Die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Polyphenolen

Inhaltsverzeichnis

1. EINLEITUNG
1.1 POLYPHENOLE
1.1.1 BIOVERFÜGBARKEIT UND STOFFWECHSEL
1.1.2 ERNÄHRUNGSPHYSIOLOGIE
1.2 PROTEINE
1.2.1 PROTEINFÄLLUNG
1.2.2 PROTEINDENATURIERUNG
1.2.3 LYSOZYM

2. ZIEL DER DIPLOMARBEIT

3 MATERIAL UND METHODE
3.1 MATERIALIEN
3.2 METHODEN
3.2.1 CHROMATOGRAPHIE
3.2.2 HPLC (HIGH PRESSURE LIQUID CHROMATOGRAPHY)
3.2.3 MASSENSPEKTROMETER (MS)

4 VERSUCHSBESCHREIBUNG
4.1 ANSATZ I
4.1.1 REAKTION VON QUERCETIN MIT LYSOZYM UND BSA BEI 37°C UND 60°C
4.1.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN
4.1.3 ERGEBNIS
4.2 ANSATZ II
4.2.1 REAKTION VON QUERCETIN MIT LYSOZYM UND BSA BEI 60°C UND 80°C
4.2.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN
4.2.3 ERGEBNIS
4.3 ANSATZ III
4.3.1 REAKTION VON QU. MIT LYSOZYM UND HÄMOGLOBIN BEI 60°C UND 80°C
4.3.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN
4.3.3 ERGEBNIS
4.4 GEGENPROBE (1) DER ANSÄTZE I-III
4.4.1 LYSOZYM UND QUERCETIN BEI 60°C UND 80°C
4.4.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN (60°C UND 80°C)
4.4.3 ERGEBNIS
4.5 GEGENPROBE (2) DER ANSÄTZE I-III
4.5.1 GELELEKTROPHORESE (SDS-GELE)
4.5.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN
4.5.3 ERGEBNIS
4.6 GEGENPROBE (3) DER ANSÄTZE I-III
4.6.1 VORVERSUCHE (AUSSCHLUSSPRINZIP)
4.6.2 REINIGUNG DER SÄULE
4.6.3 AUFBEREITUNG DER PROBEN
4.6.4 ERGEBNIS
4.7 ÜBERPRÜFUNG DER METHODE VON HARSHADRAI M. RAWEL ET.AL. (2000)
4.7.1 MOTIVATION FÜR DIESE ÜBERPRÜFUNG
4.7.2 AUFBEREITUNG DER PROBEN
4.7.3 ERGEBNIS

5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION
5.1 FRAGESTELLUNGEN
5.2 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE

6. LITERATUR

7. ANHANG
7.1 ABKÜRZUNGEN
7.2 NORMIERTE WERTE (MULTIPLIKATIONSFAKTOR 3,45)
7.3 METHODEN

Zusammenfassung

Würde Quercetin bei höheren Temperaturen an ein Protein binden, so würde es für den Stoffwechsel nicht mehr zur Verfügung stehen und damit die positive Wirkung z.B auf Herz-Kreislauf verlieren.

Die hier durchgeführten Experimente hatten zum Ziel, Informationen über die Stabilität von Quercetin zu erhalten. Ein möglicher Abbau kann durch kovalente Bindungen des Quercetins an das Protein erfolgen. Als Modell wurde die Reaktion von Quercetin mit Lysozym untersucht.

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Stabilität sowohl von Quercetin als auch von Lysozym nach thermischer Behandlung bei 60°C gegeben ist. Nach thermischer Behandlung bei 80°C kommt er zu einer Reaktion von Quercetin und Lysozym wobei bei entstehen. Bei der Reaktion von Quercetin mit Lysozym entstanden ebenfalls Produkte.

Die Analysen haben ergeben das bei 80°C Reaktionen stattfinden. Als nächster Schritt wäre die quantitative Analyse und die Wiederholung der Versuche wichtig. Im Anschluß wäre zu prüfen, ob bei 80°C Quercetin abgebaut wird oder ob es zu Bindungen zwischen den Reaktionspartnern kommt. In weiterer Folge wäre die Identifizierung der entstandenen Produkte zu klären.

Abstract

Since several years it is assumed, that quercetin in food has an positiv impact on human health.

The aim of the experiments was to find out detailet information about the quercetin stability after thermal treatment on an qualitative level. Lowered quercetin concentration could be caused through covalent quercetin-protein binding. Exemplary, quercetin-lysozym reactions have been invastigated.

It can be concluded, that quercetin as well as lysozym shows stadle concentrations after thermal treatment at 60°C. At 80°C, the experimental results shows a decreased concentration of quercetin and lysozym as well. The results shows clearly a chemical reaction between both substances because a new substance has been detected.

Future work have to be focused on a more quantitative level of experiments to verify the results mentioned above. In this way, quercetin-lysozym reactions have to be separated from possible denaturation effects and exact determination of new reaction products should be done.

1. Einleitung

Primäre Pflanzenstoffe (z.B Kohlenhydrate) als auch Sekundäre Pflanzenstoffe (z.B Polyphenole) sind für die Ernährung des Menschen von großer Bedeutung. Die Sekundären Pflanzenstoffe spielten lange Zeit neben den Vitaminen und Mineralstoffen eine untergeordnete Rolle. Erst jetzt erkennt man die Wichtigkeit der sekundären Pflanzenstoffe indem man ihnen gesundheitsfördernde Eigenschaften und Schutzfunktionen zuschreibt. Zum Beispiel hemmen Polyphenole das Wachstum von Bakterien und Viren und schützen den Körper vor freien Radikalen.

Weit über 250 epidemiologische Studien belegen, dass ein hoher Gemüse- und Obstverbrauch sich auf viele Zivilisationskrankheiten positiv auswirkt. Dabei wurden die Essgewohnheiten von 265.118 Japanern überprüft. Die Studien ergaben eine Verringerung der Lebenserwartung von Rauchern um ca. 5 Jahre. Bei Studienteilnehmern die rauchten, regelmäßig Alkohol tranken und sich fleischreich und gemüsearm ernährten, lag die Lebenserwartung ca. 10 Jahre unter dem Durchschnitt. Die Krebs- oder Herzerkrankungen waren in dieser Gruppe deutlich erhöht.

Ein möglicher Gründe für die vorbeugende Wirkung von Obst und Gemüse ist vermutlich die Tatsache, das sekundäre Pflanzenstoffe freie Radikale fangen und diese unschädlich machen.

[http://www.atlantis-pharm.com/antioxi%20definition.htm; 08.Oktober 2003]

Freie Radikale sind instabile hochreaktive Atome oder Verbindungen, die mit organischen Molekülen der Zelle reagieren und sie so funktionsuntüchtig machen. Das Charakteristikum aller freien Radikale ist, dass sie ein ungepaartes Elektron besitzen oder ihnen eines fehlt. Sie versuchen überzählige Elektronen los zu werden oder eines einzufangen, den nur eine gerade Anzahl von Elektronen bewirkt einen stabilen Zustand. Ein einsames Elektron ohne Partner bedeutet eine hohe Reaktionsbereitschaft und ein aggressives Verhalten gegenüber anderen Molekülen. Trifft ein freies Radikal auf eine organische Verbindung (z.B ungesättigte Fettsäuren) wird es versuchen ein Elektron aufzunehmen oder abzugeben. Der unvollständige, ungerade Elektronenzustand des freien Radikals wird auf ungesättigte Fettsäuren übertragen. Die ungesättigte Fettsäure wird selbst zum Radikal. Die Aufgabe, z.B als Baustein der Zellmembran für einen stabilen Schutz nach außen zu wirken, geht verloren. Die ungesättigte Fettsäure versucht wieder ein Elektron aufzunehmen um wieder einen stabilen Zustand zu erreichen. So kommt eine Kettenreaktion zustande.

Die Anwesenheit von Polyphenolen stoppt diese Kettenreaktion und bewirkt, dass radikalische Elektronen eingefangen werden. Bei diesen ElektronentransferReaktionen werden die Polyphenole als Antioxidantien verbraucht und stehen für weitere Schutzreaktionen nicht mehr zur Verfügung. Polyphenole werden daher auch alsRadikalfänger bezeichnet.

[http://www.atlantis-pharm.com/antioxi%20definition.htm; 08.Oktober 2003]

1.1 Polyphenole

Zu den Polyphenolen zählt die Untergruppe der Flavonoide. Anhand struktureller Unterschiede am C6-C3-C6-Gerüst können die Flavonoide in 6 Gruppen eingeteilt werden:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Allen gemeinsam sind die drei Kohlenstoffringe mit 2 aromatischen (A und B) und einem O-heterozyklischen (C) Ring (siehe Abbildung am Beispiel Quercetin).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Flavonol - Quercetin

Flavonoide sind als Antioxidantien sowohl in hydrophilen als auch im lipophilen Systemen aktiv.

Folgende Eigenheiten in ihrer Struktur bedingen diese Fähigkeiten:

- vier bis sechs Hydroxylgruppen
- Das Doppelbindungssystem im C-Ring in Konjugation mit der Carboxylfunktion und der 3-Hydroxyfunktion
- o-Dihydroxyfunktion am B-Ring
- Die 3- und 5-Hydroxylgruppen am C-Ring bzw. A-Ring bringen eine zusätzliche Resonanzstabilisierung.

Quercetin vereint alle diese Anforderungen in einer Verbindung und ist damit eines der potentesten Antioxidantien in der Reihe der Polyphenole.

Die Aktivität variiert sehr stark innerhalb der Polyphenole und steigt mit der Anzahl der freien Hydroxylgruppen [Rice-Evans, 1996].

Der Flavonoidgehalt einer Pflanze hängt von der Sorte und vom regionalen Klima ab. Flavonoide befinden sich überwiegend in den Randschichten der Pflanzen sowie in den äußeren Blättern. Äpfel sollten deshalb nicht geschält und Tomaten nicht gehäutet werden [Watzl,2001].

1.1.1 Bioverfügbarkeit und Stoffwechsel

Studien zeigen, dass bestimmte Flavonolglukoside über einen aktiven Transport im Dünndarm absorbiert werden. Bei Ileostomie-Patienten (mit künstlichem Darmausgang) wurde nach oraler Zufuhr von Quercetinglukosid aus Zwiebeln indirekt eine doppelt so hohe Absorptionsrate ermittelt wie nach der Aufnahme von Quercetin. Bei Quercetin-4´-ȕ-glukosid konnte an Caco-2-Zellen nachgewiesen werden, dass es ein Substrat für den Na+ -abhängigen D-Glucose-Cotransporter SGLT1 ist. Allerdings werden die Glykoside infolge der Aktivität des Proteins MRP2 (Multidrug resistance protein) auf der apikalen Seite der Intestinalzellen wieder zu einem gewissen Grad aus der Zelle transportiert. Nun war klar, dass auch Flavonolglykoside von Dünndarmzellen absorbiert werden können [Watzl,2001].

Eine neuere Studie an Ilesostomie-Patienten zeigt, dass die Hydrolyse von Quercetinmono- und -diglukosiden bereits im Dünndarm erfolgt. Offensichtlich ist für die Absorptionsrate der Zuckerrest von Bedeutung. Denn nur Quercetinglukoside, jedoch nicht Quercetindisaccheride weisen in Dünndarm eine hohe Bioverfügbarkeit auf [Watzl,2001]

1.1.2 Ernährungsphysiologie

Mehrere epidemologische Studien haben ergeben, dass die Flavonoidaufnahme mit dem Sterblichkeitsrisiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen korreliert. Eine hohe Flavonoidaufnahme senkt das Risiko um etwa ein Drittel.

Auch besitzen Flavonoide antikanzerogene Wirkungen, z.B schützen sie vor Dickdarm-, Brust- und Hautkrebs. Offenbar hängt die antikanzerogene Wirkung von ihrer chemischen Struktur ab. Weiters können Flavonoide mit der DNA in Wechselwirkung treten. Da sie strukturelle Ähnlichkeiten mit Nucleotiden aufweisen, können sie sich an die DNA anlagern ohne sie zu schädigen. Sie maskieren die Bindungsstelle für Kanzerogene und schützen auf diese Weise die DNA [Watzl, 2001].

1.2 Proteine

- Proteine spielen in allen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle. Proteine haben folgende Funktionen:
- Enzymatische Katalyse
- Transport und Speicherung Koordinierte Bewegungen Mechanische Stützfunktion
- Erzeugung und Übertragung von Nervenimpulsen Kotrolle von Wachstum und Differenzierung

1.2.1 Proteinfällung

Proteine sind aufgrund ihrer Oberflächenladung in wässrigen Medium löslich. Wasserdipole ordnen sich in geordneter Weise um die Proteinstruktur an. In einer Proteinlösung hat das Wasser eine Hydrathülle um das Protein gebildet. Gibt man zu dieser Proteinlösung Salze zu, so binden Salzionen beim Lösungsvorgang Wasserdipole an sich. Wird die Salzkonzentration weiter erhöht, so werden ab einer bestimmten Konzentration des Salzes dem Protein die Wasserdipole entzogen. Die Hydrathülle des Proteins wird zerstört und das Protein fällt aus, da das Protein an seiner Oberfläche nicht mehr hydratisiert ist.

Um Proteine zu isolieren (z.B durch filtrieren oder zentrifugieren) ist eine Zerstörung der Hydrathülle notwendig.

[http://www.biologieausbildung.de/Protokolle%20Stoffwechsel.htm; 13.Mai 2003]

Die Entladung des Proteins kann man auf verschiedene Wege erzielen:

- Wärmezufuhr (Nachteil: Tertiärstruktur kann zerstört werden)
- pH-Veränderung (isoelektrischer Punkt)
- organische Lösungsmittel
- Ammoniumsulfat

1.2.2 Proteindenaturierung

Die Sekundär- und Tertiärstrukturen von Proteinen werden hauptsächlich durch hydrophobe Bindungen (Wasserstoffbrückenbindungen) stabilisiert. Bei Wärmezufuhr werden die Atomgruppen der Proteine in Schwingung gebracht wobei die Wasserstoffbrückenbindungen gelöst und Sekundär- und Tertiärstrukturen zerstört werden, die Stabilität verloren geht und das Protein ausflockt. Diese Denaturierung von Eiweiß durch Hitzeinfluss ist irreversibel.

Die natürlichen Eigenschaften und Funktionen, wie Löslichkeit und Enzymaktivität, gehen bei der Denaturierung verloren.

[http://www.biologieausbildung.de/Protokolle%20Stoffwechsel.htm; 13.Mai 2003]

1.2.3 Lysozym

Dieses Enzym kommt beim Huhn im Eiweiß und beim Menschen in der Tränenflüssigkeit, Speichel und im Schweiß vor. Es dient der Zerstörung von Bakterien indem es den Polysaccharidanteil der Bakterienzellwand abspaltet. Die Bakterienzellwand sorgt für den mechanischen Halt, aber ohne sie nimmt der osmotische Druck im Inneren der Zelle zu, wodurch der mechanische Halt nicht mehr gegeben ist und die Zelle platzt [Stryer,1981]

Das Lysozym ist ein kleines antibakterielles Enzym mit einem MG von 14,6 kd und besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette von 129 Aminosäuren. Dieses wird in großen Mengen aus Hühnereiweiß gewonnen. Es besitzt und 4 Disulfidbrücken welche die Gestalt des Lysozyms stabilisieren.

Aus der Konformation des Lysozyms ergibt sich eine spezifische Funktion welche für dieses Enzym einzigartig ist. Es besitzt an der Oberfläche eine Tasche. Diese ist jener Teil des Proteins mit dem es sein Zielbakterium erkennt, bindet und unschädlich macht (siehe Abb.2) [Stryer,1981]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Kalottenmodel von Lysozym

2. Ziel der Diplomarbeit

Ziel war die qualitative Analyse möglicher Wechselwirkungen zwischen Quercetin und Lysozym bei 60°C und 80°C!

Die hier durchgeführten Experimente hatten zum Ziel, Informationen über die Stabilität von Quercetin zu erhalten. Ein möglicher Abbau kann durch kovalente Bindungen des Quercetins an das Protein erfolgen. Als Modell wurde die Reaktion von Quercetin mit Lysozym untersucht.

Würde Quercetin bei höheren Temperaturen an ein Protein binden, so würde es für den Stoffwechsel nicht mehr zur Verfügung stehen und damit die positive Wirkung z.B auf Herz-Kreislauf verlieren.

Untersucht wurde die Stabilität von Quercetin (Abnahme) mit und ohne Lysozym bei unterschiedlichen Temperaturen und mögliche Reaktionen von Quercetin mit Lysozym.

Diese polyphenolischen Verbindungen werden von Mensch und Tier täglich mit der pflanzlichen Nahrung aufgenommen, wobei das Flavonol Quercetin die bedeutendste Substanz darstellt. Im Vordergrund der Untersuchung von Quercetin steht die antioxitative Eigenschaft das den Stoffwechsel positiv beeinflusst.

3. Material und Methode

3.1 Materialien

Quercetin (3,3´,4´,5,7-Pentahydroxyflavone): Dihydrid, Sigma Aldrich, Wien, Österreich

Catechin: Sigma Aldrich, Wien, Österreich Tannin rein: Merck, Wien, Österreich

Lysozym vom Hühnereiweiß: Sigma Aldrich, Wien, Österreich

Lysinhydrochlorid: Roth, Karlsruhe, Deutschland

Hämoglobin (Hb): Sigma Aldrich, Wien, Österreich

Rinderserum Albumin (BSA): Sigma Aldrich, Wien, Österreich

Aceton: 99,5% für HPLC, Promochem, Deutschland

Acetonitril (ACN): 99,8% für HPLC, Promochem, Deutschland

Ethanol (EtOH): 99,9% für HPLC, Merck, Wien, Österreich

Methanol (MeOH): 99,9% für HPLC, Promochem, Deutschland

Bidestiliertes Wasser (gereinigt mit Katuschensystem), Milipore, Simlicity

Trifluoressigsäure (TFN): Sigma Aldrich, Wien, Österreich

Essigsäure (AA): 100% für HPLC, Ried-de-Haen, Seelzen, Deutschland

Chlorogensäure (1,3,4,5-Tetrahydroxycyclohexancarboxylsäure): Sigma Aldrich, Wien, Österreich

Bisacrylamid (BIS) Acrylamid: N,N´-Methylenbisacrylamid, Sigma Aldrich, Wien, Österreich

TRIS (Buffer), Baehringen, Mannheim

HCl (Salzsäure), Merck, Wien, Österreich

Natriumdodecylsulfad (SDS= sodium dodecyl sulfate) (unbekannt) Persulfat (unbekannt)

TEMED: N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamine (unbekannt) Glycerin (unbekannt)

Coomassie Blau (unbekannt) Brilliand Blau; Sigma Aldrich

Externe Pumpe: Typ: HITACHI/Merck Tokyo (Japan), L-6000A-Pumpe, Merck; Darmstadt, Deutschland

HPLC-Säulen

Tabelle 1: Parameter über die verwendeten HPLC-Säulen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2: Gradienten-Trennung um einen Stoff , der mit einem schwachen Lösemittel nur schwer aus der Säule zu eluieren ist, durch die Veränderung der Zusammensetzung hin zu einem starken Lösemittel auch noch

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Für die Analyse von Quercetin wurde die Säule RP18e LiChrospher 100 verwendet.

Für die Analyse von Lysozym wurde die Protein-Peptid-Säule VYDAC218TP52 verwendet.

3.2 Methoden

Alle HPLC-Analysen wurden im Messlabor 2.2.4a der Technischen Universität Graz am Institut für Lebensmittelchemie und -technologie mittels HP1100 durchgeführt.

3.2.1 Chromatographie

Unter Chromatographie versteht man die physikalische Trennung, bei der die zu trennenden Komponenten zwischen einer festen (stationären) und einer beweglichen (mobilen) Phase verteilt werden.

Grundsätzlich gibt es für alle Chromatographiemthoden (z.B Säulenchromatographie, Gasgromatographie, Dünnschichtgromatographie und HPLC) zwei verschiedene Chromatographiearten:

- die Adsorptionschromatographie und
- die Verteilung- oder Absorbtionschromatographie

In dieser Diplomarbeit wurde die HPLC-Chromatographiemethode eingesetzt und als Chromatographieart wurde die Flüssigkeits-Adsorptions-Chromatographie angewendet.

Unter Adsorption versteht man physikalisch die Anreicherung eines gasförmigen oder gelösten festen Stoffes an der Phasengrenzfläche (Oberfläche) eines Festkörpers. Bei der Adsorptionschromatographie haben die Analyten durch van der Waals Wechselwirkungen unterschiedliche Verweilzeiten in dem Chromatographiesystem. Damit ist diese Chromatographieart stark von der Oberfläche und von der Art des Adsorbens abhängig [Gottwald,1993]

3.2.2 HPLC (High pressure liquid chromatography)

Die HPLC ist eine Methode der Flüssigkeits-Chromatographie, bei der die Trennung unter hohem Druck (bei HP1100 max. 400 bar) abläuft. Sie liefert gute, schnelle, qualitative und quantitative auswertbare Chromatogramme.

HPLC-Apparate bestehen aus einem Reservoir für die mobile Phase, einer oder mehrer Pumpen, einem Injektionsventil, einer Trennsäule und einem Detektor sowie einem PC zur Registrierung der Detektorsignale [Gottwald,1993]

Funktionsweise einer HPLC

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Schema einer HPLC-Anlage mit nachgeschalteten Massenspektrometer

Computer-Software

Als Computerprogramm wurde HP ChemStation, Version: A.08.04 (1008) verwendet.

Laufmittel

Laufmittel müssen physikalisch und chemisch besonders rein sein. Andernfalls führt die UV Absorption des Laufmittels zu erhöhtem Rauschen der Basislinie.

Auch bei der Verwendung von Wasser ist auf HPLC-Qualität zu achten. Entsalztes Wasser oder destilliertes Wasser besitzt noch erhebliche Mengen an organischen Substanzen, die unter Umständen unerwünschte Peaks verursachen.

Die Wasserqualität kann mit folgendem Test bestimmt werden:

Man saugt etwa 100ml Wasser über eine RP 18-Säule. Im Anschluss wird die Säule mit einem linearen Gradienten von 100% HPLC-Wasser bis 100% Methanol innerhalb 15-20min eluiert. Wird danach 15 min lang bei 254 bzw. 220nm auf dem Schreiber eine stabile, gerade Nullinie erhalten, war das Wasser in Ordnung [Gottwald,1993]

HPLC-Pumpe

Die HPLC-Pumpe fördert die mobile Phase mit hohem Druck (unter Umständen bis 700 bar!). Dieser hohe Druck ist notwendig, um die mobile Phase gleichmäßig durch die gesamte Anlage zu pressen. Die dichte Säulenpackung setzt der mobilen Phase einen hohen Strömungswiderstand entgegen. Je kleiner die Teilchen in der Säule sind, um so größer muss der Flüssigkeitsdruck sein. Die Pumpen müssen den Flüssigkeitsstrom mit konstantem Fluss, und ohne zu pulsieren durch die Anlage bewegen. Ein Trockenlaufen der Pumpe ist unbedingt zu vermeiden!

Verwendet werden heute meist Kolbenpumpen mit unterschiedlichen Systemen zur Pulsdämpfung. Je ein Ein- und Auslassventil an den Pumpköpfen steuert die Flussrichtung. Wird nur eine mobile Phase verwendet, dann spricht man von einer isokratischen Trennung. Werden 2 oder mehrere mobile Phasen in unterschiedlicher Zusammensetzung befördert dann spricht man von einer Gradiententrennung [Gottwald,1993].

Autosampler (Injektionsventil)

Zwischen Pumpe und Säule ist eine Vorrichtung angebracht, die es ermöglicht, ohne den mit hohen Druck geförderten Laufmittelstrom zu unterbrechen, Proben einzubringen. Dieses Injektionsventil verfügt über ein Rohrstück (Probenschleife), das es ermöglicht, in einer Stellung des Ventils die Probe in die Probenschleife zu injizieren.

Nach Umschalten des Ventils (Einspritzzeitpunkt) wird die Probenschleife zu einem Teil der Förderleitung und die Probe damit auf die Säule aufgebracht. Oft wird das Injektionsventil mit einem automatischen Probengeber (Autosampler) kombiniert. Dadurch können eine Vielzahl von einzelnen Proben vollautomatisch nacheinander abgearbeitet werden [Leonhard,2002]

HPLC-Säulen

Neben der Pumpe ist die Trennsäule das zweite wichtige Element, das über den Erfolg der Trennung entscheidet. Die Trennschärfe einer Säule steigt mit sinkender Partikelgröße des Füllmaterials. Die Partikel sollten dazu noch monodispers sein, d.h möglichst alle von der gleichen Größe.

Die am häufigsten verwendete stationäre Phase ist Silicagel (Normalphasen-HPLC) oder Silicagel modifiziert mit langen Alkylketten (RP oder Umkehrphasen-HPLC). Die Partikelgröße beträgt 3-25µm.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: HPLC-Trennsäule

Meine Analysen erfolgten mit Reversed-Phase-Säulen (RP-Säulen). Von RP-Säulen spricht man dann, wenn die stationäre Phase unpolarer ist als die mobile Phase. Die verwendete stationäre Phase kann dann nicht mehr normales, unbehandeltes Silicagel sein, da die vielen OH-Gruppen (Silanol) an der Außenfront den Stoff viel zu polar sein würden. Daher werden die polaren Silanolgruppen des Silicagels mit silicumorganischen Verbindungen verestert und damit unpolarer gemacht.

Die Probensubstanzen werden an der Oberfläche des unpolaren RP-Materials in der Säule um so stärker zurückgehalten, je unpolarer die sind, d.h um so weniger sie im Wasser löslich sind.

Wasser kann die unpolaren RP-Silicagel-Teilchen nicht benetzen und damit mit ihnen auch nicht ins Gleichgewicht kommen. Daher kann man mit dem Wassergehalt

des Eluenten die Elutionszeit stark verändern. Je mehr Wasser im Eluenten vorhanden ist, um so größer werden die Elutionszeiten. Eine Erhöhung des unpolaren Anteils (MeOH, ACN, THF) im Eluenten wird daher immer die RP-HPLC beschleunigen, allerdings reicht die Selektivität dann oft nicht mehr aus. Daher ist die Eluentzusammensetzung immer ein Kompromiss zwischen Schnelligkeit der Elution und Selektivität des Eluenten [Gottwald,1993]

UV/VIS-Detektor

Im Detektor werden die aufgetrennten Fraktionen der Säule vermessen. Als Detektoren wurden UV / VIS und DAD eingesetzt.

Die von den Detektoren gelieferten Signale müssen erfasst, gespeichert und ausgewertet werden. Dies geschieht in der Praxis durch Speicherung der Daten in einem Rechner. Bei konstantem Fluss während der Trennung entspricht nun jeder Zeitpunkt auf der Kurve einem bestimmten Elutionsvolumen. Liegt dieser Zeitpunkt im Maximum eines Peaks, so lässt sich daraus das Elutionsvolumen dieser Fraktion ermitteln. Der Elutionsvorgang wird mit dem Begriff Retentionszeit (Rückhaltezeit) charakterisiert [Leonhard,2002].

Die Retentionszeit ist die wichtigste chromatographische Eigenschaft einer Komponente. Die Retentionszeit ist die Zeit, die von der Komponente X benötigt wird, um das Trennsystem zu durchlaufen. Eine Komponente Y, die nicht mit der mobilen und stationären Phase wechselwirkt, durchläuft das Tennsystem in der Totzeit. Sie ist charakteristisch für die Messapparatur bei gegebener Flüssigkeit und Temperatur. Das Totvolumen ist das Volumen der mobilen Phase, welches das Trennsystem in der Totzeit durchläuft.

Die Form der Peaks lässt Aufschlüsse über die Qualität der Trennung zu. Je schmäler und höher die Form dieser Peaks wird, desto besser wird die Trennung beurteilt. Und je schmäler die Peaks in Relation zur Retentionszeit sind, desto mehr Substanzen können theoretisch auf der Säule voneinander getrennt werden Die Menge der in der jeweiligen Fraktion gemessenen Substanz ist der Fläche des Peaks proportional [Leonhard,2002]

3.2.3 Massenspektrometer (MS)

Die Massenspektroskopie dient zur exakten Bestimmung von Molekülmassen. Die Moleküle die vom DA-Detektor detektiert wurden, gelangen anschließend in das Massenspektrometer. Hier werden die Moleküle vom Lösungsmittel befreit und durch Beladung mit Protonen positiv ionisiert. Die Flugbahn der Ionen im Quadrupol hängt von Masse zu Ladungsverhältnis (m/z) und von der Frequenz des Magnetfeldes ab. Somit kann durch Einstellen einer bestimmten Frequenz eine Zuordnung von m/z erfolgen.

DAD-Detektor (Dioden-Array-Detektor)

Bei Stoffen, die unterschiedliche Absorptionsmaxima besitzen, ist die Verwendung einer gemeinsamen Wellenlänge direkt nicht möglich. Solche Systeme werden am günstigsten mit dem DA-Detektor gemessen.

Fällt Licht auf die, vor der Messung aufgeladene Fotodiode, wird das Licht in der Diode absorbiert und es entstehen freie Ladungsträger. Dabei entlädt sich die Diode um den entsprechenden lichtproportionalen Energiebetrag. Die Diode muss nun wieder mit einer elektrischen Energiemenge aufgeladen werden, um den Verlust auszugleichen. Der Ladungsstrom ist also proportional zur einfallenden Lichtmenge und dient als Registriersignal [Gottwald,1993].

4. Versuchsbeschreibung

4.1 Ansatz I

4.1.1 Reaktion von Quercetin mit Lysozym und BSA bei 37°C und 60°C

4.1.2 Aufbereitung der Proben

- 25,32mg Lysozym in 25 ml Messkolben einwiegen und in 25ml Wasser (bidest.) lösen.
- 25,21mg BSA (Bovine Serum Albumin) in 25ml Messkolben einwiegen und in 25ml Wasser (bidest.) lösen.
- 9,60mg Quercetin in 10ml Messkolben einwiegen und in 10ml EtOH lösen.

Blindwert:

1ml H2O wird in einem 15ml Zentrifugenröhrchen mit 20µl Quercetinlösung vereinigt.

Je 1ml der Proteinlösung wurde in ein 15ml Zentrifugenröhrchen übergeführt und im Anschluß je 20µl Quercetinlösung beigefügt.

Danach erfolgte die thermische Behandlung der Proben bei 37°C (BrutraumBiochemie) und bei 60°C (Trockenschrank) für je 1h, 2h, 4h, 5h, 6h und 8h.

Nach der thermischen Behandlung wurden die Proben über Nacht bei -20°C tiefgefroren. Dieser Vorgang erfolgte um die Reaktionen zu stoppen!

Am nächsten Morgen wurden die Proben aufgetaut und je 1ml Aceton hinzugefügt um die Proteine zu fällen. Wichtig dabei war, dass die Proben auf Eis weiterverarbeitet wurden, da Aceton sich sehr rasch verflüchtig! Im Anschluß wurde noch 6g NaCl beigemengt um eine bessere Phasentrennung zu erreichen. Dazu wurde das Probengemisch sehr gut geschüttelt und für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen.

Nach einer halben Stunde wurden die Proben für 10min bei 4000U/min zentrifugiert. Von den beiden Phasen die sich nun gebildet haben, wurden von der oberen Phase (Aceton mit Quercetin) 300µl in ein Autosampler-Vial übergeführt. Das Aceton wurde mit N2 eingeengt und der Rückstand in 300µl MeOH aufgenommen und per HPLC analysiert.

4.1.3 Ergebnis

Tabelle 3: Quercetin-Messung mittels RP18-Säule (37°C)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Anmerkung zu Tabelle 3: Die farblich gekennzeichneten Zahlenwerte wurden als unrealistische Abweichung (Messfehler) identifiziert und daher nicht für die Auswertung der Trennlinie miteinbezogen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5: Reaktion von Quercetin thermischer Behandlung bei 37°C

Tabelle 4: Quercetin-Messung mittels RP18-Säule (60°C)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Anmerkung zu Tabelle 4 : Die farblich gekennzeichneten Zahlenwerte wurden als unrealistische Abweichung (Messfehler) identifiziert und daher nicht für die Auswertung der Trennlinie miteinbezogen. Die Abweichung bei 8 Stunden ist hier nicht graphisch dargestellt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6: Reaktion von Quercetin mit Lysozym und BSA nach thermischer Behandlung bei 60°C

4.2 Ansatz II

4.2.1 Reaktion von Quercetin mit Lysozym und BSA bei 60°C und 80°C.

- Da bei Ansatz I die Menge an entnommener Proteinlösung sehr gering und für die Weiterverarbeitung schwierig war, wurden die in Ansatz II verwendeten Proteinlösungen auf 2ml erhöht.
- Da bei 37°C keine eindeutige Reaktion festzustellen war, wurden im Ansatz II die Temperaturen 60°C und 80°C gewählt.

4.2.2 Aufbereitung der Proben

- 25,30mg Lysozym in 25 ml Messkolben einwiegen und in 25ml Wasser (bidest.) lösen.
- 25,02mg BSA (Bovine Serum Albumin) in 25ml Messkolben einwiegen und in 25ml Wasser (bidest.) lösen.
- 5,42mg Quercetin in 5ml Messkolben einwiegen und in 5ml EtOH lösen.

Blindwert:

2ml H2O wird in einem 15ml Zentrifugenröhrchen mit 40µl Quercetinlösung vereinigt.

Je 2ml der Proteinlösung wurde in ein 15ml Zentrifugenröhrchen übergeführt und im Anschluß je 40µl Quercetinlösung beigefügt

Alle anderen Arbeitsschritte erfolgten wie in Ansatz I (Kapitel 5.1) ! Die thermische Behandlung erfolgte jeweils im Trockenschrank!

4.2.3 Ergebnis

Tabelle 5: Quercetin-Messung mittels RP18-Säule (60°C)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Anmerkung zu Tabelle 5: Die farblich gekennzeichneten Zahlenwerte wurden als unrealistische Abweichung (Messfehler) identifiziert und daher nicht für die Auswertung der Trennlinie miteinbezogen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Reaktion von Quercetin mit Lysozym und BSA nach thermischer Behandlung bei 60°C

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