Bakterizide Wirkung des Pflanzensekundärstoffs Isothiocyanat (Senföl)

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Theoretische Grundlagen
2.1 Vorkommen von Glukosiden in der Natur
2.2 Bedeutung des Isothiocyanats für die Pflanze
2.3 Chemische Grundlagen
2.3.1 Glukoside
2.3.2 Sinigrin
2.3.3 Isothiocyanat
2.4 Enzymatische Umsetzung
2.5 Zielsetzung der Seminararbeit

3. Experimentelle Durchführung und Erläuterung
3.1 Verwendete Versuchsvorschriften
3.2 Extraktionen
3.2.1 Sinigrin Extraktion
3.2.2 Myrosinase Extraktion
3.3 Enzymatische Hydrolyse des Glukosid-Extraktes zu Isothiocyanat
3.4 Dünnschichtchromatographien
3.4.1 Erläuterung zum Verfahren der Dünnschichtchromatographie
3.4.2 Durchführung der Dünnschichtchromatographie von Sinigrin
3.4.3 Durchführung der Dünnschichtchromatographie von Isothiocyanat
3.4.4 Durchführung der Dünnschichtchromatographie von Isothiocyanat und Sinigrin
3.5 Enzymtest
3.5.1 Durchführung des Enzymtests
3.5.2 Durchführung der Dünnschichtchromatographie des Enzymtests
3.5.3 Erläuterung zum Enzymtest
3.6 Antibakterielle Nachweismethoden
3.6.1 Hemmtest zum Nachweis der antibakteriellen Wirkung von Isothiocyanat
3.6.2 Bioautographie

4. Ergebnisse
4.1 Resultate der Dünnschichtchromatographie
4.1.1 Resultate der Dünnschichtchromatographie von Sinigrin
4.1.2 Resultate der Dünnschichtchromatographie von Isothiocyanat
4.1.3 Resultate der Dünnschichtchromatographie von Isothiocyanat und Sinigrin
4.1.4 Resultate der Dünnschichtchromatographie des Enzymtests
4.1.5 Rf-Werte zur Darstellung der relativen Laufstrecke in der DC
4.2 Resultate der antibakteriellen Nachweismethoden
4.2.1 Resultat des Hemmtests
4.2.2 Resultat der Bioautographie

5. Diskussion

6. Zusammenfassung

7. Anhang
7.1 Abkürzungsverzeichnis
7.2 Tabellen

8. Abbildungsverzeichnis

9. Literaturverzeichnis

1. Einleitung

Senf ist der Menschheit seit über 3000 Jahren als Gewürz und Ölpflanze bekannt und ist auch heute noch in den Küchen zu finden. Ursprünglich stammend aus Süd- und Zentralasien, wurden Senfpflanzen zunächst in Indien und China, später auch im südlichen Europa und Vorderasien kultiviert und als Gewürz geschätzt. Jedoch existierte bereits mehrere Jarhunderte v. Chr. im Orient das Wissen um die heilende Wirkung des Senfs, das in der Antike durch die Römer übernommen und verwendet wurde. So beschreibt bereits der griechische Militärarzt Pedanios Dioskurides im 1. Jhd. n. Chr. in seiner pharmakologischen Schrift „Materia Medica“ den medizinischen Wert der Sinapis Pflanze (Senf). Selbst die Bibel sagt: „Das Reich der Himmel ist gleich einem Senfkorn, …“ (Mat. 13,31). Vom Mittelalter an geht jedoch das Volkswissen um das Heilmittel Senf verloren, die Verbreitung in Europa als Gewürz, maßgeblich durch Karl den Großen, nimmt jedoch stark zu (Löw, et al). Erst die moderne Forschung befasst sich wieder mit den Inhaltsstoffen des Senfkorns und kann die heilende Wirkung des Senföls erklären, da darin schwefelhaltige Pflanzensekundärstoffe enthalten sind, die antibiotisch und desinfizierend wirken (Luciano, 2009; Lara-Lledó, 2012). Seit 1960 konnten noch andere gesundheitsfördernde Eigenschaften festgestellt werden wie z.B. die antikarzinogene Wirkung gegenüber Bronchial-, Magen-, Kolorektal-, Mamma-, Blasen- und Prostata-Karzinomen (Cools, 2012) oder die antioxidative- und immunmodulatorische Aktivität (Watzl, 2001). Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Extraktion von Senfölglukosiden und dem erforderlichen Enzym Myrosinase, sowie der enzymatischen Umsetzung des Ausgangsprodukts. Desweiteren soll der Nachweis der bakteriziden Wirkung des Umsetzungsprodukts sowie dessen Identifikation gezeigt werden. Dies könnte für die senfproduzierende Industrie von Interesse sein, da in den Abfallprodukten von gemahlenem Senf eventuell konservierende Stoffe beinhaltet sind, die zusätzlich verwendet werden könnten.

2. Theoretische Grundlagen

2.1 Vorkommen von Glukosiden in der Natur

Glukoside werden im Sekundärstoffwechsel von Pflanzen aus Aminosäuren gebildet (Watzl, 2001). Aminosäuren werden dabei zu einem Aldoxim abgebaut, welches in Phenylessigsäure und anschließend in ein Glukosid decarboxyliert wird (Kindl, 1975). Glukoside kommen in der Natur nur in Pflanzen höherer Gattung vor (Dörnemann, 2008), z.B. in der Familie der Kreuzblütengewächse (Brassicaceae, Synonym. Cruciferae; Ahlheim, 1983) als wichtigster Vertreter der Gattung (Luciano, 2009). Jedoch sind Glukoside auch in Kaperngewächsen (Capparidaceae), Kapuzinerkressen (Tropaeolaceae) und Resedagewächsen (Rescedaceae) auffindbar (Dörnemann, 2008). Insgesamt sind aktuell circa 130 verschiedene Glukoside bekannt (Wittstock, 2004). Der Trockenmasseanteil an Glukosiden kann in einigen Brassica-Arten bis zu 1 % betragen (Watzl, 2001), jedoch kann die Menge an Glukosiden in der Wildform die enthaltene Menge einer Zuchtpflanze um das 1000-fache übersteigen (Watzl, 2001).

Senfölglukoside sind in Senf-Gewächsen (Sinapis) zu finden, die ebenfalls zur Familie der Kreuzblütler gehören (Ahlheim, 1983; Dörnemann, 2008). Jedoch bilden verschiedene Senfsorten eine Mischung aus unterschiedlichen Senföl-Glukosiden (Lara-Lledó, 2012). So bildet weißer Senf (Sinapis alba) hauptsächlich Sinapin, wohingegen schwarzer Senf (Brassica nigra) und oriental Senf (Brassica juncea) überwiegend Sinigrin produzieren (Lara-Lledó, 2012). Allgemein kann das Auftreten eines stechenden Geruchs nach dem Zerstören des Zellgewebes der Pflanze auf das Vorhandensein von Senfölglukosiden hindeuten (Dörnemann, 2008). Dieser stechende Geruch wird durch Senföle (Isothiocyanate) hervorgerufen, sie entstehen durch den enzymatischen Abbau des Senfölglukosides.

Das Enzym, das die Hydrolyse des Senfölglukosides vollzieht, heißt Myrosinase oder auch β- Thioglukosidase (Lara-Lledó, 2012; Luciano, 2009; Watzl, 2001; Dörnemann, 2008). Es kommt in allen Pflanzen vor, die Senföle ausbilden.

2.2 Bedeutung des Isothiocyanats für die Pflanze

Die Produkte des enzymatischen Abbaus der Senfölglukoside stellen der Pflanze hochwirksame Abwehrstoffe gegen Fressfeinde (Herbivoren) und pflanzenpathogene Mikroorganismen zur Verfügung (Wittstock, 2004; Aires, 2009). Diese Produkte sind verschiedene Isothiocyanate (ITC), Thiocyanate und Nitrile, welche enorme Toxizität gegen mikrobiologische Organismen aufweisen (Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001; Wittstock, 2004; Luciano, 2009). So weist Isothiocyanat allein eine bakterizide, fungizide, herbizide und toxische Wirkung gegen tierisches Gewebe auf (Aires, 2009; Luciano, 2009; Lara-Lledó, 2012; Hock, 1984).

Diese Form des pflanzlichen Eigenschutzes wird als konstitutive Abwehr bezeichnet, da das Abwehrmittel in seiner Vorstufe bereits vor dem Kontakt mit Herbivoren oder dem Pathogen in der Zelle gebildet wurde. Jedoch wird das pflanzliche Toxin erst bei unmittelbarer Verwundung des Zellverbandes hergestellt. Dieses Verfahren wird oft auch als pflanzliche Senföl-“Bombe“ bezeichnet, da sie erst „auslöst“, wenn die zwei Komponenten in unmittelbaren Kontakt treten (Wittstock, 2004).

In der Senfpflanze oder der Senfsaat liegen Senfölglukosid und Myrosinase räumlich getrennt voneinander vor. Das Enzym-Substrat (Senfölglukosid) befindet sich in Kompartimenten (Vakuolen) nahe der Zellwand (Rausch, 1999), das Enzym (Myrosinase) ist dagegen in sog. Indoblasten (spezialisierte Zellen / „Sonderlinge“ des Zellverbandes) verteilt (Sitte, 1998). Durch mechanische Einwirkung kommen Enzym und sein Substrat in Kontakt, daraufhin beginnt die Umsetzung und das Abwehrtoxin entfaltet seine Wirkung (Dörnemann, 2008; Lara-Lledó, 2012; Watzl, 2001). Andere Pflanzengattungen, welche Glukoside enthalten, lagern Substrat und Enzym jedoch auf andere Art und Weisen ein. Die Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana) bildet beispielsweise sogenannte glukosidhaltige S-Zellen nahe dem Siebteil sowie eigene Myrosinasezellen an der Rinde (Wittstock, 2004).

2.3 Chemische Grundlagen

2.3.1 Glukoside

Glukoside (Glukosinolate) (Abbildung 1) sind chemisch stabile, nicht flüchtige, ionische Biomoleküle, die zur Gruppe der schwefelhaltigen Metaboliten gehören. Sie bestehen aus einer Glukoseeinheit an einer Schwefel-Stickstoff-haltigen Gruppierung, einer Sulfatgruppe und einem variablen Rest. Die Struktur ist damit ein Verbund aus einem Thioglukose-Rest an einem N- Hydroxyiminosulfatester sowie dem Aglukonrest (R, siehe unten). Dieser Rest kann aus einer Alkyl-, Alkenyl-, Aryl- oder Indolyl- Gruppe bestehen. Er bestimmt die physiologische Wirkung (Watzl, 2001; Wittstock, 2004). An der Sulfatgruppe befindet sich ein Kation, in der Regel K+ (Dörnemann, 2008).

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Abbildung 1: Allgemeiner Aufbau eines Senfölglukosids

Die Nomenklatur bei Glukosiden ist unterschiedlich, so wird bei der Formung des Trivialnamens dem Namen der Pflanze ein „Gluco“ vorangestellt, und die Endung „in“ angefügt. So wird beispielsweise das Glukosid der Wasserkresse (Nasturtium officinale) als „Gluco-nasturti-in“ bezeichnet (Dörnemann, 2008). Der systematische Name ist jedoch präziser, wie Abbildung 2 zeigt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Nomenklaturbeispiel Wasserkresse

2.3.2 Sinigrin

Der systematische Name von Sinigrin ist Allyl-Glukosinolat, der chemische lautet 1-(N-(sulfoxy)-

3-butenimidat-1-thio-β-D-Glukopyranose. Die empirische Summenformel lautet:

[C10H16NO9S2]−K+. Das Molekulargewicht beträgt 397.46 g/mol (Sigma-Aldrich). Die Abbildung 3 zeigt die Struktur von Sinigrin.

Abbildung 3: Molekularstruktur von Sinigrin

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2.3.3 Isothiocyanat

Unter dem Begriff „Senföle“ werden die Isothiocyanate zusammengefasst. Isothiocyanate sind flüchtige und chemisch instabile Moleküle, sofern sie aus Indoylglukosinolaten gebildet werden. Sie zerfallen spontan zu Indol-3-Carbinol und weiteren Indolverbindungen (Watzl, 2001). Sie entstehen durch den enzymatischen Abbau eines Senföl-Glukosids und wirken toxisch. Der grundliegende Aufbau ist wie folgt ( Abbildung 4):

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Abbildung 4: Allgemeine Molekularstruktur von ITC

Bei der Umsetzung von Allyl-Glucosinolat entsteht Allylisothiocyanat (AITC) (Aires, 2009). Die Summenformel hierzu lautet C4H5NS (Strukturformel siehe Abbildung 5). Die Molekülmasse beträgt 99.15 g/mol (Sigma-Aldrich).

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Abbildung 5: Molekularstruktur von AITC

2.4 Enzymatische Umsetzung

Die Hydrolyse von Senfölglukosid in ein Senföl wird durch Myrosinase katalysiert, wobei die Schwefel-Glukose Bindung des Substrats (Senfölglukosid) hyrolysiert wird (Wittstock, 2004). Dabei werden äquimolare Mengen an β-D-Glukose, Sulfat und dem Glukosid spezifischen Aglucon gebildet. Ascorbinsäure wirkt hierbei als Coenzym, da es möglicherweise eine nukleophile katalytische Gruppe bereitstellt. Das instabile Aglucon reagiert je nach pH-Wert und Temperatur weiter zum primären Produkt, Isothiocyanat (Wittstock, 2004). Desweiteren werden jedoch Sekundärprodukte wie Thiocyanate, Nitrile und Epithionitrile gebildet (Lara-Lledó, 2012). Bei neutralem pH-Wert werden hauptsächlich Isothiocyanate, bei saurem pH-Wert hingegen Nitrile gebildet (Wittstock, 2004). Abbildung 6 zeigt eine Übersicht zum Vorgang der enzymatischen Umsetzung.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6: Mechanismus und Produkte der enzymatischen Umsetzung von Glukosiden

2.5 Zielsetzung der Seminararbeit

Das Ziel dieser Arbeit ist, das Senfölglukosid Sinigrin sowie das Enzym Myrosinase aus Senfkörnern zu extrahieren. Das Enzym sollte das Glukosid zum Isothiocyanat (ITC) hydrolisieren. Ferner sollte die antibakterielle Wirkung des enzymatischen Umsetzungsprodukts bestätigt und ITC im Stoffgemisch der Umsetzung identifiziert werden.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte erstmals ermittelt werden, ob das Verfahren der Bioautographie (Reusser, 1967) in vereinfachter Version geeignet ist, um auf diesem Wege das Isothiocyanat aus dem Umsetzungsgemisch des Extraktionsverfahrens aufzutrennen (Dünnschichtchromatographie) und durch seine toxische Wirkung auf Bakterien zu identifizieren.

Die Versuche wurden mit Samen von Brassica juncea durchgeführt, da diese laut Auskunft der Firma Develey GmbH mehr Senfölglukosid enthalten als die in der Versuchsanleitung (Dörnemann, 2008) beschriebenen Samen von Sinapis alba.

3. Experimentelle Durchführung und Erläuterung

3.1 Verwendete Versuchsvorschriften

Die Versuchsvorschrift zur Extraktion von Myrosinase und Sinigrin das Protokoll zur enzymatischen Umsetzung und Durchführung der Dünnschichtchromatographie (DC), sind größtenteils der Arbeitsanleitung zum Kurs: "Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe" von PD Dr. Dieter Dörnemann, Philipps-Universität Marburg im Fachbereich Biologie (Pflanzenphysiologie/ Photobiologie) entnommen (Dörnemann, 2008).

Einzelne Teilverfahren wurden jedoch eigenständig abgeändert. Es wurde Senf der Sorte Brassica juncea zur Extraktion von Sinigrin und Myrosinase verwendet, da diese Sorte den höchsten Sinigringehalt aufweist und damit laut Literatur die stärkste antibakterielle Wirkung zeigt (Lara-Lledó, 2012).

Die Anleitung zum bakteriellen Hemmtest wurde dem Buch „Mikrobiologisches Praktikum“ entnommen (Drews, 1983). Die Methodik der Bioautographie wurde abgewandelt übernommen aus: „Eine Methode zur Bioautographie von Dünnschicht-Chromatogrammen“ (Reusser, 1967).

3.2 Extraktionen

3.2.1 Sinigrin Extraktion

Das Verfahren zur Aufreinigung von Sinigrin begann mit dem Zerreiben von 10 g Senfkörnern in einer Reibschale unter Zusatz von 30 ml Ethanol 80 % (aq.). Dies zerstörte die Struktur der Zellen und setzte das Glukosid frei. Der Alkohol verhinderte hierbei die enzymatische Umsetzung des Sinigrins durch Myrosinase. Anschließend wurde die homogene Masse in einen Einhalskolben überführt und mit Ethanol 80 % (aq.) auf 100 ml aufgefüllt. Daraufhin wurde das Produkt 60 min mittels Rückflusskühler (Abbildung 7) gekocht, wobei die Erhitzung im Wasserbad erfolgte und der Siedepunkt aufgrund des Ethanol/Wasser Gemisches bei ca. 85°C lag.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Sinigrinextraktion im Abbildung 8: Kolben der

Wasserbad mit Rückflusskühler 1. Sinigrin Extration

Dadurch wurde das Sinigrin in der Ethanol-Wasser Phase des Gemisches gebunden. Im Anschluss daran wurde der entstandene wässrige Ethanol-Überstand abgehoben (1. Extraktion, Abbildung 8). Der Rückstand wurde erneut nach dieser Methode mit 50 ml Ethanol 80 % (aq.) versetzt und diesmal nur 30 min mittels Rückflusskühler gekocht. Diese 2. Extraktion sollte die Ausbeute an Sinigrin steigern. Die Überstände der beiden Extraktionen wurden vereint und zur vollständigen Feststoffabtrennung zentrifugiert und der Überstand zur Weiterverarbeitung erneut abgehoben. Im Rotationsverdampfer (Abbildung 9 und 10) wurde daraufhin unter Vakuum sämtliches Ethanol abgezogen und das Sinigrin in der wässrigen Phase konzentriert (Abbildung 11).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 10: Vor Aufkonzentrieren

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 9: Rotationsverdampfer Abbildung 11: Nach Aufkonzentrieren

Im Anschluss daran wurde mit H2O (dd.) zunächst auf 10 ml aufgefüllt, wobei ein starker weiß- gelblicher Niederschlag auftrat. Dann wurde mit H2O (dd.) auf 30 ml aufgefüllt. Anschließen wurde mehrmals mit Diethylether extrahiert, wodurch hydrophobe Komponenten (z.B. zelluläre Lipide) in die Ether-Phase übergingen und durch Abheben und Weiterverwenden der Unterphase aus dem Extrakt entfernt wurden. Durch die Ether Extraktion konnte der oben genannte weiße Niederschlag entfernt werden. Anschließend wurde die sinigrinhaltige wässrige Phase im Rotationsverdampfer auf 5 ml eingeengt, um das Sinigrin aufzukonzentrieren. Ein Nebeneffekt des Abdampfens ist die vollständige Entfernung des restlichen Diethylethers. Das gewonnene Präparat wurde in 4 x 200 µl Aliquots verteilt und bei -20°C eingefroren, bzw. einer Dünnschichtchromatographie und einer enzymatischen Umsetzung unterzogen.

3.2.2 Myrosinase Extraktion

Um zelluläre Proteasen zu hemmen, die das zu extrahierende Enzym Myrosinase abbauen könnten, wurden alle Aufreinigungsschritte gekühlt durchgeführt, daher wurden Reibschale, Pistill und Besteck vor dem Versuch mit N2 (liq.) gekühlt. Nun wurden 20 g der Senfsamen (Abbildung 12) zerrieben, wodurch das Enzym aus den Zellen freigesetzt wurde.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 12: Senkörner Abbildung 13: Dekantieren Abbildung 14: Dialyseschlauch

Zur Abtrennung von Fetten und Ölen aus dem Grobextrakt wurde das Gemenge 10 x mit jeweils 50 ml eisgekühltem Aceton versetzt, gemischt und anschließend dekantiert (Abbildung 13). Die Aceton Überstände wurden verworfen, Acetonreste wurden anschließend aus dem Rückstand in einer Vakuumzentrifuge abgedampft. Das darauffolgende Aufschlämmen des Sediments (Pellet) mit 60 ml einer Lösung aus 50 mM NaCl und 10 mM 2-Mercaptoethanol (60 min. Inkubation) löste das konzentrierte Enzym. Im Anschluss daran wurde das Produkt durch ein Feinfasertuch abgepresst, wodurch alle gröberen Bestandteile abgetrennt wurden. Das gewonnene proteinhaltige Filtrat wurde bei 30.000 g für 15 min zentrifugiert, das Pellet verworfen und der klare Überstand zur Weiterverarbeitung verwendet. Anschließend wurde eine fraktionierte Ammoniumsulfatfällung durchgeführt, um durch schrittweise Erhöhung der Konzentration von Ammonuimsulfat im Extrakt unerwünschte Proteine auszufällen. Zuerst wurde die Konzentration auf 50 % (NH4)2SO4 eingestellt. In diesem Versuch betrug die benötigte Menge 14 g (Dixon, 1953). Das (NH4)2SO4 wurde unter ständigem Rühren sehr langsam hinzugegeben, um die Konzentration des Salzes in der Lösung nicht punktuell über 50 % steigen zu lassen. Dies führte zur Fällung von unerwünschten Proteinen. Nun wurde die Lösung bei 10.000 g zentrifugiert und der proteinhaltige Überstand anschließend einer zweiten Ammoniumsulfatfällung unterzogen, wobei die Konzentration an (NH4)2SO4 nun auf 70 % erhöht wurde. Hier betrug die zugegebene Menge an Ammoniumsulfat 6 g (Dixon, 1953). Bei 70 % (NH4)2SO4 konnte schließlich die gewünschte Myrosinase ausgefällt werden. Erneut wurde bei 10.000 g abzentrifugiert. Das Pellet enthielt Myrosinase und wurde in 5ml einer 50 mM NaCl 10 mM 2-Mercaptoethanol aufgenommen um das Enzym wieder in Lösung zu bringen. Nun wurde das Produkt in einen Dialyseschlauch gefüllt und über Nacht gegen 500 ml + 50 mM NaCl 10 mM 2-Mercaptoethanol dialysiert (Abbildung 14), um die Konzentration von NH4 und SO42- -Ionen in der nun fertig aufgereinigten Myrosinase Lösung zu senken. Die gewonnene Myrosinase Lösung wurde direkt einer enzymatischen Umsetzung von Sinigrin unterzogen oder eingefroren (-20°C). Es wurden 4 Aliquots á 500 µl Reinextrakt, bzw. 4 Aliquots á 800 µl einer Mischung bestehend aus 600 µl Reinextrakt und 200 µl Glycerin 80 % (aq.) eingefroren, um die Enzyme vor der Zerstörung beim Auftauen zu schützen.

3.3 Enzymatische Hydrolyse des Glukosid-Extraktes zu Isothiocyanat

Zur Inkubation des Sinigrins wurden 200 µl des Eigenprodukts mit 250 µl des eigenproduzierten Enzyms + 1000 µl eines 0,1 M Natriumphosphatpuffers (pH 7.0) unter Zugabe von Natriumascorbat versetzt. Als Kontrolle wurde käufliches Sinigrin (Sigma-Aldrich) hydolysiert, um die Aktivität der selbstisolierten Myrosinase zu bestätigen. Außerdem liefert die hydrolsierte Kontrollsubstanz (AITC) die Referenz zum umgesetzten Eigenprodukt. Dazu wurde 8 mg Sinigrin in 800 µl H2O (dd.) gelöst (Endkonzentration 10 mg/ml) und 20 µl davon mit 250 µl der eigenproduzierten Myrosinase + 1000 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.0) sowie Natriumascorbat versetzt. Zur Herstellung der 0.1 M Pufferlösung wurden 57,7 ml einer 1 M Na2HPO4 Lösung und 42,3 ml einer 1 M NaH2PO4 Lösung gemischt, auf 1000 ml mit H2O aufgefüllt und am pH-Meter auf den korrekten pH-Wert (pH 7.0) hin überprüft. (Table B.11 Phosphate Buffers - Preparation of Reagents and Buffers Used for Molecular Cloning). Das Myrosinase katalysierte Umsetzungsverfahren von Sinigrin zu Isothiocyanat fand bei 33°C über 60 min statt. Anschließend wurde eine Geruchsprobe auf stechenden Senfgeruch durchgeführt (Dörnemann, 2008), die in diesem Fall jedoch negativ verlief. Nach der Abkühlung der Proben auf 0°C wurde dreimal mit je 1 ml Diethylether extrahiert und die obere Ether-Phase abgenommen.

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