Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz. Dabei wurde von Proben mit einem Fettsäuregemisch ausgegangen und somit die HOLO-Form des Proteins untersucht. Der Einsatz von mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie zur Bestimmung von Abstandsrandbedingungen, stereospezifischen Zuordnungen und Diederwinkeln aus 3J-Kopplungskonstanten ermöglichte die Verwendung von 1877 Abstandsrandbedingungen, 52 stereospezifischen Zuordnungen und 81 Diederwinkelbeschränkungen. Die Struktur basiert im Schnitt auf 15 geometrischen Beschränkungen je Aminosäurerest. Mit einem mittleren globalen RMSD-Wert der Rückgratatome von 1,07±0,15 Å und den relativ niedrigen berechneten Energiewerten sind die Ansprüche an eine hochaufgelöste Struktur erfüllt. Vergleiche mehrerer struktureller Kriterien mit 160 Proteinkristallstrukturen haben ergeben, daß die hier bestimmte Lösungsstruktur in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit einer Auflösung von etwa 2,4 Å entspricht.
Die Molekulardynamiksimulation der energetisch niedrigsten Lösungsstruktur in einer Wassersimulation führte anfangs zu einer raschen Konformationsänderung der Struktur. Diese war gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des als Eingangsportal für den Fettsäureliganden postulierten Bereiches. Zugleich wurden zwei weitere kleine Öffnungen erkennbar, welche als Austrittsöffnungen für Wassermoleküle dienen könnten.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1. Die Familie der Lipidbindungsproteine
1.2. Die Struktur des H-FABPs aus Rinderherz
2. Theorie und Methoden
2.1. Kern-Overhauser–Effekt
2.2. Diederwinkel
3. Proteinstruktur in Lösung
3.1. Distanzgeometrierechnungen
3.2. REDAC Strategie
3.3. DYANA
3.4. Energieminimierung
3.5. Molekulardynamik
3.5.1. LINCS-Algorithmus
3.5.2. Periodische Randbedingungen
3.5.3. Das Kraftfeld
4. Ergebnisse und Diskussion
4.1. Distanzgeometrierechnungen
4.2. Molekulardynamikrechnung
4.3. Schlußfolgerungen
5. Zusammenfassung
6. Literatur
A. Anhang
A.1. Chemische Verschiebungen
A.2. Stereospezifische Zuordnungen
A.3. Diederwinkel
A.4. NOE-Abstandsliste
A.5. Parameterset für die Molekulardynamik
Zielsetzung und Themen
Die vorliegende Dissertation hat zum Ziel, die Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des H-FABPs aus Rinderherz mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie zu bestimmen und durch Molekulardynamiksimulationen die Dynamik des Proteins unter realistischen Bedingungen zu untersuchen.
- Bestimmung der Tertiärstruktur durch NMR-Experimente und Distanzgeometrierechnungen.
- Optimierung der Proteinstruktur durch Einbeziehung von Diederwinkeln aus 3J-Kopplungskonstanten.
- Simulation der Dynamik in wäßrigem Medium unter Berücksichtigung von Gegenionen.
- Anwendung der REDAC-Strategie zur Verbesserung der Strukturberechnung bei Faltblatt-Strukturen.
- Analyse von Konformationsänderungen und Bindungsmechanismen (Selected-Fit-Modell).
Auszug aus dem Buch
3.2. REDAC Strategie
Da Distanzgeometrieberechnungen mit dem Programm DIANA viel Rechenzeit beanspruchen und bei Proteinen mit umfangreicher β-Faltblattstruktur nur unzureichend konvergieren, wurde 1991 die sogenannte REDAC-Strategie („redundant dihedral angle constraints“) entwickelt [79] (siehe Abbildung 7). Dabei handelt es sich um eine Methode, die Winkeleinstellungen bereits berechneter Strukturen als zusätzliche Randbedingungen in eine neue Rechnung zu übernehmen.
Im einem „normalen“ DIANA-Lauf werden n Startkonformere mit zufällig gewählten Diederwinkeln ausgewählt, die dann einer DIANA-Minimierung gegen die experimentell bestimmten Strukturbeschränkungen (B(0)) unterzogen werden. Für gut konvergierende Strukturlösungen kann die Zielfunktion noch weiter gesenkt werden, indem man mit der REDAC-Strategie mehrere DIANA-Zyklen durchläuft.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Dieses Kapitel führt in die Familie der Lipidbindungsproteine (FABPs) ein und beschreibt die biologische Relevanz sowie die Struktur des H-FABPs aus Rinderherz.
2. Theorie und Methoden: Hier werden die theoretischen Grundlagen der NMR-Spektroskopie, insbesondere der Kern-Overhauser-Effekt und die Bedeutung von Diederwinkeln, erläutert.
3. Proteinstruktur in Lösung: Dieses Kapitel beschreibt detailliert die Methoden zur Strukturbestimmung, einschließlich Distanzgeometrie, REDAC-Strategie, DYANA-Algorithmus, Energieminimierung und Molekulardynamik.
4. Ergebnisse und Diskussion: Hier werden die durchgeführten Berechnungen zur Lösungsstruktur und deren Verfeinerung präsentiert sowie die Ergebnisse der Molekulardynamiksimulationen diskutiert.
5. Zusammenfassung: Dieses Kapitel bietet einen abschließenden Überblick über die Arbeit und die erzielte Güte der Strukturbestimmung im Vergleich zu Kristallstrukturen.
6. Literatur: Auflistung der im Rahmen der Arbeit verwendeten wissenschaftlichen Quellen.
A. Anhang: Enthält ergänzende Tabellen zu chemischen Verschiebungen, stereospezifischen Zuordnungen, Diederwinkeln, Abstandslisten und MD-Parametern.
Schlüsselwörter
H-FABP, Rinderherz, NMR-Spektroskopie, Molekulardynamik, Proteinstruktur, Lipidbindungsproteine, Distanzgeometrie, REDAC-Strategie, β-Faltblatt, Torsionswinkel, Strukturverfeinerung, Fettsäurebindung, Apo-Form, Holo-Form.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung und Verfeinerung der Lösungsstruktur der rekombinanten pI=5,1 Isoform des Herz-Fettsäurebindungsproteins (H-FABP) aus Rinderherz.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Zentrale Themen sind die dreidimensionale Strukturbestimmung von Proteinen, NMR-spektroskopische Analysemethoden und die Anwendung von Molekulardynamiksimulationen zur Untersuchung von Proteinbewegungen in Lösung.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das primäre Ziel ist die präzise Bestimmung der Tertiärstruktur von H-FABP und das Verständnis seiner Dynamik, um Mechanismen der Fettsäurebindung in diesem Protein aufzuklären.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?
Verwendet werden mehrdimensionale NMR-Spektroskopie, Distanzgeometrieberechnungen (DIANA/DYANA), Energieoptimierungen sowie Molekulardynamiksimulationen unter realistischen Bedingungen.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil befasst sich mit der methodischen Vorgehensweise bei der Strukturberechnung, der Anwendung der REDAC-Strategie zur Verfeinerung der Struktur sowie der Durchführung und Interpretation von Molekulardynamik-Trajektorien.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit lässt sich unter anderem durch Begriffe wie H-FABP, NMR-Spektroskopie, Molekulardynamik, Strukturverfeinerung und Lipidbindungsproteine charakterisieren.
Warum ist die REDAC-Strategie für H-FABP besonders relevant?
H-FABP besitzt eine ausgeprägte β-Faltblattstruktur. Die REDAC-Strategie verbessert hierbei die Konvergenz der Strukturberechnungen und führt zu physikalisch sinnvolleren Strukturen, indem sie redundante Winkelrandbedingungen nutzt.
Was lässt sich aus der Molekulardynamiksimulation ableiten?
Die Simulation zeigt, dass sich die HOLO-Form des Proteins bei Abwesenheit einer Fettsäure in der Startstruktur in Richtung einer APO-ähnlichen Form umlagert, was mit einer Öffnung des Eintrittsportals für Fettsäuren einhergeht.
- Citation du texte
- Thorsten Brandau (Auteur), 2000, Bestimmung der Lösungsstruktur von H-FABP aus Rinderherz mit mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie und Molekulardynamiksimulation, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/227
