Biochemie IV. Lernzusammenfassung

BC IV NOTIZEN

I Freund: NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

1. VL Introduction to protein NMR spectroscopy I

Die Frequenz, mit der die Magnetisierung um das B0-Feld präzessiert, ist exakt dieselbe wie die Frequenz des Peaks im Spektrum!

Gutes Ergebnis hängt ab von: hohem γ (Isotopenanreicherung, 1H), hohem B0, niedrige T

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Rotating frame transformation: Koordinatensystem rotiert formal mit der Lamorfrequenz der Magnetisierung (rotating frame statt laboratory frame), um einen statischen Vektor zu haben, der sich leichter handhaben lässt. Radiofrequenzpulse (RF-Pulse) von 90° verschiebt die Magnetisierung von der z-Achse (longitudinal) in die xy-Ebene (transversal). Transversale Magnetisierung resultiert in einem Free induction decay (FID, gedämpfte Schwingung) signal.

Relaxationsprozesse

Die T1-Relaxation (longitudinal, Spin-Gitter-Relaxation) ist der Prozess der Rückkehr der

Kernspins vom angeregten Zustand zum thermischen Gleichgewicht unter Abgabe der bei der Anregung aufgenommenen Energie als Wärme.

Die T2-Relaxation (transversal, Spin-Spin-Relaxation) ist die Dephasierung der

Transversalmagnetisierung durch Abgabe von Energie an einen Kern im Grundzustand. In der Summe wird keine Energie an die Umgebung abgegeben, aber die Transversalmagnetisierung läuft von einem Vektor zunächst zu einem Fächer und zuletzt zu einer Kreisfläche auseinander (veränderte Phasenkohärenz), so dass erst ein schwächeres und dann kein NMRSignal mehr in der Detektionsspule induziert wird. Die praktische Bedeutung der Spin-Spin- Relaxationzeit liegt in der Linienbreite den NMR-Peaks.

Chemische Verschiebung (individuelle chemische Umgebung)

Durch Nachbarschaft von elektronenreichen (aromatischen  Abschrimung: Hochfeld) oder - armen (aliphatischen  Entschirmung: Tieffeld) Strukturen können Phasenverschiebungen auftreten, welche sich auf Mxy und damit auf die Resonanzfrequenz-Peaks auswirken.

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Kopplung

Die Kopplungskonstante J bewirkt, dass sich Signale aufspalten, und führt so zur scheinbaren Gegenrotation zweier Mxy Vektoren. Das liegt daran, dass das Koordinatensystem mit der Anregungsfrequenz rotiert und die beiden Vekoren jeweils mit - oder + J/2 laufen, wodurch einer langsamer und einer schneller rotiert als das Koordinatensystem.

Refokussierung

180° Puls auf N wichtig!! Dadurch werden Drehrichtung und Geschwindigkeit der H-Vektoren vertauscht!! Würde man die Refokussierung nicht machen, würden die Vektoren nach 1/(2J) aufgrund der chemischen Verschiebung nicht exakt in Antiphase sein.

Durch die Refokussierung wird man die Unterschiede durch die chemische Verschiebung los, erhält aber die Kopplung.

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2D-verschiebungskorrelierte-NMR-Spektren

Präparation: transversale Magnetisierung, Übertragung auf einen anderen Kern Evolution: t1

Mischphase, Rückübertragung der Magnetisierung Datenaufnahme: t2 Registrierung des FID

Ablauf: Es werden 2n (n ≥ 5) 1D-NMRs gemacht, bei jeder Messung wird t1 um Δt erhöht. Die FID-Serie wird bzgl. t2 Fourier-transformiert, man erhält eine Serie von 1D Spektren. Aus jedem der n Spektren werden jeweils die ersten, zweiten, ..., n-ten Punkte zu FIDs zusammengefasst und erneut Fourier-transformiert, dieses mal bezüglich t1. Das Ergebnis ist ein zweidimensionales Frequenzspektrum.

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HSQC (heteronuclear single quantum coherence)

Zweidimensionale Methode, bei der chemische Verschiebungen unterschiedlicher miteinander skalar koppelnder Kerne korreliert werden. Die HSQC-Spektren sind häufig recht übersichtlich, da gewöhnlich nur Signale von direkt aneinander gebundenen Atomen erscheinen. Ein typisches Beispiel ist die 1H,1⁵ N-Korrelationen -NH-Protein-Backbone.

1. M agnetization transfer to nitrogen by INEPT 90° Puls auf H, H-Vektor klappt von z-Achse in xy-Ebene. 1/(4J) warten, dann Refokussierung mit zwei 180° Pulsen, je einer im H- und einer im N-Kanal (Erhalt der J-Kopplung!). Wieder 1/(4J) warten, bis die H-Vektoren in Antiphase sind (nur dann kann die maximale Magnetisierungübertragen werden). Dann auf jedem Kanal einen 90° Puls zur Übertragung der Magnetisierung von H auf N. Die H Vektoren klappen auf die z-Achse, die N-Vektoren in die xy-Ebene.
2. Evolution of nitrogen magnetization (t1) Man wartet in jedem der mehreren NMR Experimente eine unterschiedliche Zeit t1, in der die N-Vektoren aufgrund ihrer chemischen Verschiebung unterschiedliche schnell und damit weit laufen. 180°-Puls entkoppelt H und N.
3. Magnetization transfer back to protons by reverse INEPT Da die Ns immer unterschiedlich weit auf der Kreisbahn rotieren, wird immer eine unterschiedliche Menge an Magnetisierung auf die H-Vektoren zurückübertragen.
4. Second time domain during acquisition

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2. VL Introduction to protein NMR spectroscopy II

Homonukleare 2D-Spektren (für Valin) TOCSY (innerhalb einer Aminosäure) COSY (nur direkt benachbarte Hs) NOESY (Kopplung über polare WW durch den Raum) NOE = Nuklear Overhauser-Effekt 1/r⁶ -bis 5 Å räumliche Nähe NOESY und TOCSY können mit HSQC kombiniert werden. Achtung: 180°-Puls auf N zur Refok.

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