburtsvorgang und weiterhin bei der Ejakulation des Mannes.

Die parvozellulären Neurone können in drei Untereinheiten gegliedert werden:

Als erstes ist die Gruppe der neurosekretorischen parvozellulären Neurone zu nennen, die mit ihren Axonen in die externe Zone des hypophysären portalen Kapillarkreislaufs projizieren und über Releasing und Inhibiting Faktoren die Freisetzung von Hormonen aus der Adeno-hypophyse kontrollieren. Als Releasing Faktoren werden das Corticotropin Releasing Hormon (CRH) und das Thyreotropin Releasing Hormon (TRH) produziert und sezerniert, ebenso Somatostatin (SOM) und Vasoaktives Intestinales Polypeptid (VIP).

Als zweite Untereinheit sind die Neuronen des parvozellulären Anteils zu nennen, die über absteigende Fasern zu autonomen Kerngebieten im Hirnstamm und Medulla projizieren und hier sympathische und parasympathische präganglionäre Zellen innervieren. In ihnen werden verschiedene Neurotransmitter, darunter die Katecholamine Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin synthetisiert. Sie gehören zu den sogenannten „autonomic upper motor neurons“. In diesem Kerngebiet ist die Konzentration dieser Neurone am höchsten und trägt dazu bei, dass bei Stimulation des Kerngebietes der Körper in einen Alarmzustand versetzt wird. Das heißt, dass eine Umschaltung der Organfunktionen auf erforderliche Leistungen in Zusammenhang mit Angriffs-, Flucht- oder Verteidigungsreaktion („defence reaction“) umgestellt werden: somato-sensorische und vegetative Symptome wie beschleunigte Atmung, Erhöhung der Herz-frequenz und des Blutdruckes, Erweiterung der Pupillen, Piloerektion, erhöhte Durchblutung der Muskeln und Verminderung der Darmperistaltik und -durchblutung (Tibirica, 1993; Coote, 1973). Diesem Teil des Nucleus paraventricularis hypothalami galt unser Interesse in der vor-liegenden Studie.

Eine weitere parvozelluläre Untereinheit projiziert in das Limbische System. Hier sind direkte Verbindungen zu dem Ventralen Septalen Bereich (VSA) zu nennen, denen eine Rolle in der Begrenzung des Fiebers zugeschrieben wird.

Das Kerngebiet übernimmt damit sowohl neuroendokrinologische als auch kardiovaskuläre Auf-gaben (Kiss, 1988). Die Flexibilität in der Zusammensetzung der „Cocktails“ an Neuro-transmittern und Hormonen spielt eine Ausnahmerolle in Hinsicht auf die Plastizität vielfältiger physiologischer Regelkreise (Swanson, 1980).

Funktionell wird der Nucleus paraventricularis hypothalami einem übergeordneten Steuerorgan des vegetativen Nervensystems, das als zentrales autonomes Netzwerk (CAN) bezeichnet wird, zugeordnet. Zu diesen funktionellen Steuerorgan gehören unter anderen der Nucleus amygdaloideus, die noradrenerge Gruppe A5, die rostrale ventrolaterale Medulla und der Tractus solitarius. Die einzelnen Kerngebiete und ihre Afferenzen und Efferenzen wurden in den letzten 20 Jahren entdeckt und untersucht (Loewy, 1990). Die Abbildungen 1.2 und 1.3 geben einen Überblick über diese Strukturen und deren Verbindungen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.2: Das zentrale autonome Netzwerk (CAN) aus Dougherty and Gottesfeld, 2000

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.3: Das zentrale autonome Netzwerk (CAN) aus Dougherty and Gottesfeld, 2000

In der Abbildung 1.2 wird die anatomisch Beziehung des Hypothalamus mit seinen Kern-gebieten zu den verschiedenen autonomen Nervengebieten widergegeben.

Die Abbildung 1.3 zeigt den Sitz der Nucleus paraventricularis hypothalami zur noradrenergen Gruppe A5, zur rostralen ventrolateralen Medulla und zu den sympathischen präganglionären Nuclei und deren anatomischen Sitz im Hirnquerschnitt. Eine wichtige Funktion übernimmt der Nucleus tractus solitarius, der eine zentral modulierende, integrative und regulierende Aufgabe besitzt. Zentrale Afferenzen erhält dieser Kern aus dem Kortex, hier vor allem aus dem Cingulum und Stirnhirn, der Hippocampusformation, Thalamus, Basalganglien, Hirnstamm und Rückenmark. Periphere Informationen erhält das Kerngebiet über den N. vagus und N. glossopharyngeus von den Barorezeptoren aus dem Sinus caroticum, von sympathischen Fasern aus dem weiteren kardiovaskulären, aber auch gastrointestinalen Bereich. Afferenzen vom Kerngebiet des N. vagus informieren ihn über die parasympathischen Abläufe. Efferente Verbindungen besitzt der Kern unter anderen zur rostralen ventrolateralen und ventromedialen Medulla und zum Nucleus ambiguus, der den Nucleus intermediolateralis innerviert. Durch diese Verbindungen nimmt er einen wichtigen Platz in der Blutdruckregulation ein.

Der Nucleus tractus solitarius wäre aufgrund seiner funktionellen Stellung als idealer Angriffs-punkt für Baclofen vorstellbar. In experimentellen Studien, bei denen in den Nucleus tractus solitarius lokal Baclofen injiziert wurde, kam es zu einer Blutdrucksteigerung (Sved, 1992; Takenaka, 1994;

Takenaka, 1995; Landulpho, 2003). Der Barorezeptorreflex wird über GABA - B - Rezeptoren am Nucleus tractus solitarius vermittelt und führt zu einer Steigerung des Blutdruckes (Yin, 1996). Daher führt eine direkte Stimulation dieser Rezeptoren durch den GABA - B - Agonisten Baclofen zu einer Blutdruckerhöhung. Da man aber bislang klinisch und experimentell in den meisten Studien eine blutdrucksenkende Wirkung bei Baclofengabe beobachtet hat, kann der Nucleus tractus solitarius nicht der primäre Angriffspunkt des GABA - B - Agonisten sein.

Zwar gibt es Studien, bei denen die intraventrikuläre bzw. intraperitoneale Baclofeninjektion zu einer Blutdrucksteigerung führte (Singh, 1987; Trippenbach, 1994; Takenaka, 1996). Dies ist aber möglicherweise darauf zurückzuführen, dass in diesen Studien eine zu hohe Dosis Baclofen bzw. ein zu großes Volumen in verhältnismäßig kurzer Zeit in den Ventrikel injiziert wurde und dies zu einer Blutdruckerhöhung führte, also aufgrund einer mechanischen Aus-wirkung und nicht aufgrund der Pharmakonwirkung der Effekt zustande kam. Andere Studien belegen deutlich den blutdruck-senkenden Effekt von intrathekal appliziertem Baclofen (Becker, 1999; Goudreau, 1994; Hayakawa, 2002; Hong, 1991; Takenaka, 1996) Die andere Über-legung, dass die Blutdruckregulation bei der Ratte anderen Regelmechanismen unterliegt als beim Menschen, ist eher unwahrscheinlich, da in zahlreichen Studien die vortreffliche Über-einstimmung des Blutdruckregulationssystems der Ratte mit dem des Menschen hervor-gehoben wurde (Bonham and McCrimmon, 1990; Brooks, 1990; Feldman and Smith, 1989; Hayashi and Lipski, 1992; Murakoshi and Otsuko, 1985; Okada, 1993; Persson and Henny, 1980; Siemers, 1982; Sved and Isukamoto, 1992; Vardhan, 1993; Wang and Dun, 1990).

Ein Kerngebiet, das neben dem Nucleus paraventricularis hypothalami, der noradrenergen Gruppe A5, der kaudalen Rapheregion und ventromedialen Medulla zur zentrale Steuerung des sympathischen Systems beiträgt, ist die rostrale ventrolaterale Medulla (Strack, 1989). Für sie konnte die blutdrucksenkende Wirkung bei Mikroinjektion von Baclofen in das Kerngebiet (Amano, 1993) und die blutdrucksteigernde Wirkung bei lokaler Gabe eines GABA - B Antagonisten (Avanzino, 1994) nachgewiesen werden. Die Blutdrucksenkung wird über GABA vermittelt (Smith, 1990). Dies erklärt den Blutdruckabfall nach Gabe des GABA - B - Agonisten Baclofen. An Gewebeabschnitten durchgeführte Einzelableitungen bestärkten dessen beobachtete inhibitorische Wirkungen an Neuronen der rostralen ventrolateralen Medulla (Li, 1995).

Beiden Kerngebieten, sowohl der rostralen ventrolateralen Medulla, als auch dem Nucleus paraventricularis hypothalmi ist die anatomische Nähe zum 3. Ventrikel gemeinsam. Dadurch verringert sich die Diffusionstrecke, die Baclofen bei intrathekaler Applikation zurücklegen muss. Somit erlangen diese beiden Kerngebiete besonderes Interesse bezüglich der Unter-suchung des blutdrucksenkenden Effekts bei intraventrikulärer Baclofeninjektion.

Einen größeren Anteil als die rostrale ventrolaterale Medulla an der Blutdruckregulation hat wahrscheinlich der Nucleus paraventricularis hypothalami, da er, wie oben erwähnt, eine Vielzahl von integrativen und regulativen Aufgaben im kardiovaskulären System als auch neuroendokrine Funktionen übernimmt (Martin, 1997; Joyner, 1993; Swanson und Sawchenko, 1980; Porter und Brody, 1986).

In verschiedenen Studien konnte nachgewiesen werden, dass der Nucleus paraventricularis hypothalami den Blutdruck nicht wie oben beschrieben nur über Vasopressin steuert, sondern dass auch zum Beispiel GABA eine wichtige Rolle bei der Blutdruckregulation spielt. Dabei spielen sowohl GABA - A - Rezeptoren, als auch GABA - B - Rezeptoren eine wichtige Rolle (Takenaka, 1995). Zum Beispiel konnte durch Mikroinjektion von Bicucullin, einem GABA - A - Antagonisten (Martin, 1997), ein blutdrucksteigernder Effekt nachgewiesen werden. Dieser zeigte sich auch bei einer Studie, in der Barorezeptoren stimuliert wurden und Verbindungen vom Nucleus supraoptikus zum Nucleus paraventricularis hypothalami nachgewiesen werden konnten (Takenaka, 1993). Auf die Stellung der GABA - B - Rezeptoren wird, da wir in dieser Studie einen GABA - B - Agonisten (Baclofen) benutzten, im nächsten Abschnitt genauer eingegangen.

Ebenfalls zu einer Blutdrucksteigerung führt die Gabe von NMDA ins periaquäduktale Grau der Ratte, das Efferenzen zum Nucleus paraventricularis hypothalmi besitzt und die Mikroinjektion von Glutamat in den Nucleus paraventricularis hypothalami (Martin, 1992), die darüber hinaus zu einer Erhöhung des myocardialen Sauerstoffverbrauchs führt (Tibirica, 1995). Diese Reaktion kann durch intravenöse und intrathekale Applikation bei Th 9 aufgehoben werden (Monassier, 1995). Die Akutgabe führt häufig zu einem bedrohlichen Blutdruckabfall, der bei Langzeitgabe ausbleibt (Tibirica, 1995). Inhibitorische Fasern ziehen zum Nucleus tractus solitarius, wodurch sich ebenfalls eine blutdrucksenkender Effekt erklären lässt (Mifflin, 1988). Direkte und indirekte Verbindungen bestehen darüber hinaus zum Sympathikus und den obengenannten Kontrollzentren des Sympathikus, vor allem der rostralen ventrolateralen Medulla (Badoer, 2001).

1.2.2. GABA - Rezeptoren

Mehr als 50 Jahre ist es her, seit der Neurotransmitter GABA im Gehirn nachgewiesen wurde (Roberts and Frankel, 1950). Die sich anschließenden Studien in diesen Jahren zeigten, dass GABA der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter im ZNS ist. Es gibt 3 Rezeptortypen an denen GABA bindet. Zum einen gibt es GABA - A - Rezeptoren, von denen es 16 Unter-gruppen gibt. Diese Rezeptoren sind an Cl - Kanäle gekoppelt und sind unter anderen ein Angriffspunkt für Barbiturate und Benzodiazepine (De Blas, 1996). Daneben gibt es noch GABA - C - Rezeptoren, von denen es 5 Untergruppen gibt. Zu finden sind sie in der Retina, im Rückenmark, in den Colliculi superiores und dem Magen. Sie sind involviert am Seh-, Merk- und Schlafwandelprozess (Enz, 2001; Johnston, 2002; McCall, 2002). GABA - A - und -C - Rezeptoren bezeichnet man auch als ionotrope Rezeptoren, da sie wie oben beschrieben an Chloridkanäle gekoppelt sind, wodurch es zu einer kurzzeitigen Hyperpolarisation der Nerven-zelle kommt.

Die für die vorliegende Arbeit wichtigeren Rezeptoren, die GABA - B - Rezeptoren, werden als metabotrope Rezeptoren bezeichnet. Sie führen zu modulatorischen Veränderungen der Nervenzelle und wirken über mehrere Sekunden bis Minuten, da sie zu einer verlängerten Hyperpolarisation führen. Auf die dafür verantwortlichen Mechanismen gehe ich weiter unten ein. Definiert werden GABA - B - Rezeptoren als Bicucullin insensitive Rezeptoren, für die R - ( - ) -Baclofen spezifischer Agonist ist und 2 - Hydroxy - Saclofen spezifischer Antagonist. Da Baclofen so spezifisch an dem GABA - B - Rezeptor bindet, wurden die meisten Studien zur Charakterisierung des Rezeptors mit Baclofen durchgeführt.

Der GABA - B - Rezeptor kann wiederum in einen GABA - B - R1, der aus den beiden Splice - Varianten GABA - B - R1 - A und dem - R1 - B - Rezeptor besteht, und einen GABA - B - R2 - Rezeptor unterteilt werden (Jones, 1998; Kaupmann, 1998; White, 1998; Kuner, 1999). Wahrscheinlich entstehen die verschiedenen Rezeptorvarianten durch unterschiedliches "Spleißen” aus der Intron-Exon-Struktur eines einzigen Gens.

Anhand der primären Aminosäuresequenz lassen sich die GABA - B - Rezeptoren in die Superfamilie der G - Protein - gekoppelten Rezeptoren einordnen. Wie für Mitglieder der G - Protein -gekoppelten Rezeptoren erwartet, beginnt die Membrantopologie der 100 - 130 kDa schweren Aminosäureketten mit einer großen, extrazellulären Bindungsdomäne für den Liganden GABA, durchstreift 7 - mal in helikaler Form die Plasmamembran (Synonym"7 - Helix - Rezeptoren”) und endet mit einem zytosolischen COOH - terminalen Teil sehr ähnlich den metabotropen Glutamat Rezeptoren (Nehring , 2000). Die Abbildung 1.4 zeigt das Modell der Leuzin - Zipper Interaktionsdomäne, die Abbildung 1.5 das eines GABA - B - Rezeptors.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.4: Modell der Leuzin-Zipper Interaktionsdomäne von GABA-B-R1 und ATF - 4 aus Nehring , 2000

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Abbildung 1.5: Der GABA - B - Rezeptor aus Nehring, 2000

GABA - B - Rezeptoren kommen im ZNS (Bowery, 1987) vor. Hier wurden sie vor allem in der Molekularschicht des Kleinhirns (Turgeon und Albin, 1993), genauer an Dendriten der Purkinje-zellen gefunden, den Nuclei vestibulares (Holstein, 1992) und cochleares (Juiz, 1994), im Mittel -und Frontalhirn. Entdeckt wurden sie auch im peripheren Nervensystem (Bowery, 1989), hier überwiegend in den Ganglien und Nerven vom parasympathischen und sympathischen Nervensystem und im Rückenmark (Price, 1987; Price, 1984), hier in den Laminae I - IV und X nach Rexed, in der höchsten Konzentration aber in den Laminae II (Substantiae gelatinosa) und III (Waldvogel, 1990). GABA - B -Rezeptoren sind sowohl prä - als auch postsynaptisch lokalisiert. Im Vergleich zu GABA - A -Rezeptoren, die integrale Ionenkanäle beinhalten, sind sie über pertussistoxinsensitive GTP -bindende Proteine (Scott, 1991; Dolphin, 1992) an Ca2+ - und K+ - Kanäle, in den Hinterwurzel-ganglienzellen vor allem präsynaptisch an Ca2+-Kanäle gekoppelt. Die Aktivierung erfolgt über eine Hemmung des Ca2+ - Einwärtsstroms, der eine Verkürzung der Aktionspotentiale zur Folge hat, was wiederum zu einer Hemmung der Freisetzung exzitatorischer Neurone führt. Über den gleichen Mechanismus wirken sie auch als präsynaptische Autorezeptoren, zur Hemmung der Transmittersekretion an derselben Synapse.

Postsynaptische GABA - B - Bindungsstellen sind wahrscheinlich über G - Proteine an K - Kanäle oder an die Adenylatcyclase gekoppelt (Bormann, 1988). Beide postsynaptischen Rezeptoren führen zu einer Hyperpolarisation (Bowery, 2002) und leisten einen Beitrag zur Entstehung eines späten inhibitorischen postsynaptischen Potententials, das in hippokampalen Pyramidenzellen (Schwartz, 1988) und im präfrontalen Kortex der Ratte nachgewiesen wurde (Karlson, 1989). Im nicht - neuralen Gewebe wurden GABA - B - Rezeptoren bislang an der glatten Muskulatur des Eileiters beim Kaninchen (Erdo, 1984), an endokrinen Strukturen, wie der Glandula pinealis (Demeneix, 1984) und den b - Inselzellen im Pankreas (Kawei und Unger, 1983) und neuro- muskulären Synapsen gefunden. Wichtig im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit ist eine Studie, in der nachgewiesen wurde, dass die Ausschüttung von Noradrenalin und Adrenalin aus den chromaffinen Zellen des Nebennierenmarks durch Stimulation von GABA - B - Rezeptoren an den Zellen verhindert werden kann (Oset - Gasque, 1990).

1.2.3. Baclofen

Bei Baclofen handelt es sich um ein Medikament, das mittlerweile seit 30 Jahren gegen Skelettmuskelspastizität bei multipler Sklerose oder bei Rückenmarksschädigung mit traumatischer oder neoplastischer Genese eingesetzt wird. Es entsteht durch Substitution eines Chlor - Phenyl -Ringes am Beta - C - Atom der g - Aminobuttersäure. Dadurch kommt es zu einem Chiralitätszentrum, womit Baclofen in zwei optisch aktiven Formen vorliegt: eine im polarisierten Licht rechts- und eine linksdrehende, wobei die letztgenannte Form ( R - ( - ) - Enantiomer ) die biologisch aktive ist (Olpe, 1978).

Die Abbildung 1.6 zeigt das Molekül Baclofen mit seinem Chiralitätszentrum im Vergleich zu GABA.

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Abbildung 1.6: Das Molekül Baclofen im Vergleich zu GABA aus Ochs, 1995

Die Wirkung von Baclofen wird sowohl über prä-, als auch postsynaptische GABA - B - Rezeptoren vermittelt. Baclofen ist ein selektiver GABA - B - Rezeptor - Agonist. Mithilfe von Baclofen konnten auch die physiologischen Funktionen des GABA - B - Systems charakterisiert werden (Ogata, 1990). Seine Wirkung entfaltet es demnach an den Rezeptoren durch Verminderung der Wirkung der Adenylatcyclase, Verminderung des Einstroms von Calcium an präsynaptischen und Kalium an den postsynaptischen Rezeptoren, wodurch es bei den letztgenannten zur einer Verminderung der Ausschüttung exzitatorischer Neurotransmitter kommt.

Pharmakokinetik: Nach oraler Gabe wird Baclofen rasch resorbiert. Die mittlere absolute Bioverfügbarkeit liegt zwischen 70 und 80 % (Krauss, 1988).

Die maximalen Plasmakonzentrationen werden nach 1 bis 6 Stunden erreicht (Hulme, 1985; Faigle, 1972; Wuis, 1990).

Die mittleren Plasmakonzentrationen nach therapeutischer Dosierung liegen bei zwischen 80 und 400 ng/l (Young, 1981; Young, 1981).

Die Eliminationshalbwertszeit wird zwischen 2 und 9 Stunden angegeben (Wuis, 1989; Kochak, 1985; Hulme, 1985; Faigle, 1980; Faigle, 1972; Anderson, 1984).

Die Plasmaclearance liegt zwischen 122 bis 237 ml /min (Kochak, 1985; Wuis, 1989), die renale Clearance zwischen 103 - 170 ml/min (Kochak, 1985; Wuis, 1989) und die nicht - renale Clearance zwischen 15 bis 95 ml/min (Wuis, 1990).

Nachdem bei oraler Baclofenanwendung häufig keine ausreichende Wirkung erzielt wird und Nebenwirkungen in Form von Müdigkeit und Verwirrtheit auftreten, wurde frühzeitig die intrathekale Anwendung vorgeschlagen (Penn, 1984). Dies führte zu einer hohen Liquor-konzentration bei relativ geringer Plasmakonzentration und damit zu einer deutlichen Verbesserung der Wirksamkeit, bei gleichzeitiger Reduktion der Nebenwirkungen. Weitere Nebenwirkungen sind eine verminderte Krampfschwelle, im Gegensatz zu GABA - A - Rezeptor - Agonisten, Übelkeit, Hypotonie, Obstipation und Pollakisurie, die sich durch die Wirkung an den obenbeschriebenen Rezeptoren und deren Verteilung erklären lässt.

1.2.4. Noradrenalin, Adrenalin und Homovanillinsäure (HVA)

Noradrenalin und Adrenalin gehören, wie auch Dopamin zu den sogenannten Katecholaminen. Die Bezeichnung Katecholamine stammt aus dem Englischen und bezeichnet ein Molekül mit ähnlicher Strukturformel (im Englischen Catechol, im Deutschen Brenzcatechin). Zusammen mit Serotonin und Histamin werden sie unter den Begriff Monoamine zusammengefasst.

Adrenalin und Noradrenalin sind Neurotransmitter im zentralen Nervensystem. Peripher erfüllt Noradrenalin seine Aufgabe als Überträgersubstanz an sympathischen, postganglionären Nervenendigungen, Adrenalin wird vom Nebennierenmark ins Blut abgegeben. Die Zielzellen für die beiden Katecholamine besitzen sogenannten Adrenorezeptoren. Hierbei handelt es sich um transmembranale Proteine mit 7 Helixstrukturen in der Membran der Effektorzelle und je einer Endkette an der extrazellulären Seite (Rezeptor) und an der intrazellulären Seite (Signalweg). Man unterscheidet a - und b - Adrenorezeptoren. Hier wiederum a - und a2 -Rezeptoren, von denen es 3 Untergruppen gibt, und b1 und b2 - Rezeptoren. An den a1 -Rezeptoren wird die Phospholipase C aktiviert und damit die Signaltransduktion über den Phosphoinositidstoffwechsel eingeleitet. a2 -Rezeptoren, die am häufigsten im ZNS vor-kommen, sind an die Adenylatcyclase oder über G -Proteine an Ionenkanäle gekoppelt. Beide b - Rezeptoren entfalten ihre Wirkung über die Adenylatcyclase. Noradrenalin und Adrenalin haben etwa gleichstarke Wirkung am a1 - Rezeptor.

Noradrenalin wirkt stärker als Adrenalin am b1 - Rezeptor und Adrenalin stärker am a2 - und b 2- Rezeptor (Glabella, 1976).

Synthetisiert werden die Katecholamine aus der Aminosäure Tyrosin, die durch die Tyrosin-monoxogenase/Tyrosinhydroxylase (Nr. 1 in Abbildung 1.7) zu Dopa hydroxyliert wird. Dopa wird durch die Dopamindecarboxylase (Nr. 2 in Abbildung 1.7) zu L - Dopa decarboxyliert. In einem weiteren Schritt kommt es durch Seitenkettenhydroxylierung durch die Dopamin - Monooxygenase (3 in Abbildung 1.7) zur Bildung von Noradrenalin. Das Enzym Methyl-transferase (Nr. 4 in Abbildung 1.7) bewirkt durch eine Methylierung an der Aminogruppe des Noradrenalins die Entstehung von Adrenalin.

Die Abbildung 1.7 gibt einen kurzen Überblick über diesen Synthesevorgang.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.7: Synthese der Katecholamine aus Kreutzig, 1994

Der Abbau der Katecholamine wird durch 2 Enzyme katalysiert. Zum einen durch die Katecholamin -O - Methyl - Transferase (COMT, Nr.1 in Abbildung 1.8), die Adrenalin und Noradrenalin zu 3 -Methoxy - Adrenalin bzw. - Noradrenalin umwandelt. In einem zweiten Schritt wird dann das Zwischenprodukt durch die Monoaminooxidase (MAO, Nr.2 in Abbildung 1.8) zu 3 - Methoxy - 4 -Hydroxy - Mandelsäure (Nr. 2 in Abbildung 1.8) abgebaut. Das Enzym Monoaminooxidase liegt im ZNS in 2 Formen vor der MAO - A und MAO - B , wobei die erstere die Katecholamine Serotonin, Adrenalin und Noradrenalin und die MAO - B überwiegend Dopamin abbaut.

Die Abbildung 1.8 veranschaulicht den beschriebenen Abbauprozess.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1.8: Abbau der Katecholamine aus Kreutzig, 1994

Am Nucleus paraventricularis hypothalami setzen, wie oben erwähnt, sympathische Fasern, die von noradrenergen Zellgruppen stammen, an.

Dabei findet man diese noradrenergen Fasern bevorzugt im parvozellulären Anteil und an Vasopressin sezernierenden Neuronen (Decavel, 1987).

Die hier am häufigsten vorkommenden Adrenorezeptoren sind a1 - und a2 - Rezeptoren. a1 Rezeptoren aktivieren dabei das kardiovaskuläre System, haben aber keinen Effekt auf die Ausschüttung von Vasopressin. a2 - Rezeptoren vermitteln die Ausschüttung von Vasopressin und hemmen das kardiovaskuläre System (Kimura, 1984).

Adrenalin und Noradrenalin werden im Nucleus paraventricularis hypothalami synthetisiert. Bei deren Abbau entsteht Homovanillinsäure.

Homovanillinsäure entsteht aber auch beim Abbau von Dopamin, wobei Dopamin erst über die Monaminoxydase - B (MAOB) zu DOPAC und dann durch die Katechol - O - Methyltransferase (COMT) zu Homovanillinsäure abgebaut wird. Daher kann Homovanillinsäure als Parameter für den Dopaminstoffwechsel, herangezogen werden.

Eine Dopaminsynthese, wie sie oben beschrieben ist, findet auch im Nucleus paraventricularis hypothalami statt (Swanson, 1986). In diesem Gemeinschaftsprojekt war es nicht gelungen Dopamin mit Hilfe der HPLC nachzuweisen. Deshalb wurden Homovanillinsäure und Dopac, ein weiteres Abbauprodukt von Dopamin, als indirekter Nachweis für eine Dopaminsynthese und -ausschüttung aus dem Nucleus paraventricularis hypothalami herangezogen. Der Metabolit Dopac ist das Thema einer Studie eines anderen Mitdoktoranden und wird in seiner Dissertation abgehandelt.

Dopamin ist sowohl Vorstufe von Noradrenalin und Adrenalin, aber auch selbst Neurotransmitter. Seine komplexe Wirkung beruht auf der Tatsache, dass Dopamin dosisabhängig sowohl an spezifischen Dopaminrezeptoren, als auch an Alpha - und Beta - Adrenorezeptoren wirkt (Brücke, 1991).

Die Vorstellungen über die Dopaminrezeptoren sind zur Zeit noch nicht genau erforscht und werden kontrovers diskutiert. Kloniert wurden bislang 5 verschiedene Rezeptoren. Die D1 - und D2 -Rezeptoren waren die ersten Rezeptoren, die entdeckt wurden. Die 3 später gefundenen werden in „D1 - like“ (D1, D5) und „D2-like“ (D2, D3, D4) eingeteilt. D1 - und D5 - Rezeptoren sind über ein stimulierendes G-Protein aktivierend an die Adenylatcyclase gekoppelt. D2-, D3- und D4 - Rezeptoren sind hemmend an die Adenylatcyclase gekoppelt. Neben dieser Verminderung von cAMP kommt es zur Öffnung von Kaliumkanälen und damit zu einer Hyperpolarisation. Dazu trägt auch ein Calciumkanal bei. Im ZNS gibt es 5 wichtige dopaminerge Systeme, in denen Dopaminrezeptoren sowohl prä - als auch postsynaptisch lokalisiert sind: Das mesocorticale - mesolimbische System, das nigrostriatale System, das hypothalamisch - medulläre System, die Chemorezeptor - Triggerzone und das tubero - infundibuläre System. In der Peripherie finden sich D1 - Rezeptoren vor allem postsynaptisch an Nieren - und Mesenterialgefäßen und D2-Rezeptoren an noradrenergen (Heterorezeptoren) und dopaminergen (Autorezeptoren) Nervenendigungen (Civelli, 1993).

Die am häufigsten im Nucleus paraventricularis hypothalami vorkommenden Dopaminrezeptoren sind die Rezeptoren D1 und D5 (Rivkees, 1997).

In der vorliegenden Studie wurde nun der Einfluss von Baclofen auf die Neurotransmitter-ausschüttung von Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin, dessen indirektes Abbauprodukt Homo-vanillinsäure gemessen wurden, im Nucleus paraventricularis hypothalami untersucht. Experimentell war in vorangegangenen Studien ein Zusammenhang zwischen Blutdruckerhöhung, Noradrenalin -(Ebihara, 1993, Bealer und Abell, 1995) und Adrenalinausschüttung (Martin, 1992) aus dem Nucleus paraventricularis hypothalami nachgewiesen worden. Eine Hemmung des dopaminergen periventrikulären - hypophysialen Systems durch Baclofen, vermittelt über GABA - B - Rezeptoren, wurde beschrieben (Goudreau, 1994; Wagner, 1994). Nun wollten wir herausfinden, ob Baclofen die Freisetzung dieser Neurotransmitter senkt und damit auch zu einer Senkung des Blutdruckes beiträgt.

2. Material und Methoden

2.1. Materialien

2.1.1. Chemikalien

2.1.1.1. Chemikalien für die Mikrodialyse

Chloralhydrat, Merck; Darmstadt/Deutschland Lioresal intrathekal 0,05 mg/ 1 ml, Novartis Pharma NaCl Lösung 0.9%, B. Braun; Melsungen/Deutschland Perchlorsäure (HClO4), Merck; Darmstadt/Deutschland Aqua bidest

2.1.1.2. Chemikalien für die HPLC

2.1.1.2.1. Chemikalien für die Herstellung der Standards für die Katecholamin/Hydroxy-indol -Anlage

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.1.2.2.Chemikalien für die Mobile-Phase: elektrochemische Detektion

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.2. Materialien

2.1.2.1. Materialien für die Mikrodialyse

Dialyseschläuche: FEP tubings, Axel Semrau GmbH & Co; Sprockhövel/Deutschland Konzentrische Mirkodialysekanülen: CMA/11 (Membran: ä.D.: 0,24 mm; Cut-Off: 6000 Daltons) Axel Semrau GmbH & Co; Sprockhövel/Deutschland Mikroliterspritze: 1ml bzw. 2,5 ml, Axel Semrau GmbH & Co; Sprockhövel/ Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße 0,25 ml und 0,50 ml

2.1.2.2. Materialien für die HPLC

Vakuumsaugflasche 1000 ml und 2000 ml, Duran, Fa. Schott, Mainz/Deutschland Filter, Typ Durapur, 47MM, 0,22MÜL, Fa. Millipore, Eschborn/Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße 0,25ml und 0,50 ml

2.1.3. Geräte

2.1.3.1. Geräte für die Mikrodialyse

OP - Tisch, Firma Kobe

Stereotaxiegestell, David Kopf Instruments, USA

Mikroinjektionspumpe: CMA/100 und150, Axel Semrau

GmbH & Co;Sprockhövel/Deutschland

Temperatur Controller: CMA/150, (Heizmatte, Rektalthermometer), Stockholm, Schweden In vitro Stand (Selbstbau)

2.1.3.2. Geräte für die HPLC

2.1.3.2.1. Geräte für die elektrochemische Detektion

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.4. Tiere und Tierhaltung

Männliche Wistar - Ratten (350-400g) der Firma Harlan-Winkelmann (Borchen) wurden unter konstanten klimatisierten Bedingungen bei zwölfstündigem Hell - Dunkelrhythmus (Raumtemperatur 23 ± 1oC, relative Luftfeuchtigkeit 55 ± 5%) zu maximal vier Tieren in dafür vorgesehenen Käfigen (42*26*19 cm) gehalten.

Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter (Altromin‚, Lage) und Wasser. Am Abend vor Versuchsbeginn wurde den Tieren das Futter entzogen, bei weiterhin ungehindertem Zugang zu Wasser.

2.2 Methoden

2.2.1. Operationsverfahren

2.2.1.1. Narkose

Anästhesiert wurden die Versuchstiere mit Chloralhydrat. Bei Chloralhydrat handelt es sich um ein Medikament, das sedativ und hypnotisch wirkt. Diese Wirkungen treten sehr rasch ein, da Chloralhydrat eine HWZ von 4 - 5 min besitzt. Die Metabolisierung erfolgt durch die Leber zu Trichlorethanol oder Trichloressigsäure. Wir verzichteten auf den Einsatz von Benzodiazepine und Neuroleptanalgesie aus folgenden Gründen:

- Chloralhydrat beeinflusst die Neurotransmitterausschüttung nur unwesentlich
- Erregungszustände, die bei Barbiturat - und Benzodiazepingabe auftreten können, wurden bei Chloralhydrat bislang nicht beobachtet.

Initial zur Einleitung der Narkose gaben wir 500 - 600mg/kgKG Chloralhydrat intraperitoneal. Zur Erhaltung der Narkose applizierten wir 100mg/kgKG/h in den Bauchraum. Dazu wurde ein Mikrodialyseschlauch in den Bauchraum der Ratte gebracht und fixiert. Über eine Mikrodialysepumpe konnte nun eine kontinuierliche Menge des Medikaments intraperitoneal eingeleitet werden, so dass es nicht zu einem Wirkungsverlust mit konsekutiver Aufhebung der Narkose kam. Zur Feststellung der Narkosetiefe kniffen wir den Versuchstieren mit einer Pinzette in die Haut zwischen die Zehen, bei nicht ausreichender Narkose kommt es, aufgrund des Schmerzreizes, zu einem Zurückziehen oder Zucken des Fusses. Bleibt diese Reaktion aus, befindet sich das Tier im Narkosestadium III (Analgesie-Stadium).

Diese Reflextestung erfolgte zu Beginn der Operation vor dem ersten Schnitt, vor der Trepanation und während des Versuches.

In der Abbildung 2.1 sieht man den Versuchstisch. Links befindet sich der Operationstisch, daneben befinden sich die Instrumente, die bei der Operation benötigt wurden.

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