Im Februar letzten Jahres (2003), wurde bei fast 9000 Personen rund um den Globus SARS diagnostiziert, wovon etwa 800 an den Folgen dieser Krankheit gestorben sind. Auch dieses Jahr sind wieder im Winter einige (~9) Fälle von SARS aufgetreten, die aber auf einen Vorfall in einem Labor in Beijing zurückgeführt werden konnten (www.wpro.who.int/sars). Der neue Coronavirus Typ wurde aus den befallenen Geweben der Patienten isoliert und als der Auslöser der Erkrankung erkannt. Bisher gibt es keine Behandlungsmöglichkeiten gegen diesen neu aufgetretenen Erreger.
Die Coronaviren sind positiv Einzelstrang (+) RNA Viren und gehören zusammen mit den Arteriviridae und Roniviridae zu der Ordnung der Nidovirales. Das Genom des SARS-Coronavirus umfasst etwa 30 kB und hat am 5´-Ende eine Cap-Struktur und am 3´-Ende eine Poly(A)sequenz. Nach der Infektion wird das 5´ - ORF (open reading frame) zu einem grossen Polyprotein translatiert. Dieses Polyprotein wird durch virale Proteinasen an konservierten Stellen geschnitten, wodurch einige nichtstrukturelle- Proteine, darunter RNA abhängige RNA-Polymerase (REP), Adenosintriphosphatase (ATPase) und Helicase (Hel) freigesetzt werden. Diese Proteine sind ihrerseits für die virale Replikation verantwortlich (Snijder et al., 2003). Diese Arbeit befasst sich mit der Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 des SARS Coronavirus. Die Kristallisation ist die Vorraussetzung für die Strukturbestimmung dieses Proteins und benötigt einen sehr hohen Reinheitsgrad des betreffenden Proteins. Die Struktur könnte eventuell helfen, die bis zu diesem Zeitpunkt unbekannte Funktion des Proteins aufzuklären, welches eventuell für die RNA Bindung verantwortlich sein könnte. Die strukturellen Studien könnten auch für das rationale Drug design nützlich sein. Zwar sind aktuell keine Fälle von SARS aufgetreten, doch die Epidemiologen halten ein erneutes Auftreten in der Zukunft für möglich. Deshalb ist es die beste Vorbereitung, sich mit der gesamten Biologie des Virus zu befassen, um auf mögliche Ausbrüche von SARS vorbereitet zu sein.
Inhaltsverzeichnis
- Zusammenfassung
- Einleitung
- Coronaviren
- SARS coronavirus und Replikationsstrategie
- Zielsetzung
- Materialien und Methoden
- Materialien
- Chemikalien
- Geräte
- Methoden
- Expression von nsp8
- Expression der Vorkultur
- Induktion und Überexpression von nsp8
- Ernte und Aufschluss der E. coli Zellen
- Aufreinigung von nsp8
- Aufreinigung mittels NiNTA Affinitätssäule
- Elution des Nicht-Struktur Proteins8(nsp8) von der NiNTA Affinitätssäule
- Einengen des Probenvolumens durch AmiconⓇ UFZ
- Aufreinigung des nsp8 durch Gelfiltration (Grössenfraktionierung)
- SDS-PAGE
- Bestimmung der Proteinkonzentration
- Aufkonzentrierung der nsp8 Proteinlösung
- Kristallisation von nsp8
- Phasendiagramm
- Löslichkeitskurve (Solubility Curve)
- Metastabile Zone (Metastable Zone)
- Nukleationszone (Nucleation Zone)
- Präzipitationszone (Precipitation Zone)
- Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am hängenden Tropfen
- Kristallisation mittels Verdunstungsdiffusion am sitzenden Tropfen
- Bestimmung der Löslichkeitsgrenze für (NH4)2SO4, PEG 6k und NaCl
- Kristallisationsexperimente (Allgemein)
- Kristallisation von nsp8
- Überprüfung der Kristalle
- Ergebnisse und Diskussion
- Expression und Aufreinigung von nsp8
- Kristallisation von nsp8
- Literatur
- Abkürzungen
- Anhang (Abbildungen 19, 20 (a + b) und 21)
- Expression des nsp8 Proteins in E. coli Zellen
- Aufreinigung des nsp8 Proteins durch verschiedene chromatographische Verfahren
- Kristallisation von nsp8 unter Verwendung verschiedener Methoden
- Strukturbestimmung des nsp8 Proteins durch Röntgenkristallographie
- Aufklärung der Funktion des nsp8 Proteins
- Zusammenfassung: Die Zusammenfassung fasst die zentralen Ergebnisse der Arbeit zusammen und stellt die Bedeutung der Forschung im Kontext des SARS-Coronavirus heraus.
- Einleitung: Die Einleitung gibt einen Überblick über die Biologie der Coronaviren, insbesondere des SARS-Coronavirus, und erläutert die Replikationsstrategie des Virus. Die Zielsetzung der Arbeit wird ebenfalls in diesem Kapitel vorgestellt.
- Materialien und Methoden: Dieses Kapitel beschreibt die verwendeten Materialien, einschließlich Chemikalien, Geräte und Verfahren. Detaillierte Informationen zur Expression, Aufreinigung und Kristallisation von nsp8 werden bereitgestellt.
- Ergebnisse und Diskussion: Die Ergebnisse der Experimente werden dargestellt und im Kontext der bisherigen Forschung diskutiert. Die Interpretation der Ergebnisse und ihre Bedeutung für die zukünftige Forschung werden ebenfalls beleuchtet.
- Literatur: Dieses Kapitel enthält eine umfassende Liste der relevanten wissenschaftlichen Publikationen, die in der Arbeit zitiert werden.
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus. Die Kristallisation von nsp8 ist ein entscheidender Schritt zur Strukturbestimmung dieses Proteins, die wiederum wichtige Erkenntnisse über seine Funktion und potenzielle Rolle in der Virusreplikation liefern könnte. Der hohe Reinheitsgrad des Proteins ist eine wesentliche Voraussetzung für die erfolgreiche Kristallisation.
Zusammenfassung der Kapitel
Die Arbeit gliedert sich in mehrere Kapitel, die die einzelnen Schritte der Proteinproduktion und -kristallisation beleuchten.
Schlüsselwörter
Die Arbeit befasst sich mit dem nicht-strukturellen Protein 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus. Wichtige Schlüsselbegriffe sind Expression, Aufreinigung, Kristallisation, Strukturbestimmung, RNA-Bindung, Drug Design, SARS, Coronaviren, Replikation.
- Citation du texte
- Wilhelm Bohr (Auteur), 2004, Expression, Aufreinigung und Kristallisation des nicht-strukturellen Proteins 8 (nsp8) aus dem SARS-Coronavirus, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/32526
