Im folgenden Versuch wurden die Oligosaccharidketten A und B des Glykoproteins Thyroglobulins vom Rind durch Proteolyse mit Pronase E isoliert. Der Verdau des Proteinanteils wurde mittels Ninhydrintest und SDS-PAGE verfolgt. Die Zuckerketten wurden durch Größenausschlusschromatographie (engl. Size exclusion chromatography, SEC) mithilfe einer FPLC-ÄKTAprime-Säule von den freien Aminosäuren und Peptiden abgetrennt. Anschließend wurden die Oligosaccharidketten A und B mittels Ionenaustauschchromatographie (engl. Ion exchange chromatography, IEC) voneinander getrennt. Abschließend wurden die quantitativen Zusammensetzung der Ketten mittels Neutralzuckertest und Sialinsäuretest analysiert.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Enzymatische Proteolyse von Thyroglobulin
2.1.2 Diskontinuierliche SDS-PAGE nach Laemmi
2.1.3 Ninhydrintest
2.1.4 Größenausschlusschromatographie
2.1.5 Ionenaustauschchromatographie
2.1.6 Neutralzuckernachweis
2.1.7 Sialinsäurenachweis
2.2 Methoden
2.2.1 SDS-PAGE
2.2.2 Ninhydrintest
2.2.3 Größenausschlusschromatographie mittels FPLC-ÄKTAprime
2.2.4 DEAE-Anionenaustauschchromatographie
3 Ergebnisse
3.1 Proteolyse
3.2 Proteinbestimmung nach Bradford
3.3 SDS-PAGE
3.4 Enzymaktivitätstest
3.5 Reinigungstabelle
4 Diskussion
4.1 Kationenaustauschchromatographie
4.2 Proteinbestimmung nach Bradford
4.3 SDS-PAGE
4.4 Enzymaktivität
4.4.1 Zusammenfassung
5.1 Beispielrechnungen
5.2 Rohdaten
5.2.1 Proteinbestimmung nach Bradford
5.2.2 Enzymaktivitätstest
Zielsetzung & Themen
Ziel des Versuchs ist die quantitative Untersuchung der Oligosaccharidketten (Typ A und B) des Thyroglobulins vom Rind. Dabei soll durch verschiedene biochemische Trenn- und Analysemethoden das Protein aufgereinigt und die Zusammensetzung der Zuckerketten nach der Proteolyse und chromatographischen Trennung bestimmt werden.
- Enzymatische Proteolyse von Glykoproteinen
- Aufreinigung mittels Größenausschlusschromatographie (SEC)
- Trennung von Zuckerketten mittels Anionenaustauschchromatographie (IEC)
- Qualitative und quantitative Analyse der Proteine durch SDS-PAGE und Bradford-Test
- Bestimmung der Enzymaktivität und Erstellung einer Reinigungstabelle
Auszug aus dem Buch
2.2.1 SDS-PAGE
Die Gelelektrophorese ist eine essentielle Methode zur Auftrennung und Identifizierung verschiedener Moleküle anhand ihrer Ladung und ihrer molekularen Masse. Eine spezielle Variante ist die diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (engl. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, kurz SDS-PAGE). Das Gel ist ein Polymerisat aus Acrylamid und dem Quervernetzer N,N’-Methylenbisacrylamid. Für die Polymerisation wird ein Radikalstarter, z.B. Ammoniumpersulfat (APS), sowie ein Katalysator, z.B. Tetramethylethylendiamin (TEMED) benötigt. Diese Komponenten werden als letztes in den Ansatz gegeben, um eine frühzeitige Polymerisation im Tube zu verhindern.
Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE handelt sich um ein vertikales Gel, welches aus einem Sammel- und einem Trenngel besteht. Zunächst wird das Trenngel gegossen und mit Wasser überschichtet, um die Oberfläche zu glätten und den Abbruch der Polymerisation durch Luft zu verhindern. Nachdem das Trenngel auspolymerisiert ist, wird das Wasser vorsichtig entfernt, dass Sammelgel auf das Trenngel gegossen und ein Kamm eingesteckt. Das Sammelgel weist einen höheren pH auf und ist durch den geringen Acrylamidgehalt großporiger als das Trenngel. Es dient der Aufkonzentrierung der Probe vor dem Eintritt in das Trenngel.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Beschreibt die Grundlagen der Proteinglykosylierung und die Zielsetzung der Untersuchung der Oligosaccharidketten von Thyroglobulin.
2 Material und Methoden: Listet die verwendeten Reagenzien, Geräte sowie die detaillierten Protokolle für die durchgeführten biochemischen Analysen auf.
3 Ergebnisse: Präsentiert die experimentellen Daten aus der Proteolyse, der SDS-PAGE, dem Bradford-Test und der Enzymaktivitätsmessung in Tabellen und Grafiken.
4 Diskussion: Analysiert die Versuchsergebnisse kritisch, bewertet Fehlerquellen bei der Durchführung und ordnet die Reinheitsgrade der Proben ein.
Schlüsselwörter
Thyroglobulin, Proteolyse, SDS-PAGE, Ninhydrintest, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, FPLC, Bradford-Test, Glykosylierung, Enzymaktivität, Reinheitsgrad, Proteinaufreinigung, Sialinsäure, Neutralzucker, Bio-Rad Marker.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in diesem Praktikum?
Der Versuch befasst sich mit der Isolierung und Analyse von Oligosaccharidketten des Glykoproteins Thyroglobulin vom Rind durch enzymatische Proteolyse und verschiedene chromatographische Verfahren.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themenfelder sind die Glykobiochemie, die chromatographische Trennung von Molekülen basierend auf Größe und Ladung sowie die quantitative Proteinanalytik.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das primäre Ziel ist die quantitative Bestimmung der Zusammensetzung der beiden unterschiedlichen Oligosaccharidketten A und B des Thyroglobulins.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden angewendet?
Es werden Methoden wie die diskontinuierliche SDS-PAGE zur Charakterisierung, die Größenausschlusschromatographie (SEC) und die DEAE-Anionenaustauschchromatographie (IEC) zur Trennung sowie der Bradford-Test zur Konzentrationsbestimmung genutzt.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil deckt die detaillierte Beschreibung der Materialien, die Durchführung der enzymatischen Verdauung, die Aufreinigung, die elektrophoretische Charakterisierung sowie die enzymatische Aktivitätsmessung ab.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Die Arbeit lässt sich am besten durch Begriffe wie Glykoprotein-Analyse, Ionenaustauschchromatographie, SDS-PAGE und Protein-Reinigung beschreiben.
Warum wurde eine SDS-PAGE nach Laemmli durchgeführt?
Die Methode nach Laemmli wurde gewählt, um die Proteine nach ihrer molekularen Masse aufzutrennen und so den Erfolg der Proteolyse und die Reinheit des Lysozyms qualitativ zu beurteilen.
Welchen Einfluss hatte der "kaputte Kamm" auf das Experiment?
Der defekte Kamm führte dazu, dass Taschen im Gel verschmolzen, was das Probenauftragen erschwerte und in einigen Fällen zu Probenverlusten oder unerwünschten Artefakten im Gel führte.
Wie wurde mit den Abweichungen im Bradford-Test umgegangen?
Da die eigene Eichgerade Ausreißer aufwies, wurde auf Anweisung des Betreuers die Eichgerade einer anderen Gruppe verwendet, um die Konzentrationsbestimmungen der Fraktionen zu validieren.
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- Anonym (Autor), 2012, Quantifizierung der Oliosaccharidketten A und B des Thyroglobulins vom Rind, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/278392
