Ziel dieser Bachelorarbeit ist die Optimierung der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) am Beispiel eines ausgewählten Pentamers, sowie deren direkte Anwendung bei der Synthese von Filaggrin-Peptiden.
Inhaltsverzeichnis
Danksagung
1. EINLEITUNG
1.1 Festphasenpeptidsynthese - State of the Art
1.2 Rheumatoide Arthritis
1.3 Filaggrin-Peptide & ACCP’s
2. AUFGABE & THEMENSTELLUNG
3. OPTIMIERUNG DER SPPS
3.1 Manuelle Festphasenpeptidsynthese der Pentamere 1-7
3.1.1 Strukturaufklärung der Pentamere
3.1.2 Ergebnisse und Vergleich der Syntheserouten
3.2 Mikrowellensynthese des Pentamers
4. FILAGGRINE - SYNTHESE & STRUKTURAUFKLÄRUNG
4.1 Automatisierte Synthese der Filaggrin-Derivate 8-10
4.1.1 Strukturaufklärung der Filaggrin-Derivate
4.2 Zyklisierung der Filaggrin-Derivate 8 und 9 in Lösung
4.2.1 Beschreibung der Syntheserouten
4.2.2 Strukturaufklärung der zyklisierten Filaggrin-Derivate
4.3 Vergleich der eingesetzten Schutzgruppen Trt und Acm
4.4 Automatisierte SSPPS und Zyklisierung der Filaggrin-Derivate 14-18
4.4.1 Beschreibung der Syntheserouten
4.4.2 Strukturaufklärung der zyklisierten Filaggrin-Derivate
5. ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK
6. EXPERIMENTELLER TEIL
7. ABBILDUNG DER1 H-NMR-SPEKTREN
8. LITERATURVERZEICHNIS
Danksagung
Herrn Prof. Dr. Armin Geyer danke ich für die interessante Themenstellung, die eingeräumten Freiheiten während meiner Forschungsarbeit, die konstruktiven Gespräche und die hervorragende Betreuung.
Herrn Dr. Oberthür danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Mein besonderer Dank geht an Felix Weiher für die Betreuung dieser Arbeit, welcher mir während meiner Laborzeit stets zur Seite stand und mit zahlreichen Tipps viel geholfen hat. Sowie Andreas Roeder, Tim Schlosser und Matthias Körling welche durch konstruktive Gespräche zu dieser Arbeit beigetragen haben.
Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei der gesamten Arbeitsgruppe Geyer und Oberthür für die sehr freundliche Aufnahme in den Arbeitskreis und der steten Hilfsbereitschaft.
Außerdem gilt mein Dank den Mitarbeitern der NMR-Abteilung für die Aufnahme der Spektren und konstruktiven Gespräche, sowie den Mitarbeitern der Massenspektroskopie-Abteilung für die Aufnahme der Massenspektren.
Auch meiner Freundin Laura Katharina Seel danke ich für die Unterstützung und die gemeinsame Zeit während dieser Arbeit.
Zuletzt möchte ich meinen Eltern und meinem Bruder ganz herzlich für die ständige Unterstützung während des Studiums und darüber hinaus danken.
Abkürzungsverzeichnis
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten
1. EINLEITUNG
1.1 Festphasenpeptidsynthese - State of the Art
Synthetische Peptide haben in der heutigen Zeit eine zunehmend größere Bedeutung erlangt, und zwar nicht nur in der Erforschung bioaktiver Peptide (Hormone, Neurotransmitter), sondern ebenfalls in der pharmakologischen Wirkstoffforschung.
Bei der chemischen Synthese von Peptiden werden verschiedene Aminosäuren über die Bildung von Säureamiden sukzessive miteinander verknüpft. Für einen gerichteten Ablauf der Verknüpfungen bei der Synthese mit 2-Chlortrityl-Chlorid-Harz und Fmoc-Strategie muss der N-Terminus jeder Aminosäure reversibel geschützt und bei jeder Kupplung der C-Terminus aktiviert werden. Darüber hinaus müssen die reaktiven Seitenketten in reversibler und orthogonaler Form geschützt werden, um Nebenreaktionen zu vermeiden.
Bei einer 1963 von MERRIFIELD eingeführten Methode findet die Synthese an einer festen Phase statt, die sogenannte Festphasenpeptidsynthese (S olid P hase P eptid S ynthesis). Dazu wird das Peptid auf einem polymeren Träger vom C-Terminus zum N-Terminus hin aufgebaut.
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Abbildung 1: Beladung mit der ersten Aminosäure des C-Terminus in Gegenwart eine Stickstoffbase, und Abspaltung mit 95% TFA des 2-Chlortrityl-Chlorid Harz zum gewünschten Peptid.
Dies geschieht bei 2-Chlortrityl-Harz mittels Fmoc-Synthesestrategie, bei der die erste Aminosäure über den C-Terminus an der festen Phase verlinkt wird. Anschließend wird der Fmoc geschützte N-Terminus mit 25% Piperidin in DMF entschützt und die nächste Aminosäure verlinkt. Nach der Synthese des gewünschten Peptids wird mittels 95% TFA in H2O von der festen Phase abgespalten.[1],2 ]
Als feste Phase, bzw. als polymerer Träger wird mit 1% m -Divinylbenzol vernetztes Polystyrol (Harz) verwendet. Dieses wird über eine Chlormethylierung funktionalisiert und mit einem Linker versehen, über den die Abspaltung des fertigen Peptides erfolgen kann. Die wichtigsten Harze in der Synthese sind Wang-, Rink-, sowie 2-Chlortrityl-Chlorid- Harze. Alle werden in der Fmoc-Peptidsynthese verwendet und können mit Trifluoressigsäure wieder abgespalten werden.
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Abbildung 2: Verschiedene in der Synthese oft verwendete Harze: Wang-Harz, Rink-Harz und 2-Chlortrityl-chlorid- Harz. Die Beladung erfolgt entweder durch Substitution der Hydroxy- oder Chlorid-Gruppe.
Als Kupplungsreagenzien werden klassischerweise oft DIC (Diisopropylcarbodiimid), DEC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) oder DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) zusammen mit HOBt (siehe Abbildung 6) eingesetzt. Dabei wird die Aminosäure in-situ aktiviert, indem die Carboxyl-Gruppe das Carbodiimid nucleophil angreift und ein O -Acylisoharnstoff-Derivat bildet.[1],2 ]
Die Kupplungszeiten betragen typischerweise ca. ein bis zwei Stunden pro Kupplung und ca. 30 min pro Entschützung.[3] In vielen Fällen wird ein sogenanntes Doublecoupling durchgeführt, wobei mit gleichen Äquivalenten an Aminosäure, Kupplungsreagenz und Base wiederholt gekuppelt wird. Dadurch soll ein 100%iger Umsatz gewährleistet werden, sodass keine Fehlkupplungen auftreten können. Bei einem Umsatz von beispielsweise nur 98% ergibt sich bei 20 Kupplungen eine Gesamtausbeute von nur 67%. Der Nachteil dieser Methode ist die mögliche Gefahr der Racemisierung bzw. Epimerisierung der Peptide, vor allem bei Cystein und Serin, da oftmals mit ca. sechs Äquivalenten Base gekuppelt wird.[4]
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Abbildung 3: Racemerisierung am Beispiel von Cystein im Basischen durch Keto-Enol-Tautomerie.
Die Racemerisierung kann ebenfalls bei Abspalten des Peptides vom Harz erfolgen. Dabei wird die Amid-Gruppe protoniert und anschließend das -H abgespalten.
Abbildung 4: Racemerisierung am Beispiel von Cystein im Sauren durch Protonierung der Amid-Gruppe.
In den letzten Jahren wurden modernere Kupplungsreagenzien basierend auf Uronium/Guanidinium-Salzen wie HATU, HBTU, HCTU oder Phosphonium-Salzen wie PyBOP entwickelt, welche noch effizientere Kupplungen in kürzerer Zeit möglich machen. Diese Reagenzien werden ebenfalls zusammen mit HOBt in Kupplungen verwendet.[5]
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Abbildung 5: Moderne Kupplungsreagenzien von links nach rechts: HATU, HBTU, HCTU und PyBOP.
Die Aktivierung einer Aminosäure mittels HBTU erfolgt analog dem Mechanismus der DCC/HOBt Aktivierung. Die Carboxyl-Gruppe greift nucleophil am Guanidinium- Kohlenstoff an, wird addiert und spaltet HOBt ab. Dieses greift nucleophil am Carboxyl-Kohlenstoffatom an und bildet nach Abspaltung eines Harnstoff-Derivats einen Aktivester, welcher anschließend vom N-Terminus einer Aminosäure angegriffen oder von HOBt umgeestert wird.[5] Hierbei wird mittels Fmoc- Strategie das Peptid synthetisiert, hingegen bei der Synthese mit HATU als Kupplungsreagenz mit Fmoc oder Boc geschützt werden kann. Dabei nimmt die Ausbeute bei Boc-Strategie nach ca. acht bis neun Kupplungen und einer Kupplungszeit von 10 min rapide ab.[6]
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Abbildung 6: Aktivierung und Kupplung mit Uronium/Guanidinium- Reagenzien mit Abspaltung und erneutem Angriff von HOBt. Beispielhaft dargestellt für HBTU.[5]
Auftretende Probleme bei der Peptidsynthese wie Zyklisierung, Harnstoffbildung, Oxazolonbildung und die bereits erwähnte Racemerisierung lassen sich durch HOBt Zugabe anhand einer geringeren Überaktivierung der Carbonsäure auf der Iminoester-Zwischenstufe vermeiden.[7]
1.2 Rheumatoide Arthritis
Rheumatoide Arthritis (RA, veraltet auch chronische Polyarthritis) ist die häufigste Erkrankung der Gelenke in Form einer Entzündung. Der Krankheitsverlauf beginnt plötzlich, mit Schmerzen in den Finger-, oder Zehengelenken, seltener auch in Hand-, Knie-, Fuß-, Hüft- oder Schultergelenken. Im
Gegensatz zu einem Gichtanfall sind die Finger- und Zehenendgelenke nicht betroffen und die Krankheitsursache ist bislang weitgehend ungeklärt. Angenommen wird eine Autoimmun-Erkrankung, bei der körpereigene Zellen von Zellen des Immunsystems angegriffen werden. Die typischerweise beidseits befallenen Gelenke schwellen an, sind meist überwärmt und können gerötet sein. Die Krankheit verläuft meist in Schüben von einigen Monaten, wodurch eine Behandlung erschwert wird. Zur Diagnostik wurde früher häufig nach Rheumafaktoren (RF-Antikörpern) im Blut gesucht, oder das C-reaktive Protein, sowie die
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Abbildung 7: Die vier Stadien im Verlauf der rheumatoiden Arthritis.[8]
Blutgeschwindigkeit analysiert. Da auch bei anderen Krankheiten der Rheumafaktor nachgewiesen werden kann, ist dieser Test zu unspezifisch. Es sollten daher bessere Methoden entwickelt werden, um rheumatoide Arthritis spezifisch und verlässlich nachweisen zu können.[9]
1.3 Filaggrin-Peptide & ACCP’s
Profilaggrin gilt als molekulare Vorstufe des Filaggrins, wird im Stratum granulosum der Epidermis produziert und in den Keratohyalingranula der Keratinozyten gespeichert. In den Keratinozyten selbst wird es durch posttranslationale Modifikation in Filaggrin umgewandelt. Profilaggrin ist stark phosphoryliert, wobei sich die Phosphatreste vorwiegend an den Aminosäuren Serin und Threonin befinden. Das Vorläufer-Peptid enthält 23 Filaggrin-Domänen und besteht aus 4061 Aminosäuren. Erhalten wird das Filaggrin-Peptid, wenn der Keratinozyt zur Hornzelle differenziert und das Profilaggrin anhand einer proteolytischen Spaltung und gleichzeitiger spezifischer Dephosphorylierung mittels eines Phosphatase-Enzym auseinander geschnitten wird. Dabei können aufgrund der Überlappung der 23 Domänen viele unterschiedliche Filaggrin-Moleküle entstehen, woraus eine große Vielfalt der möglichen Filaggrine resultiert.[10]
Die Citrullinierung von Peptiden/Proteinen mit Peptidyl-Arginin-Deiminasen (PAD) ist ein physiologischer Prozess, welcher durch hydrolytische Deiminierung der Aminosäure Arginin zur Aminosäure Citrullin und Ammoniak erfolgt. Das Filaggrin-Peptid enthält viele Arginin reiche Sequenzen, welche ebenfalls bis zu 20% in die nicht proteinogene Aminosäure überführt werden können. Die Folge einer Citrullinierung ist eine Ladungsumverteilung, welche Abbildung 8: Struktur der Peptidyl-Arginin-Deiminase. Dient zur hydrolytischen Deiminierung des Arginins zum Citrullins. Bearbeitete eine Neuordnung der Struktur des Eintrags 1WD8 aus der Protein Data Bank. Quartärstruktur bewirkt. Durch diese Neuordnung der Quartärstruktur ändern sich die Antigeneigenschaften des gesamten Proteins, die medizinisch genutzt werden können.[11],12 ]
Bei der Diagnose von rheumatoider Arthritis können mit Hilfe von citrullinierten Peptiden Autoantikörper nachgewiesen werden, welche sich gezielt gegen diese richten. Diese Autoantikörper gegen citrullinierte Peptide bilden sich vermehrt bei Patienten, die ein erhöhtes Risiko auf rheumatoide Arthritis haben oder bereits an rheumatoide Arthritis erkrankt sind. Die linearen Citrullinpeptide (ACP), welche bisher als Antigen verwendet wurden, besitzen eine Spezifität von ca. 95% und eine Sensitivität von nur 30%. Durch gezielte Zyklisierung der citrullinierten Peptide entstehen sogenannte Antikörper gegen cyclisierte Citrullinpeptide (ACCP). Diese Antigene besitzen neben der hohen Spezifität auch eine erhöhte Sensitivität von ca. 80%. Die gezielte Mutation der cyclisierten Citrullinpeptide könnte die Sensitivität dieser Tests beträchtlich steigern und den Nachweis der rheumatoiden Arthritis in der heutigen Medizin perfektionieren.[13]
2. AUFGABE & THEMENSTELLUNG
Ziel dieser Bachelorarbeit war die Optimierung der Festphasenpeptidsynthese (SPPS) am Beispiel eines ausgewählten Pentamers (Abb. 9), sowie deren direkte Anwendung bei der Synthese von Filaggrin-Peptiden (Abb. 10 und 11). Dabei sollte vorerst die Kupplungszeit und Entschützungszeit der SPPS verkürzt, und die Auswirkungen auf den Verzicht des Kupplungsreagenz HOBt überprüft werden. Zur Optimierung der SPPS sollte die Sequenz Phe1 -Gly2 -Val3 -Met4 -Hxa5 verwendet werden, welche mit Fmoc-Strategie an der festen Phase synthetisiert werden sollte. Die Kupplungsmethoden sollten anhand von NMR- Spektroskopie, Massenspektrometrie, Polarimetrie und HPLC erfolgen.
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Abbildung 9: Sequenz des Pentamers. HPLC erfolgen. Verwendet zur Optimierung der SPPS.
Die Ergebnisse der Optimierung sollten anschließend bei der Synthese von Ausschnitten aus dem Filaggrin-Peptid angewendet werden. Ziel war es eine native Sequenz des Peptids, eine zweifache l-Alanin-Mutante an den Positionen 4 und 17, sowie jeweils eine D-Alanin und L-Prolin-Mutante an der Position 11 zu synthetisieren.
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Abbildung 10: Sequenz des nativen Filaggrin-Peptids. Cit10 entspricht Citrullin, eine im Harnstoffzyklus als Zwischenprodukt auftauchende, nicht proteinogene Aminosäure.
Im Zuge dieser Arbeit sollte eine Möglichkeit gefunden werden die Peptide oxidativ zu zyklisieren. Dies sollte vorerst in Lösung mit unterschiedlichen Cystein- Schutzgruppen, und anschließend direkt am Harz durchgeführt werden. Dies sollte zu einer besseren Kontrollierbarkeit der Cysteine dienen und eine vollständige Konformationsanalyse der Peptide mittels NMR-Spektroskopie ermöglichen.
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Abbildung 11: Ausschnitt aus dem nativen Filaggrin-Peptid. Rot markiert sind jeweils die Stellen der oxidativen Zyklisierung, sowie die Mutationen des Glycins an Stelle 11.
3. OPTIMIERUNG DER SPPS
3.1 Manuelle Festphasenpeptidsynthese der Pentamere 1-7
Die Pentamere mit der Sequenz Phe1 -Gly2 -Val3 -Met4 -Hxa5 wurden manuell auf einem polymeren Träger synthetisiert. Bei der Synthese wurde als polymerer Träger 2-Chlorotrityl-Chlorid-Harz verwendet und Fmoc-geschützte Aminosäuren eingesetzt. Das Harz wurde vorerst im größeren Maßstab über den C-Terminus mit Fmoc-Hxa-OH beladen und für die folgenden Synthesen als Edukt verwendet. Dadurch wurden Beladungseffekte, bzw. Chargendifferenzen vermieden, indem jede Synthese mit dem gleichen Harz und der gleichen Beladung verwendet wurden. Zur Bestimmung der Beladung wurden ca. 2 mg des beladenen Harzes mit 20% Piperidin in DMF behandelt und anschließend mittels UVSpektroskopie die Konzentration an freiem Fluorenyladdukt bestimmt. Anhand der Konzentration kann die Beladung des Harzes berechnet werden.
Bei der Synthese wurde vorerst das Harz in DMF aufgequellt und die Fmoc-Schutzgruppe abgespalten. Anschließend wurde die nächste Aminosäure mit Hilfe von HBTU, DIPEA und je nach Syntheseroute mit oder ohne HOBt gekuppelt. Nach der Kupplung wurde das Harz mit DMF gewaschen und die beschriebenen Schritte dreimal wiederholt, bis die gewünschte Sequenz erlangt wurde. Das Peptid wurde mit DCM gewaschen, getrocknet und mit einer Lösung aus TFA/H2O (95:5) vom Harz abgespalten. Die erhaltene Abspalt-Lösung wurde eingeengt, mit Methanol aufgenommen und in kaltem abs. Diethylether gefällt, gewaschen und lyophilisiert. Nach dieser Art wurden die Pentamere 1-7 mit Variation der Kupplungszeiten, der Entschützungszeiten, sowie der Verwendung von HOBt synthetisiert. Die verschiedenen Synthesebedingungen der einzelnen Pentamere sind in Tabelle 1 aufgelistet. Eine mittels HyperChemTM berechnete Struktur des Pentamers ist in Abbildung 12 gegeben.
Abbildung 12: Berechnete Struktur des Pentamers mittels HyperChemTM.
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Tabelle 1: Synthesebedingungen der einzelnen Pentamere.
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3.1.1 Strukturaufklärung der Pentamere
Zur Aufklärung der Struktur und Vergleich der verschiedenen Syntheserouten des Pentamers wurden NMR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Die 1 H-NMR-Spektren der einzelnen Pentamere sind im Anhang aufgeführt. Genutzt wurde 1D- sowie 2D-NMR-Spektroskopie. Zum Einstieg und zur genauen Zuordnung der Signale wurde zuerst das HSQC-Spektrum ausgewertet. Das Spektrum hat den Vorteil, dass analysiert werden kann welche 1 H-Signale mit welchen 13 C-Signalen korrelieren. In Abbildung 10 ist ein solches Spektrum von Pentamer 1 mit einer vollständigen Zuordnung dargestellt. Das nicht zugeordnete Signal bei 3.59 ppm ist auf den Methylester der Aminohexansäure zurückzuführen, welcher bei der Aufnahme des Peptides mit Methanol aus der sauren Abspalt-Lösung entstanden ist. Das dargestellte Spektrum zeigt den Alkylbereich, der NH- und Aromaten-Bereich wurde weggelassen, da hier lediglich die Signale des Phenylringes zu sehen sind.
Abbildung 13: HSQC-NMR (600 MHz, DMSOd6, 300 K) von Verbindung 1. Ausschnitt aus dem Alkylbereich des Spektrums zur Zuordnung der CH-Korrelation. Das nichtmarkierte Signal ist der Methylester des Pentamers, welcher durch Aufnahme der Abspalt-Lösung mit Methanol entstanden ist.
Anhand dieses Spektrums lässt sich mithilfe des COSY-Spektrums der Akyl-Bereich, welcher bereits vollständig zugeordnet ist, sowie der Aromaten- und der NH-Bereich zuordnen. Das COSY-Spektrum stellt skalare Spin-Spin-Kopplungen als Kreuzsignale zwischen vicinalen Kernen dar. Daher lassen sich anhand des COSY-Spektrums die Kopplungen zwischen -H und -H, -H und -H, etc. herauslesen. Dies ist im Folgenden in den Abbildungen 14 und 15 für den Amin- -CH-Bereich und den Alkyl-Bereich dargestellt.
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Abbildung 14: COSY-NMR (600 MHz, DMSOd6, 300 K) von Verbindung 1. Ausschnitt des Spektrums zur Darstellung der Kopplungen zwischen den -H und NH-Protonen, sowie der Kopplungen einiger Signale im Alkyl-Bereich.
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Abbildung 15: COSY-NMR (600 MHz, DMSOd6, 300 K) von Verbindung 1. Ausschnitt des Alkylbereichs des Spektrums zur Darstellung der Kopplungen zwischen -H, -H, -H, -H und -H-Protonen.
Anhand der Auswertung eines ROESY-Spektrums kann über die Struktur des Peptides in gewissem Maß eine Aussage getroffen werden. Es ist möglich diastereotope Protonen als pro R oder pro S anhand eines konformationellen Austauschs zuzuordnen. Dabei erfolgt eine Kopplung der Kerne über den Raum. In Abbildung 16 sind Ausschnitte eines solchen Spektrums dargestellt, durch welche die pro R - und pro S -Zuordnung der diastereotopen Protonen der -CH2-Gruppe des Phenylalanins, sowie des Methionins möglich ist.
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Abbildung 16: ROESY-NMR (600 MHz, DMSOd6, 300 K) von Verbindung 1. Darstellung der
diastereotopen -CH2-Protonen des Methionins, für die Zuordnung von pro R, sowie pro S Signalen.
Aufgrund der vorhandenen Kopplung des -CH-Met-Protons mit dem -CHTieffeld- Methionin lässt sich auf einen konformationellen Austausch schließen. Daraus folgt, dass das Molekül an dieser Stelle eine Vorzugskonformation einnimmt, wodurch eine Zuordnung von pro R, bzw. pro S möglich wird. Aufgrund des vorgegebenen Stereozentrums an der -CH-Position lässt sich sagen, dass das tieffeldverschobene Proton eine pro S und das hochfeldverschobene eine pro R Konfiguration besitzt. Analog dazu kann die -CH2-Gruppe des Phenylalanins analysiert werden. Das tieffeldverschobene Proton ist in diesem Falle pro R konfiguriert und das hochfeldverschobene demnach pro S. Die entsprechende Kopplung, welche den konformationellen Austausch signalisiert ist in Abbildung 17 dargestellt.
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Abbildung 17: ROESY-NMR (600 MHz, DMSOd6, 300 K) von Verbindung 1. Darstellung der diastereotopen -CH2-Protonen des Phenylalanins für die Zuordnung der pro R und pro S Konfiguration.
3.1.2 Ergebnisse und Vergleich der Syntheserouten
Um die verschiedenen Syntheserouten vergleichen zu können, wurden zunächst NMR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Dazu wurden die Synthesen exakt auf die gleiche Art und Weise durchgeführt und die Peptide exakt gleich behandelt. Dadurch wurde eine Konstanz gewährleistet, sodass nur die Abweichungen, welche durch Veränderungen der Syntheseparameter entstehen, gemessen werden. In der nachfolgenden Abbildung 18 sind die Pentamere 1-7 zusammen aufgetragen und ein direkter Vergleich ist möglich. Besonders markant sind die Nebenprodukte bei 0.92 ppm, im -CH-Bereich sowie im NH-Bereich, welcher in Abbildung 19 ebenfalls zusammengefasst für alle Pentamere dargestellt ist.
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Abbildung 18: 1 NMR-NMR (600 MHz, DMSOd6, 300 K) Darstellung der 1H-NMR Spektren aller Pentamere 1-7 im direkten Vergleich. Die Verunreinigung bei 5.76 ppm ist auf noch vorhandenes Dichlormethan zurückzuführen.
An dieser Zusammenstellung ist erkennbar, dass die Kupplungen mit HOBt (1-3) bei jeder Verkürzung der Kupplungszeit mehr Fehlkupplungen aufweisen. Besonders bei einer Kupplungszeit von nur 20 min sind die Kupplungen noch unvollständig, aktive Stellen verbleiben und reagieren erst bei der nächsten bzw. übernächsten Kupplung. Hingegen funktionieren die Synthesen ohne HOBt (4-7) sehr gut. Selbst bei einer Kupplungszeit von nur 10 min laufen die Synthesen ohne große Fehlkupplungen und mit erhöhter Ausbeute ab. Erst bei einer Verkürzung der Entschützungszeit auf ca. dreieinhalb Minuten treten Fehlkupplungen auf.
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Abbildung 19: Darstellung des NH-Bereichs mit Fehlkupplungen als Dublett. Rot markiert sind aufgetretene Fehlkupplungen.
Das bereits in der Einleitung angesprochene Problem der Racemerisierung bzw. Epimerisierung der Peptide in Lösung, sowie bei der Synthese der Peptide wurde im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls untersucht. Dafür wurde von jedem Pentamer eine 4.5 mg/mL Lösung in Ethanol Uvasol® hergestellt und der optische Drehwert gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2: Messung des optischen Drehwertes der einzelnen Pentamere in Ethanol.
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Die gemessenen Werte hängen sehr stark von der jeweilig herrschenden Temperatur während der Messung ab. Zusätzlich schwanken die Werte und sind nur in einem bedingten Maße reproduzierbar. Allgemein lässt sich ein leichter Trend bei einer Wellenlänge von 589 nm bei den Pentameren 1-3 und 4-7 erkennen. Erstere haben im Durchschnitt einen etwas höheren Drehwert und wurden mit Zugabe von HOBt synthetisiert. Die Pentamere 4-7 weisen einen geringeren Drehwert auf und wurden ohne Zugabe von HOBt synthetisiert. Daraus lässt sich schließen, dass durch die Zugabe, oder den Verzicht von HOBt die Racemerisierung/Epimerisierung stark beeinflusst wird.
3.2 Mikrowellensynthese des Pentamers
Im Rahmen der Optimierung der SPPS wurde eine modernere Methode zur Synthese von Peptiden verwendet, indem die Reaktion während der Kupplung Mikrowellenstrahlung ausgesetzt wurde. Dabei sollen Kupplungszeiten von nur 2 min mit hohen Ausbeuten, sowie geringen Fehlkupplungen möglich sein. Das Prinzip bei der Nutzung von Mikrowellenstrahlung bei der Synthese von Peptiden beruht zu einem Teil auf der Aufhebung von intermolekularer Aggregation, sowie auf der Aufhebung von Sekundärstrukturen. Somit entsteht eine geringere sterische Hinderung bei den Kupplungen (siehe Abbildung 20). Desweiteren wird die Reaktion beschleunigt, indem sie erwärmt wird.[14]
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Abbildung 20: Einwirkung von Mikrowellenstrahlung auf einzelne Peptidstränge am Harz. Dadurch erfolgt die Aufhebung von intramolekularer Aggregation und Sekundärstrukturen.[14]
In dieser Testreaktion wurde das beladene Harz mit der jeweiligen Aminosäure/HBTU/DMF-Lösung in ein mikrowellengeeignetes Gefäß gegeben und für 2 min bei 110 °C mit einer Leistung von 300 W behandelt. Die verwendete Labormikrowelle ist in Abbildung 21 dargestellt. Die Entschützung erfolgte wie in den anderen Synthesen mit 1 min und 10 min in 25% Piperidin in DMF. Bei der Synthese wurde kein Produkt erhalten, da die Temperatur mit 110 °C zu hoch eingestellt war, und die Mikrowelle bis 140 °C aufgeheizt hat. Dadurch wurde sämtliches Peptid, welches sich noch am Harz befand, pyrolysiert. Dieser Vorgang konnte durch starke Braunfärbung
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Abbildung 21: Für Reaktion verwendete Labormikrowelle CEM Discover.[14]
des Harzes nach der Kupplung beobachtet werden. Weitere Synthesen und eine Optimierung der Reaktion wurden aufgrund von zeitlichen Gründen nicht durchgeführt.
4. FILAGGRINE - SYNTHESE & STRUKTURAUFKLÄRUNG
4.1 Automatisierte Synthese der Filaggrin-Derivate 8-10
Bei der automatisierten Synthese von Peptiden am Harz liegt der Vorteil darin, dass die aufwendigen Waschschritte und das Zugeben der Reaktions-Lösungen über eine Spritze stattfinden. Dadurch wird es möglich lange Peptidsequenzen wesentlich schneller zu synthetisieren, als es eine manuelle Synthese erlaubt.
Die Synthesen laufen analog zur bereits besprochenen manuellen Synthese ab, und zwar über Fmoc-Strategie und als polymerer Träger wird erneut 2-Chlorotrityl-Chlorid-Harz verwendet. Die Beladung erfolgt bei den Filaggrin-Peptiden mit Fmoc-L-Ser(tBu)-OH und wird ebenfalls analog zur manuellen Synthese durchgeführt. Zur Vermeidung von Nebenreaktionen werden nur Aminosäuren eingesetzt, welche zusätzlich reversibel an den Seitenketten geschützt sind.
Bei der automatisierten SPPS wird vorerst die Fmoc-Gruppe abgespalten, sodass der N-Terminus freigesetzt wird. Die nächste Aminosäure wird in Lösung mit HOBt, HBTU und DIPEA auf das beladene Harz gekuppelt. Dieser Schritt wird nach einem Waschvorgang wiederholt, ein sogenanntes Doublecoupling wird durchgeführt. Dies soll eine höhere Sicherheit gewährleisten, sodass alle aktiven Stellen gekuppelt werden. Die vollständig gekuppelte Aminosäure wird anschließend, nach ausgiebigem Waschen, mit Piperidin entschützt und das Schema wiederholt bis das gewünschte Peptid synthetisiert ist.
Nach Beendigung der automatisierten Synthese wurde das Peptid manuell mit einer Abspalt-Lösung aus TFA/H2O/Phenol/TIPS (87.5:5:5:2.5) vom Harz abgespalten. Die Abspalt-Lösung wurde in kaltem abs. Diethylether gefällt, gewaschen und lyophilisiert. Die Peptide 8-10 wurde dieserart synthetisiert.
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Abbildung 22: Sequenzen der synthetisierten Filaggrin-Peptide. Die Peptide 8 und 9 sind native Filaggrine, das Peptid 10 ist eine zweifache L-Alanin-Mutante an den Stellen 4. und 17.
[...]
- Citation du texte
- BSc. Matthias Lamping (Auteur), 2010, Optimierung der Festphasenpeptidsynthese und deren direkte Anwendung bei der Synthese von Filaggrin-Peptiden, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/204020
