Manual de Laboratorio para el Diagnóstico de la Esclerosis Lateral Amiotrófica

ÍNDICE

Resumen

Summary

ABREVIATURAS

1. INTRODUCCIÓN
1.1. LA ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA (ELA)
1.1.1. Generalidades sobre la ELA
1.1.2. El ratón transgénico SOD1G93A: un modelo de ELA
1.1.3. Mecanismos fisiopatológicos implicados en la ELA
1.1.4. Papel del NO en la degeneración neuronal
1.1.5. Evidencias del papel del NO en la ELA
1.1.6. Tratamientos en pacientes con ELA

2. DIAGNOSIS DE LA ELA
2.1. Determinación del genotipo en ratones SOD
2.2. Peso corporal
2.3. Score
2.4. Electromiografía (EMG)
2.4.1. Electrodos
2.4.2. Amplificadores
2.4.3. Sistemas de registro
2.4.4. Altavoz
2.4.5. Potenciales característicos en EMG
2.4.6. EMG NORMAL
2.5. Test Comportamentales
2.5.1. Prueba de Rotarod
2.5.2. Hanging Wire
2.5.3. Prueba de Footprint: patrón motor del animal durante el paseo
2.5.3.1. Footprint-step lenght (longitud del paso) y Footprint-step hind base (distancia entre la patas traseras)
2.5.3.2. Footprint-runtime: tiempo en recorrer una distancia determinada
2.5.3.3. Estudios mediante la prueba de Footprint
2.5.3.4. Footprint-step length o longitud del paso
2.5.3.5. Distancia entre las patas traseras
2.5.3.6. Extensión de los dedos (Spreading of toes)
2.5.4. Curva de Supervivencia (Curva de Kaplan-Meyer)
2.6.Análisis microscópico de la ELA.Procesamiento de los animales para estudios histológicos
2.6.1. Perfusión de los animales
2.6.2. Determinación y disección del segmento lumbar de la médula espinal
2.6.3. Obtención de las secciones para el procesamiento histológico
2.6.4. Procesamiento histológico de las secciones
2.6.4.1. Tinción de Nissl o violeta de cresilo
2.6.4.2. Procesamiento del tejido mediante inmunohistoquímica
2.6.4.3. Contratinción con violeta de cresilo
2.6.4.4. Análisis de los datos
2.7. Neurotoxicidad por glutamato. Determinación actividad enzimática: GLUTAMATO AMINOPEPTIDASA
2.7.1. Obtención de las muestras
2.7.2. Preparación de las muestras
2.7.3. Determinación enzimática de la GluAP
2.7.4. Determinación de proteínas

3. BIBLIOGRAFÍA

Resumen

Esta guía aporta el material suficiente para el investigador, y para los investigadores en formación, con las claves básicas para la compresión de la enfermedad neurodegenerativa más letal y devastadora, hasta ahora conocida, denominada “esclerosis lateral amiotrófica” (ELA). Junto con una revisión en profundidad de la descripción y de las bases bioquímicas y fisiopatológicas de la ELA, profundizaremos en las técnicas de laboratorio más recurrentes para el diagnóstico de la enfermedad. Los principales objetivos de este manual es convertir esta guía en material de consulta y de respaldo a la investigación frente a la ELA, así como realizar un cuaderno de trabajo de obligado cumplimiento dentro del guion de prácticas para el alumnado que realice estudios de postgrado en el ámbito de la biomedicina, sobre todo, los versados en el campo de la neurociencia.

Summary

This guide displays enough material for the researcher, and for students beginning research, with the basic keys for insight of the lethalest and devastating neurodegenerative disease, until now known, called “amyotrophic lateral sclerosis” (ALS). Next to a deep review about description and biochemical- and physiopathologics basis from ALS, we will dive on the laboratory technics more recurrent for the disease diagnostic. The main objectives of this manual is to convert this guide in consultant material and research support in front of ALS, as well as to make an obligatory workbook within practice guide notes for initiate students in biomedicine postgraduate, especially about neuroscience field.

ABREVIATURAS

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1. INTRODUCCIÓN

1.1. LA ESCLEROSIS LATERAL AMIOTRÓFICA (ELA)

1.1.1. Generalidades sobre la ELA

La ELA es también conocida como la esclerosis de Charcot, la enfermedad de Lou Gehrig (más comúnmente conocido de esta forma en E.E.U.U.) o la enfermedad de la motoneurona (MN). La ELA es la enfermedad neurodegenerativa más letal conocida hasta ahora y fue descrita por Charcot hace más de 140 años (Charcot & Joffroy, 1869). La edad media de manifestación de la enfermedad se encuentra en torno a los 55 años. El 80% de los casos comienzan entre los 40 a 70 años siendo menos frecuente antes de los 40 años. La enfermedad se caracteriza por la degeneración y la muerte de las neuronas motoras de la médula espinal, el tronco del encéfalo y la corteza motora, tiene un curso generalmente lento, aunque esto depende de la zona del sistema nervioso en la que se inicie la afectación degenerativa. Al comienzo de la enfermedad son frecuentes los calambres musculares, fundamentalmente durante la noche, en los que los músculos tienen tendencia a contraerse espontáneamente. La característica más sobresaliente es la debilidad muscular progresiva concomitante con atrofia muscular, hiperreflexia, fasciculaciones y calambres musculares sin alteración de la sensibilidad. La evolución de la enfermedad origina debilidad muscular en las manos y los pies, apareciendo dificultades al andar, dificultades en actividades cotidianas, problemas al tragar (disfagia), al masticar, y parálisis de los músculos del tronco y cuello.

El físico británico Stephen Hawking es el paciente de ELA más conocido. Cursa la ELA más atípica puesto que solo un 10% de los pacientes afectados de ELA logran sobrevivir una década. http://cdn.zmescience.com/wp-content/uploads/2015/06/NASA-Can-Stop-Looking-for-Black-Holes-Says-Stephen-Hawking-2.jpg [07.08.2015]

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Puede haber espasticidad generalizada provocando risas y llantos inapropiados, que son parte de la enfermedad y no una alteración mental. El 80% de los enfermos de ELA suelen morir de fallo respiratorio 3-5 años después del inicio de los síntomas, aunque aproximadamente el 10% de los pacientes sobreviven 10 años o más. La mayoría de los casos de ELA (90-95%) son esporádicos, sin una causa genética aparente ni factores de riesgo asociados. El resto de los casos de ELA (5-10%) tienen una causa genética heredada (ELA familiar), aunque existe un tercer tipo de ELA menos comentando, conocido como ELA territorial o Guameña, por observarse una incidencia extremadamente elevada de la enfermedad en Guam (Pacífico).

La ELA familiar y la esporádica tienen el mismo perfil clínico y patológico afectando a las mismas neuronas. La causa de la enfermedad es desconocida, pero se barajan diversos mecanismos y factores de riesgo, siendo de origen multifactorial (Boillée et al., 2006). Los principales factores comprenden mecanismos genéticos, alteración en el plegamiento de proteínas, disfunción mitocondrial, daño oxidativo, transporte axonal defectuoso, excitotoxicidad por alteraciones en el metabolismo del glutamato, factores ambientales, radicales libres como origen de mutaciones en el gen de la superóxido dismutasa (SOD1), respuestas inmunológicas e inflamación con respuesta degenerativa, deficiencias de factores neurotróficos y alteraciones del metabolismo de los neurofilamentos. El daño en la MN se ve incrementado por daños incurridos por células vecinas no neuronales, por una vía de respuesta inflamatoria que acelera la progresión de la enfermedad (Boillée et al., 2006).

Actualmente hay descritas diferentes alteraciones que se engloban dentro del término ELA: ELA1 a ELA8, ELA con demencia frontotemporal (ELA-DFT) y ELA-DFT acoplado con la enfermedad de Parkinson (ELA-DFTP). Se han identificado también mutaciones en genes codificantes de angiogenina (ANG) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y secuencias variantes en genes de neurofilamentos (Gros-Louis et al., 2006). Aunque todas tienen en común la afectación de las neuronas motoras, la nomenclatura es confusa, puesto que, mientras ELA1, ELA3, ELA6, ELA7, mutaciones en angiogenina y VEGF, y una proporción pequeña de incidencias de ELA8 representan la clásica enfermedad neurodegenerativa de inicio tardío con una muerte selectiva de MNs superiores e inferiores que conllevan a la parálisis progresiva, en la ELA-DFT y la ELA-DFTP los pacientes presentan síntomas adicionales incluyendo demencia y distonía (Boillée et al., 2006).

La mayor parte de las investigaciones sobre la patobiología de la ELA se ha llevado a cabo mediante el estudio de las mutaciones génicas asociadas a esta enfermedad, ya que estas mutaciones producen las mismas alteraciones que ocurren en la ELA esporádica (Tabla 1)

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Tabla 1. Las variantes de los genes que codifican para angiogenina, subunidad ligera del neurofilamento, proteína de supervivencia de MNs y factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), se han implicado en la ELA esporádica. AD, autosómica dominante; ELA, esclerosis lateral amiotrófica; AR, autosómica recesiva; ALS2, gen que codifica para alsina; COX1, ciclooxigenasa 1; DFT, demencia frontotemporal; DFT, demencia frontotemporal asociada a Parkinson; IARS2, ARNt para la isoleucina sintetasa mitocondrial; ADNmit: ADN mitocondrial; SETX, senataxina; SOD1, superoxido dismutasa 1; VAPB, Proteína B asociada a la proteína asociada a la membrana de las vesículas; Xcen, centrómero del cromosoma X; XD, dominancia ligada a cromosoma X.

La SOD1 es una enzima abundante y ubicua expresada en el citosol. La SOD1 dismuta o cataliza la conversión del anión superóxido (O2-), un subproducto natural de la respiración, a peróxido de hidrógeno (H2O2) o agua. El primer mecanismo patogénico propuesto fue la pérdida o disminución de esta actividad detoxificadora. Aunque sólo un 20% de los casos de ELA familiar se han relacionado con la mutación de la SOD1 (Rosen, 1993), la mayoría del conocimiento de la patogénesis de la ELA deriva de estudios de muerte celular iniciada por la proteína SOD1 mutada, ya que dicha mutación daña muchas funciones celulares (Figura 1). La SOD1 mutada afecta negativamente al metabolismo del ADN/ARN; al transporte axonal; a la capacidad tamponadora de Ca2+ de la mitocondria, así como a su producción de ATP; a las funciones del retículo endoplásmico, del aparato de Golgi y del proteosoma; y produce la activación de cascadas apoptóticas.

Estos son mecanismos intrínsecos de la MN que inducen su muerte, pero la SOD1 mutada también puede activar mecanismos dañinos extrínsecos a la MN. Esto se debe a que puede interaccionar con cromogranina y ser secretada con ella desde la MN, produciendo la alteración y/o activación de astrocitos y microglía. Así se reduce la recaptación de glutamato por la astroglía lo que contribuye a aumentar los niveles de glutamato extracelular y la excitotoxicidad. Además, la microglía secreta citoquinas, como el factor de necrosis tumoral α (TNFα), que pueden ser tóxicas y causar daño celular (Figura 1).

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Figura 1. La mutación de la SOD1 daña muchas funciones celulares. La toxicidad de la SOD1 es multifactorial, opera a través de diversas vías interrelacionadas. CytC, citocromo C; EAAT2, transportador de aminoácidos excitadores 2. Figura modificada de Pasinelli et al., 2006. Para más detalles ver texto.

Los animales que expresan, tanto la forma activa de la SOD1 humana mutada (hSOD1G73R [(Wong et al., 1995)] y hSOD1G93A [(Gurney et al., 1994; Howland et al., 2002)]) como la forma inactiva (hSOD1G85R [(Bruijn et al., 1997)], mSOD1G86R [(Ripps et al., 1995)], hSOD1G127X [(Jonsson et al., 2004)], hSOD1Quad [(Wang et al., 2003)], hSOD1H46R [(Nagai et al., 2001)]) de la enzima, desarrollan patologías similares a las observadas en pacientes con ELA, incluyendo: la reducción de la cobertura sináptica de las MNs (Fischer et al., 2004; Frey et al., 2000; Pun et al., 2006; Moreno-López et al., 2006; Sunico et al., 2011), alteraciones mitocondriales (Wong et al, 1995; Kong & Xu, 1998; Higgins et al., 2003; Liu et al., 2004), y activación microglial (Engelhardt & Appel, 1990; Hall et al., 1998; Boillée et al., 2006; Henkel et al., 2006). Sin embargo, la supresión del gen SOD1 no conduce a la enfermedad (Reaume et al., 1996). Es más, la supresión de la SOD1 endógena en ratones que expresan la hSOD1G85R dismutasa inactiva no afecta al curso de la enfermedad (Bruijn et al., 1998). Los ratones que expresan altos niveles del transgén humano silvestre SOD1 (hSOD1WT) son saludables (Gurney et al., 1994; Wong et al., 1995), pero el incremento de los niveles de hSOD1WT, acompañada por una elevación crónica de actividad dismutasa, o no tiene efecto sobre la enfermedad (Bruijn et al., 1998) o la acelera (Deng et al., 2006; Jaarsma et al., 2000). Teniendo en cuenta estos datos, parece ser que el desarrollo de la enfermedad es más bien debido a un exceso que a un defecto de la función de la SOD1.

La proteína SOD1 mutada induce la enfermedad motora a través de una o más propiedades tóxicas (Figura 2). Por un lado, se ha propuesto que la proteína SOD1 mutada puede producir reacciones químicas aberrantes al reaccionar con sustratos no convencionales, produciendo reacciones de peroxidación, nitración de proteínas o catálisis inversa (formación de O2- a partir de O2), además de liberación de Zn2+ o Cu2+ que pueden resultar tóxicos. La actividad SOD1 es dependiente de la catálisis de Cu2+. El Cu2+ liberado es altamente reactivo y tóxico, y debe estar acoplado sobre SOD1 por una chaperona de Cu2+ para SOD1 (CCS) (Corson et al., 1998; Wong et al., 2000). La unión del Cu2+ a SOD1 se mantiene por un enlace disulfuro conservado, cuya formación está catalizada por CCS (Furukawa et al., 2004). CCS se expresa abundantemente en MNs (Rothstein et al., 1999) y MNs de ratones sin CCS tienen una sensibilidad incrementada a la muerte inducida por axotomía (Subramaniam et al., 2002). Es por ello que se postuló que la incorporación ineficiente de Cu2+ en la SOD1 y/o la disminuida protección al Cu2+ (debido a cambios en la estructura SOD1 como resultado de una mutación) podrían producir una química oxidativa dependiente de Cu2+ atípica, produciendo daño celular y degeneración neuromotora.

Por otro lado, la SOD1 mutada puede formar agregados que se convierten en depósitos tóxicos de proteínas (Figura 2) al inhibir la actividad de chaperonas y/o proteosoma, produciendo el plegamiento aberrante de muchas proteínas. Estos agregados también pueden secuestrar o inactivar a proteínas con importantes funciones celulares o potenciar su toxicidad (Pasinelli & Brown, 2006), desregular funciones de orgánulos como el aparato de Golgi, el retículo endoplásmico y la mitocondria (Figura 3) o alterar el transporte axonal (Boillée et al., 2006).

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Figura 2. Modelos de toxicidad mediada por SOD1 mutada. La inestabilidad de la proteína mutada contribuye a su toxicidad, algunas veces incrementada por la liberación de Zn2+. En el modelo de química redox aberrante, la SOD1 mutada es inestable y su conformación le permite interaccionar con sustratos no convencionales. H2O2 o peroxinitrito (ONOO-) pueden reaccionar con SOD1 reducida (SOD1-Cu+). El oxígeno (O2) puede reaccionar aberrantemente con SOD1 deficiente en Zn2+ para generar un exceso de O2- . La proteína inestable puede también liberar Zn2+ o Cu2+ que pueden ser tóxicos. En el modelo de toxicidad proteica, la conformación alterada e inestable de SOD1 mutada puede formar depósitos tóxicos de proteína. Los agregados SOD1 pueden inhibir la actividad de chaperonas y/o proteosoma, con el consecuente plegamiento aberrante e insuficiente eliminación de numerosas proteínas. Además, estos agregados podrían secuestrar, inactivar o potenciar la toxicidad de otras proteínas cruciales para los procesos celulares. Figura modificada de Pasinelli et al. 2006.

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Figura 3. Toxicidad debida a agregados de proteínas SOD1 mutada causante de ELA. La maquinaria celular que podría estar afectada por falta de plegamiento en un SOD1 mutante incluye la coagrupación de compuestos citoplásmicos esenciales, intoxicación del proteosoma por la inhibición oportuna de la degradación de muchas proteínas celulares, saturación de chaperonas citoplásmicas que catalizan de forma esencial el plegamiento y replegamiento de la proteína, y el daño a la mitocondria por agregación dentro de la superficie del citoplasma y/o transporte dentro del espacio intermembrana de la mitocondria. Modificado de Boillée et al., 2006.

Los agregados son una característica patológica de muchos de los diferentes desórdenes neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA), Parkinson (EP), EH y ELA, entre otras. Se han observado agregados de proteínas citoplásmica en ambos casos de ELA, espontánea y familiar, así como en ratones transgénicos modelo de la enfermedad (Gurney et al., 1994; Wong et al., 1995; Bruijn et al., 1997; 1998; Watanabe et al., 2001).

1.1.2. El ratón transgénico SOD1G93A: un modelo de ELA

En algunos ratones transgénicos la sobreexpresión de la enzima SOD1 humana mutada, desarrolla un fenotipo y unas características patológicas similares a la ELA en humanos (Gurney, 1997; Durand et al., 2006; Pasinelli & Brown, 2006). Las investigaciones realizadas en ratones modelo de la SOD1 mutada están dando numerosas pistas acerca de la causa de la muerte de las MNs en la ELA. El modelo más empleado de ELA familiar es el ratón transgénico SOD1G93A. Este ratón sobreexpresa la Cu/Zn SOD1 citosólica humana mutada, que posee la sustitución de una glicina por una alanina en la posición 93 (G93A) (Gurney et al., 1994), de modo que, cuando expresan aproximadamente 20 copias del transgén, desarrollan una enfermedad similar a la ELA cuyos síntomas comienzan con un temblor sutil y debilidad de las extremidades traseras a los 90 días de edad, y terminan en una parálisis severa de estas extremidades a los 120 días de edad (Moreno-López et al., 2011). Esta sintomatología va acompañada de una degeneración de las neuronas motoras que conducen a la muerte del animal en torno a los 140 días de edad. La rápida evolución de la enfermedad en estos animales los convierte en un modelo óptimo para el estudio en el laboratorio de los mecanismos involucrados en la progresión de la ELA, así como para testar posible tratamientos terapéuticos antes de ser aplicados en estudios clínicos.

1.1.3. Mecanismos fisiopatológicos implicados en la ELA

El principal desafío de las investigaciones actuales en ELA es descubrir el/los mecanismo/s fisiopatológicos que conducen a la muerte de las neuronas motoras. A lo largo de los años se han propuesto numerosos mecanismos patogénicos involucrados en el desarrollo de esta enfermedad: estrés oxidativo, inflamación, alteración del plegamiento de proteínas, deficiencia de factores de crecimiento, desorganización del neurofilamento y transporte axonal defectuoso, disfunción mitocondrial y excitotoxicidad. La ELA es una enfermedad compleja que tiene un origen multifactorial. A pesar de la eficacia significativa de varias terapias potenciales observadas en pruebas preclínicas, los resultados no fueron trasladables a pacientes con ELA (Kuzma-Kozakiewicz & Kwiencinski, 2011). El desarrollo de tratamientos efectivos para la ELA depende estrictamente del entendimiento de la causa primaria de la enfermedad.

La excitotoxicidad mediada por glutamato es uno de los mecanismos más estudiados que contribuyen a la degeneración de las neuronas motoras en la ELA. La excitotoxicidad mediada por glutamato puede inducir lesión neuronal y muerte, como consecuencia de un disparo repetitivo, el cual dirige la entrada de Ca2+ a través de receptores de glutamato tipo AMPA permeables a Ca2+. La prevención de la excitotoxicidad dirigida por glutamato es una función crucial de los astrocitos. En este sentido, uno de los factores implicados en la degeneración de las MNs podría ser la deficiente eliminación de glutamato, ya que tanto los ratones SOD1G93A (Bruijn et al., 1997; Bendotti et al., 2001), como los enfermos de ELA (Fray et al., 1998; Rothstein , 2009), sufren una pérdida selectiva del transportador astroglial de glutamato EAAT2/GTL-1, importante para la recaptación rápida del glutamato sináptico.

Otro mecanismo documentado tanto en MNEs de ratones SOD1G93A (Tortarolo et al., 2006; Zhao et al., 2008), como en pacientes de ELA (Takuma et al., 1999) es un incremento en el número de los canales AMPA permeables a Ca2+. Este aumento ocurre en el modelo murino como consecuencia de una disminución de la expresión de subunidades GluR2 (Van Damme et al., 2002) y de un aumento de las subunidades GluR1 en la sinapsis (Zhao et al., 2008), que podría deberse a la disminución de la liberación por parte de la glía de factores que promueven la síntesis de GluR2 por las neuronas (Van Den Bosch et al., 2006). En cualquier caso, existen cada vez más evidencias que indican que, un exceso de la entrada de Ca2+ en la mitocondria, podría producir grandes cantidades de radicales libres y estrés oxidativo. La elevada excitotoxicidad en cultivos de neuronas corticales de ratones SOD1G93A parece estar mediada por un aumento significativo dependiente de NMDA que eleva los niveles de Ca2+ dentro de la neurona, así como incrementa la producción de especies reactivas de oxígeno en el citosol, mientras que los procesos perjudiciales parecen no estar relacionados con la activación de las rutas de NOS neuronal (nNOS) o ERK1/2 (Nutimi et al., 2011).

Un rasgo común de muchas enfermedades neurodegenerativas es el daño mitocondrial que contribuye al fenotipo degenerativo. La mitocondria se describió como una posible diana para la toxicidad en ELA, ya que en observaciones histopatológicas de las MNs (y músculo) en ambas ELA, esporádica y familiar, la mitocondria aparece vacuolizada y dilatada con crestas y membranas desorganizadas (Afifi et al., 1966; Hirano et al., 1984a; 1984b). Sin embargo, las vacuolas mitocondriales han sido también observadas en ratones con muy altos niveles de proteína hSOD1WT acumulada, los cuáles no desarrollan enfermedad y, están ausentes en ratones que desarrollan la enfermedad con dismutasa inactiva mutada (Bruijn et al., 1997; Jaarsma et al., 2000; Jaarsma et al., 2001; Jonsson et al., 2006). Por tanto, estas vacuolizaciones no pueden ser un mecanismo patogénico primario/común de degeneración neuromotora. Aún sigue sin estar claro cómo los mutantes SOD1 afectan a la función mitocondrial, pero se detallan diferencias en la composición proteica entre la población mitocondrial mutante y no mutante (Fukada et al., 2004; Kirby et al., 2005; Lukas et al., 2006).

Es importante anotar que el genoma mitocondrial codifica para solo 13 proteínas de las 1500 requeridas para sus funciones. La mayoría de las proteínas mitocondriales son codificadas en el núcleo y éstas son sintetizadas en el citosol y transportadas posteriormente al interior de la mitocondria. La importación de la mayoría de proteínas mitocondriales está mediada por translocadores de multisubunidades que abarcan la membrana externa e interna (TOM y TIM). La SOD1 mutada asociada y/o agregada sobre la superficie mitocondrial podría impedir el mecanismo de importación (Liu et al., 2004). En la médula espinal de dos modelos mutantes de SOD1 diferentes, se ha observado una disminución temprana en la capacidad de tamponamiento mitocondrial del Ca2+ previo a la aparición de los síntomas (Damiano et al., 2006). Este es quizás el más convincente de los hallazgos, que relaciona un fallo en el control mitocondrial de la homeostasis del Ca2+, que es completamente compatible, con mecanismos excitotóxicos que puede ser central para el daño neuronal (Figuras 4 y 5).

Un aspecto central de la muerte neuronal es probablemente un mecanismo final de apoptosis, con la liberación por parte de la mitocondria del citocromo C y la activación de la caspasa-3 efectora, en modelos de muerte neuronal en ratones (Li et al., 2000; Pasinelli et al., 2000); y disminución de antiapoptótico Bcl-2 en MNEs de pacientes con ELA (Ekegren et al., 1999; Mu et al., 1996) y de ratones mutantes SOD1 (González de Aguilar et al, 2000; Vukosavic et al., 2000). Recientemente se ha demostrado que la activación de caspasa-3 en células gliales inactiva proteolíticamente el transportador de glutamato EAAT2 (Boston-Howes et al., 2006). EAAT2 se pierde selectivamente durante el curso de la enfermedad y se considera clave en el daño excitotóxico (lo que puede conllevar de forma adicional a la disfunción mitocondrial). Esto proporciona un interesante mecanismo que une disfunción mitocondrial con excitotoxicidad. Se ha propuesto un mecanismo alternativo, donde la SOD1 mutada interactúa con Bcl-2 e interfiere posiblemente con la actividad antiapoptótica de Bcl-2 (Pasinelli et al., 2004), siendo un mecanismo muy atractivo pero a la vez muy discutido (Gould et al., 2006). Sin embargo, la elevada expresión constitutiva de Bcl-2 (Kostic et al., 1997) o inducida por administración de virus que conducen a la sobreexpresión de Bcl-2 en MNs (Azzouz et al., 2000), las protege, retrasando el inicio de la enfermedad pero no así su progresión.

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Figura 4. El daño mediado por la SOD1 mutante a la mitocondria viene mediado por su entrada dentro la mitocondria o su depósito sobre la mitocondria en tejidos afectados. Modelo esquemático de los mecanismos por los que la SOD1 mutante podría dañar la función mitocondrial. La SOD1 mutante puede interferir con los elementos de la cadena transportadora de electrones, alterando de esta manera la fosforilación oxidativa generadora de ATP. También puede alterar los mecanismos tamponadores de Ca2+ citosólico. Los agregados de SOD1 mutantes pueden interferir con factores de la maquinaria apoptótica dependiente de la mitocondria, tales como Bcl-2, iniciando así la activación prematura de una cascada apoptótica, incluyendo la liberación de citocromo C en el citosol. La SOD1 mutante puede indirectamente afectar rutas de importación de proteínas mitocondriales por bloqueo físico de sus translocadores (TOM y TIM). El daño oxidativo producido sobre diversas proteínas mitocondriales pueden también contribuir a la disfunción mitocondrial en general. Colectivamente, estos mecanismos (o una combinación de los mismos) podrían perturbar la homeostasis celular (dentro de la glia y/o las MNs), y en última instancia, activar la muerte de la MN. Modificado de Boillée et al., 2006.

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Figura 5. Esquema de la evolución de la degeneración de la MN y activación glial durante el curso de la ELA en mutantes SOD1. La toxicidad es producida por una combinación de daños causados directamente dentro de las MNs, que es central en la iniciación de la enfermedad, y daños en las células vecinas no neuronales, incluyendo astrocitos y microglia, cuyas acciones amplifican el daño inicial y conducen a la progresión de la enfermedad. La vulnerabilidad selectiva de las MNs, aún cuando la SOD1 mutante se expresa de forma ubicua, está determinada por las propiedades funcionales únicas de las MNs (ej., son células muy grandes con grandes cargas biosintéticas, altas tasas de disparo, escasa presencia de proteínas tamponadoras de Ca2+ y responden a entradas de glutamato sinápticas) y daña a las células vecinas que actúan de soporte, que sufren una pérdida selectiva del transportador astroglial de glutamato EAAT2/GTL-1, importante para la recaptación rápida del glutamato sináptico. Modificado de Boillée et al., 2006.

Por otro lado, el aumento de las concentraciones de K+ a niveles superiores a los fisiológicos ha demostrado tener un efecto excitotóxico sobre las MNs (Kaiser et al., 2006; Gou-Fabregas et al., 2009). En este sentido se ha descrito una pérdida progresiva de la expresión de los canales Kir4.1 en la astroglía de animales SOD1G93A. Estos canales se encargan de tamponar los niveles de K+ extracelular y, por tanto, un déficit de estos canales podría ser perjudicial para las MNs. Además, también se ha sugerido el papel de estos canales en el establecimiento del potencial de membrana de las células gliales, lo que podría determinar los gradientes transmembrana de muchas moléculas transportadas tales como el glutamato (Neusch et al., 2001; 2006; Kaiser et al., 2006).

También se ha propuesto, como una posible causa de la degeneración motora, el desbalance entre aferencias inhibidoras y excitadoras a las MNs, (Sunico et al., 2011). De hecho, las investigaciones inmunohistoquímicas de proteínas pre-sinápticas (sinaptofisina y sinapsina-1) han revelado, como una característica de la enfermedad, la degeneración de los terminales sinápticos. La eliminación de sinapsis ocurre incluso en enfermos donde no hay daños en las neuronas motoras superiores ni en el tracto corticoespinal (Moreno-López et al., 2011). Esto sugiere que la pérdida de cobertura sináptica no es una consecuencia de la muerte de las neuronas motoras corticales y apoya una progresión de la muerte desde las MNs inferiores hasta las corticales. Los estudios funcionales (estimulación magnética transcraneal, PET e hibridación in situ), parecen apuntar a un descenso de las sinapsis inhibidoras, lo que podría facilitar la muerte por excitotoxicidad de las MNs. Así, en experimentos realizados en ratones SOD1G93A se demuestra que estos ratones sufren la pérdida progresiva de la cobertura sináptica desde los estados sintomáticos tempranos. En concreto, nuestro grupo demostró que las MNHs a P90 sufrían un incremento en el número de botones excitadores y una reducción de los inhibidores (Sunico et al., 2011). La desinhibición motora junto con la sobreexcitación podría explicar la hiperreflexia y el temblor inicial en estos ratones (Gurney, 1997; Hayworth & Gonzalez-Lima, 2009); y el aumento en los reflejos espinales en pacientes de ELA (Gurney , 1997).

Del mismo modo se ha descrito que una alteración en el metabolismo de las proteínas responsables del mantenimiento de la estructura de la neurona podría dar lugar a la ELA. En este sentido, se han detectado alteraciones de la estructura axonal en pacientes (Kawamura et al., 1981; Hirano et al., 1984a; 1984b) y en ratones SOD1 mutantes (Wong et al., 1995; Bruijn et al., 1998; Kong & Xu, 1998), especialmente en el ensamblaje anormal y la acumulación de los neurofilamentos, los componentes estructurales más abundantes de los grandes axones mielinizados (Shaw, 2005). Se han visto acumulaciones de neurofilamentos de manera temprana en ratones SOD1 mutantes (Kong & Xu, 1998). Concordando con esto, en ratones SOD1 mutantes, se ha observado un déficit pre-sintomático de transporte axonal (Zhang et al., 1997; Williamson & Cleveland, 1999; Ackerley et al., 2003). Existe una conexión entre las alteraciones del transporte axonal y la neurodegeneración (Perlson et al., 2010). Los defectos en el transporte son suficientes para inducir neurodegeneración. Hallazgos recientes sugieren que cambios en las rutas de señalización retrógrada establecen una correlación con una muerte progresiva rápida de la neurona.

Otros mecanismos, pero no menos importantes, que afectan al desarrollo de la ELA son debidos a: la deficiencia de factores neurotróficos en las MNs dañadas; la formación de agregados proteicos intracelulares debido a la alteración del plegamiento de proteínas mutantes; la muerte por degeneración motora compatible con apoptosis y el incremento de moléculas asociadas con ésta; el metabolismo anormal del ARN y/o una respuesta local inmunitaria, al igual que en otras enfermedades degenerativas del sistema nervioso como el PD o el AD (Shaw, 2005; Ferraiuolo et al., 2011; Kuzma-Kozakiewicz & Kwiencinski, 2011). En cuanto a los procesos inflamatorios, recientemente ha aumentado el interés por la posibilidad de que los astrocitos o la microglía contribuyan a la patogenia de la ELA. La activación de la microglía se asocia con su transformación en células fagocíticas capaces de liberar moléculas citotóxicas como especies reactivas del oxígeno, NO, proteasas y citoquinas. La proliferación de células de la microglía activadas es una característica histológica prominente en el asta ventral espinal en la ELA y parece mediar la toxicidad sobre neuronas al liberar factores que aumentan la excitotoxicidad (Shaw, 2005).

Todos estos mecanismos que hemos revisado, de forma aislada o combinada pueden contribuir a la degeneración de las neuronas motoras, y por ende, pueden, potencialmente, ser importantes dianas terapéuticas de cara al futuro para el tratamiento de la ELA.

1.1.4. Papel del NO en la degeneración neuronal

El NO y sus derivados pueden afectar a la supervivencia neuronal de diversas formas. Los niveles elevados de NO inducen necrosis como consecuencia de una depleción de energía, debida a: i) la rápida inhibición de la respiración mitocondrial, ii) una lenta inhibición de la glicolisis, iii) liberación del citocromo C, y/o iv) activación de la poli-ADP-ribosa polimerasa por ONOO-. Sin embargo, si los niveles de energía se mantienen, el NO puede inducir apoptosis mediante la activación de p53, p38 MAPK o estrés de retículo endoplásmico (Brown, 2010).

Sin embargo, niveles bajos de NO pueden bloquear la muerte celular por la inducción de vasodilatación, activación de Akt o bloqueo de la permeabilización de la mitocondria (Brown, 2010). Y altos niveles pueden también favorecer la supervivencia al proteger de patógenos, activar a NF-κß, producir la inhibición de caspasas y también del receptor NMDA por S-nitrosilación (Brown, 2010).

La sobreexpresión o expresión de novo de diferentes isoformas de NOS es una característica común en muchas enfermedades neurodegenerativas crónicas, tales como la enfermedad de EP, EA, EH, ELA, esclerosis múltiple (EM) o demencia asociada a la infección por VIH (Norris et al., 1996; Moreno-López & González-Forero, 2006). También se han detectado incrementos en los niveles de NO, que han sido asociados con muerte celular excitotóxica, en animales modelo de ictus cerebral, tinitus y neurodegeneración (Lipton, 2004; Zhang et al., 2006) (Figura 6) . Asimismo, se ha relacionado al NO con la patofisiología de la migraña y la epilepsia, aunque los datos disponibles son contradictorios y el papel del NO en la epilepsia no está claro todavía (Prieto-Martín et al., 2012). En multitud de neuropatías periféricas adquiridas, como por ejemplo la lesión de un nervio motor (Sunico et al., 2005), las MNs, células que normalmente carecen de nNOS, sobreexpresan también esta enzima (Moreno-López, 2010).

Existen datos que sugieren que las neuronas que expresan la nNOS son muy susceptibles a degenerar en diversos procesos neuropatológicos. Es el caso de las neuronas nitrérgicas en la corteza entorrinal y en el hipocampo, en la AD (Thorns et al., 1998). Asimismo, en la ELA, en diversas neuropatías periféricas y otras muchas enfermedades que cursan con la sobreexpresión de nNOS van acompañadas también de la muerte de neuronas. Además, la inhibición de la producción de NO previene el parkinsonismo inducido experimentalmente (Hantraye et al., 1996; Itzhak & Ali, 1996; Moreno-López & González-Forero, 2006). Todos estos datos sugieren una posible relación entre la expresión de nNOS y la degeneración neuronal.

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Figura 6. Esquema que representa algunas enfermedades neurodegenerativas que se caracterizan por un aumento de los niveles de NO en las regiones afectadas. Fuente: Obtenida de la tesis titulada “Regulación por óxido nítrico de la expresión en membrana de canales de fuga de potasio en motoneuronas: posible implicación en la sensibilización a estímulos excitotóxicos”, de Laura Gómez-Pérez (2012).

Recientemente, se ha descrito un papel clave del NO en la pérdida de botones sinápticos en animales modelo de ELA (SOD1G93A), que se caracterizan por la expresión de novo y/o sobreexpresión de nNOS en las MNs. El NO, sintetizado en condiciones patológicas por la motoneurona, parece actuar de forma paracrina y retrógrada sobre los botones sinápticos, activando la vía de señalización GCs/PKG/RhoA/ROCK que, corriente abajo, produciría un aumento de la forma fosforilada de la cadena ligera de la miosina (p-MLC). Esto, finalmente, conduciría a la activación del aparato de contracción actina/miosina y a la retracción del axón (Sunico et al., 2010; Moreno-López et al., 2011).

En el modelo de ELA pre-sintomático, este mecanismo provoca una disminución del número entradas inhibidoras que, en cambio, podría contribuir al aumento de la excitación de la MN, y explicaría la hiperreflexia y el temblor de estos animales como primeros síntomas de la enfermedad (Moreno-López et al., 2011). Se piensa que, en la ELA, la nitración de los neurofilamentos está relacionada con la patogénesis de esta enfermedad, donde se han detectado niveles altos de 3-nitrotirosina en la médula espinal, aunque la inmunorreactividad para la nitrotirosina se localiza también en agregados neurofilamentosos de las neuronas de la corteza. La síntesis del NO en este tipo de enfermedad procede principalmente de la isoforma nNOS en estas neuronas (Wong & Strong, 1998). Además, los neurofilamentos ligeros de los axones son particularmente susceptibles a la nitración mediada por el peroxinitrito (Strong et al., 1998; Strong, 1999).

Se sabe que el NO induce un aumento de la excitabilidad neuronal, lo que podría sensibilizar a las MNs a la muerte en animales modelos de ELA (Raoul et al., 2002; Kuo et al., 2005). La hiperexcitabilidad de la neurona la sensibiliza a la muerte por excitotoxicidad. Por ello, la inhibición farmacológica del mecanismo por el cual el NO induce hiperexcitabilidad neuronal, tendría interés tanto básico como clínico.

Por otro lado, se ha descrito que el NO activa, a través de Fas, una ruta de muerte por apoptosis, que parece ser exclusiva de MNs y en la que participan Daxx, ASK1 y p38 junto con la cascada clásica FADD/caspasa -8 (Raoul et al., 2002).

1.1.5. Evidencias del papel del NO en la ELA

La producción de radicales libres, como consecuencia de la formación excesiva de NO, participa en la patogénesis de muchas enfermedades neurodegenerativas incluidas la ELA, tanto esporádica como familiar. Así, por ejemplo, en el fluido cerebro-espinal y en el suero sanguíneo de enfermos de ELA, se han detectado altos niveles de nitrito (NO2-) y nitrato (NO3-), medida indirecta de los niveles de ONOO- (Beckmann et al., 1994). Estudios inmunohistoquímicos demuestran que en la ELA existe una sobreexpresión de la nNOS y de la iNOS, tanto en las MNs como en los astrocitos del asta anterior de la médula espinal (Moreno-López et al., 2011). La mayoría de las MNs con morfología normal no expresan iNOS, sin embargo, sí la expresan aquellas que están degenerando (Sasaki et al., 2001). Así mismo, las MNs con signos de degeneración suelen expresar también mayores niveles de nNOS, en concreto la nNOSα. En cambio, los astrocitos expresan los subtipos nNOSß y nNOSγ, pero no nNOSα (Catania et al., 2001). La sobreexpresión de la nNOS ocurre antes que la expresión de iNOS tanto en MNs como en astrocitos, lo que sugiere que mientras que la nNOS participa desde los inicios de la enfermedad, la iNOS lo hace sobre todo en las últimas etapas de la misma. La expresión de la isoforma iNOS sigue un curso temporal paralelo a la gliosis y a la pérdida de MNs en ratones transgénicos SOD1G93A (Moreno-López et al., 2011) (Figura 7).

También se ha determinado, indirectamente, un aumento de los niveles de NO en el líquido cerebroespinal, encéfalo y médula espinal de los ratones SOD1G93A en el estadio sintomático temprano de la enfermedad (análisis de niveles de citrulina por HPLC) (Lee et al., 2009).

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Figura 7. Fuentes de NO en el curso de la ELA. Durante el transcurso de la ELA, se produce la sobreexpresión de la isoforma Ca2+ dependiente nNOS y también de la constitutivamente activa iNOS tanto en MNs como en glía. En el modelo de ratón SOD1G93A la sobreexpresión en MNs de nNOSα y en menor medida iNOS comienza en el estadio pre-sintomático (A) y aumenta en el estadio sintomático temprano (B). Más tarde se produce la sobreexpresión de las isoformas nNOSß y nNOSγ junto con iNOS en las células gliales durante el estadío sintomático temprano. Las MNs sufren la pérdida de la cobertura sináptica en la transición entre el estadio pre-sintomático al sintomático temprano. La actividad de nNOS se incrementa significativamente en los estadíos presintomáticos mientras que la actividad iNOS aumenta al comienzo de los estadíos sintomático temprano. Figura modificada de Moreno-López et al., 2011.

También se ha descrito que las MNs SOD1G93A son más susceptibles al tratamiento con NO exógeno que las MNs controles. Esto se debe a que el NO induce la expresión del ligando de FasL en las MNs SOD1G93A, pero no en las controles. La activación de Fas produce la muerte de las MNs por la activación de la caspasa 8 mediada por Fad, proceso por el que las MNs tardan días en morir. Además la activación de Fas induce un incremento de la síntesis de NO por nNOS, mediante la fosforilación de p38 mediada por Daxx, que retroalimenta la activación de Fas (Raoul et al., 2006).

Por otro lado, la inhibición de las corrientes de fuga de K+ tipo TASK, descrita por nuestro grupo, inducida por la sobreproducción de NO (González-Forero et al., 2007), podría estar sensibilizando a las MNs a la muerte excitotóxica que acontece durante el desarrollo de la ELA como consecuencia de la excesiva estimulación glutamatérgica y la alteración de la homeostasis del K+. Estudiar la implicación de esta vía de señalización en un modelo murino de ELA también será objeto de estudio en este trabajo.

1.1.6. Tratamientos en pacientes con ELA

La ELA representa la patología de neuronas motoras más común en la edad adulta y se caracteriza por una selectiva degeneración de estas células. Clínicamente, en la ELA coexisten signos de alteraciones de las neuronas motoras superiores, tales como la espasticidad y la hiperreflexia, junto con otros propios de la afectación de las MNs, tales como atrofia muscular y fasciculaciones. El principal desafío de las investigaciones actuales en ELA es descubrir el mecanismo principal que produce la muerte selectiva de estas neuronas. A lo largo de los años se han propuesto numerosos mecanismos patogénicos involucrados en el desarrollo de esta enfermedad: estrés oxidativo, inflamación, alteración del plegamiento de proteínas, deficiencia de factores de crecimiento, desorganización de neurofilamentos ocasionando transporte axonal defectuoso, disfunción mitocondrial y excitotoxicidad por glutamato. Por tanto, la ELA constituye una enfermedad compleja de origen multifactorial.

Hoy en día sólo hay un único tratamiento farmacológico aprobado para ELA denominado Rilutek® (Riluzole). El riluzole es un antagonista del glutamato y es el primer fármaco que ha demostrado tener efecto benéficioso al atenuar la progresión de la enfermedad, si bien no de manera llamativa pero sí significativamente (Jung et al, 1994). El riluzole solo mejora la supervivencia del paciente en 2-3 meses de vida. Por tanto, el tratamiento con este agente bloqueante del glutamato es insuficiente, pues no evita la progresión de la enfermedad, requiriendose el uso de tratamientos sintomáticos para paliar las consecuencias de la enfermedad, tales como la espasticidad, problemas en el habla y deglución, y la ventilación asistida para tratar el fallo respiratorio.

Se considera que la excitotoxicidad provocada por la sobre-estimulación de los receptores glutamatérgicos, es un componente importante del daño neuronal ocasionado por una lesión aguda de la médula espinal. En este sentido se ha demostrado que, en este tipo de lesión, la pérdida de neuronas provocadas por excitotoxicidad tienen un grave impacto sobre la función locomotora y, a diferencia de lo que ocurre con el modelo de ELA, no puede ser bloqueada satisfactoriamente induciendo una fuerte neurodepresión con riluzole, por lo que es necesario la aplicación de nuevos fármacos más efectivos que puedan retrasar o disminuir la progresión de los déficits motores y prolongar así la supervivencia (Sámano et al., 2012).

Se están estudiando otros fármacos en modelos de degeneración espontánea de MNs como posibles alternativas al riluzole, para lograr un retraso en la pérdida neuronal. Entre ellos se están estudiando diferentes factores neurotróficos (BDNF, GDNF) (Glicksman, 2011). Existen trabajos recientes que demuestran la existencia de nuevas drogas no aprovadas por la FDA que podrían aumentar la esperanza de vida de los pacientes con ELA, como el Ciclohexano 1,3-diones (Zhang et al., 2012), un inhibidor de la agregación de proteínas dependiente de SOD1 mutada; la proteína C activada (APC) (Zhong et al., 2009), que inhibe la síntesis de SOD1 en neuronas, que requiere a su vez de los receptores activados por proteasas tipo 1 y 3 (PAR1 y PAR3) para inhibir el transporte nuclear del factor de transcripción Sp-1; el ariclomol (Kalmar et al., 2008), que previene la agregación de proteínas ubiquitinadas en la médula espinal de ratones SOD1G93A. De momento, este último fármaco es el único que parece ser efectivo, incluso cuando el tratamiento se incia después de la etapa sintomática de la enfermedad (75 días), prolongando la esperanza de vida y la función muscular de los ratones modelo de ELA cuando las MNs están bajo unos niveles de estrés muy elevados. Otra de las terapias utilizadas es el método de silenciamiento de genes a través de la inserción de ARNs interferentes (shRNAs) encapsulados en retrovirus, que se han mostrado eficaces para retrasar el inicio y la progresión de la enfermedad, pero solo cuando la administración se realiza en animales jóvenes (Raoul et al., 2005).

En base a los resultados obtenidos en diferentes trabajos, podemos concluir que el bloqueo farmacológico, así como la manipulación de la expresión de diferentes factores, establecen la base para la comprensión y el desarrollo de posibles terapias dirigidas al tratamiento de patologías asociadas a la muerte neuronal, en particular, la creación y uso de posibles herramientas terapéuticas para el tratamiento de la ELA.

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