Strukturmodellierung und Docking. Gen: Zebrafink XP_002187388

Abschlussprotokoll im Praktikum Molecular Modelling 2014


Praktikumsbericht / -arbeit, 2014

21 Seiten, Note: 1.0


Leseprobe

Inhalt

1 Einleitung

2 Erstellung des Modells eines Opioid-Rezeptors sowie Simulation der Bindung von Agonis-ten und Antagonisten
2.1 Sekundärstrukturanalyse
2.1.1 Sequenzalignment, Scoring Funktion, Scoring Matrix
2.1.2 Unterschied lokales – globales Alignment
2.1.3 Betrachtung der Aminosäuresequenz sowie Vorhersage der Sekundärstruktur
2.1.4 Erstellung einer Vorhersage für transmembrane Proteine mithilfe von Transmem
2.1.5 Erstellung eines Sequenzalignments von 2RH1 und 4DKL
2.1.6 Erstellung eines Sequenzalignments von 4DKL sowie 2IQO (transmembraner Teil eines GPCRs)
2.2 Homologiemodell
2.2.1 paarweises und multiples Alignment
2.2.2 + 2.2.3 Unterschied von BLAST produzierten Alignments und multiplem Alignment sowie Funktionsweise von BLAST
2.2.4 Beschreibung des Ramachandran-Plots
2.2.5 Schwierigkeit der Erstellung eines Homologiemodells für ein TM-Protein
2.2.6 Vergleich der Sequenz des Rezeptors des Zebrafinken und von 4DKL
2.2.7 Erstellung eines multiplen Sequenz- und Strukturalignment mithilfe von BLAST
2.2.8 Erstellung von Homologiemodellen der drei Templates
2.2.9 Berechnung der RMSD-Werte ausgehend von den Homologiemodellen und den Templates
2.2.10 Evaluierung und Verbesserung des Homologiemodells
2.3 Docking
2.3.1 Zwei Bestandteile des molekularen Dockings
2.3.2 Unterschied zwischen starrem und flexiblem Docking
2.3.3 Probleme und Ursachen beim Docking
2.3.4 Berechnungen mithilfe der Scoring-Funktion
2.3.5 Aufbau der PLP-Funktion
2.3.6 Kürzung des Terminus bei Met-Enkephalin
2.3.7 Docking eines Agonisten mit anschließender Dynamiksimulation und darauffolgendem Vergleich der Strukturen
2.3.8 Gedockte Positionen stimmen schlecht mit der Kristallstruktur überein - Darlegung bestimmter Berücksichtigungen
2.3.9 Selektivität von Naltrindole
2.3.10 Feedback

3 Literatur

1 Einleitung

Die Verwendung von schmerzlindernden Substanzen (Analgetika) ist eine der ältesten medizinischen Behandlungen von Patienten. Bereits im 16. Jhd. untersuchte Paracelsus in Feldversuchen die Wirkung entsprechender Pflanzen, wie Johanneskraut.[13],[14] War man damals noch auf die Pflanzen selbst angewiesen, ist es heute möglich die bioaktiven Substanzen oft im Labor zu synthetisieren und deren genauen Wirkmechanismus zu bestimmen. Die moderne Klassifizierung der Analgetika ist die, der Opioide und Nicht-Opioide.[15] Nichtopioide wirken über die Hemmung von Cyclooxygenasen[16] und Opioide über die Opiodrezeptoren, sodass beide die wirkungsvolleren Arzneimittel darstellen. Die Opioidrezeptoren lassen sich in die μ-, κ- und δ-Rezeptoren unterteilen, wobei die μ- und κ-Rezeptoren für die analgetische Wirkung verantwortlich sind.[17] Diese Rezeptoren sind GPCRs (G-Protein Coupled Receptors), die als charakteristisches strukturelles Merkmal sieben Transmembranhelices besitzen. [18] Am intrazellulären Loop 3, dieser verbindet TM5 mit TM6, bindet bei Aktivierung des Rezeptors das G-Protein und induziert somit eine Signalkaskade.

Im Zuge der folgenden Arbeit wird aus der bekannten Aminosäuresequenz eines bisher unbekannten Opioid-Rezeptors des Zebrafinken ein Modell erstellt, an welchem die Bindung von Agonisten und Antagonisten modelliert und anschließend bewertet werden.

2 Erstellung des Modells eines Opioid-Rezeptors sowie Simulation der Bindung von Agonis-ten und Antagonisten

2.1 Sekundärstrukturanalyse

2.1.1 Sequenzalignment, Scoring Funktion, Scoring Matrix

Ein Sequenzalignment dient zum Vergleich zweier oder mehrerer Aminosäuresequenzen, um den Konservierungsgrad festzustellen. Angewendet wird dieses Prinzip v.a. in der Bioinformatik, um evolutionäre Verwandtschaften festzustellen.[1]

Eine sogenannte Scoring Funktion beschreibt den Grad der Ähnlichkeit eines Alignments zweier Aminosäure-Sequenzen. Dabei wird zwischen Identität, Ähnlichkeit oder Fehlen einer vergleichbaren Aminosäure am jeweiligen Ort unterschieden.[3]

Die Scoring Matrix ist eine Substitutionsmatrix, die angibt mit welcher relativen Rate eine Aminosäure im Laufe der Evolution in eine andere mutiert. Der Eintrag aij zeigt die relative Rate an, mit der die Aminosäure i zu j mutiert. Die Matrix wird oft dazu verwendet, um ein durchgeführtes Alignment zu bewerten, wobei BLOSUM und PAM häufig verwendete Matrizen sind.[2]

2.1.2 Unterschied lokales – globales Alignment

Sowohl bei dem lokalen, als auch bei dem globalen Alignment handelt es sich um ein paarweises Alignment. Dies bedeutet, dass nur zwei Sequenzen miteinander verglichen werden. Bei einem globalen Alignment werden die kompletten Aminosäure-Sequenzen betrachtet, sodass die Zuordnung von Protein-Familien erleichtert wird. Bei einem lokalen Alignment werden nur relevante Bereiche betrachtet, um konservierte Bereiche zu finden, z.B. Gene.[4]

Zunächst wurde aus der Database das Protein 4DKL heruntergeladen sowie geöffnet, wobei es sich um die Kristallstruktur eines μ-Opioid-Rezeptors mit gebundenen Liganden handelt.

Die Visualisierung der molekularen Oberfläche (Soft) zeigt im unteren Teil des Moleküls in Abbildung 1 sehr geringe Ladungen (rote und blaue Bereiche), die somit höchstwahr scheinlich in der lipophilen Membran eingebunden sind. Um die intra- und extrazuellulären Bereiche festzulegen, werden die Bindestellen der Liganden bestimmt. Diese liegen in Abbildung 1 ebenfalls im unteren Bereich. Dort muss der extrazelluläre Raum zu finden sein, da der Ligand von außerhalb der Zelle kommt. Diese Hypothese wird durch Abbildung 2 unterstützt, in welcher der untere Teil die sieben transmembranen Helices eines GPCRs darstellt. Somit muss der obere Teil des Moleküls intrazellulär liegen, wobei es sich um den Loop 3 handelt, an welchem das G-Protein koppelt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 1

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 2

2.1.3 Betrachtung der Aminosäuresequenz sowie Vorhersage der Sekundärstruktur

Abbildung 3 enthält die ersten 30 Aminosäuren und die von Discovery Studio (DSC) vorhergesagte Sekundärstruktur, wobei die blauen Pfeile für β-Faltblätter stehen. In Abbildung 4 ist die reale Kristallstruktur des TM-Rezeptors visualisiert, worin der gelb markierte Bereich den ersten 30 Aminosäuren entspricht. Entgegen der Vorhersage von DSC, handelt es sich allerdings in der Realität um eine α-Helix. Somit stimmt die Vorhersage von DSC überhaupt nicht mit der tatsächlichen Struktur des Rezeptors im intrazellulären Bereich überein. Dies liegt daran, dass DSC nur eine Vorhersage für ein freiliegendes Protein erstellt. Allerdings macht es einen Unterschied, ob sich das Protein frei falten kann, oder sich in Umgebung einer Zelle befindet. Deshalb stimmt die Sekundärstruktur von DSC und die wahre Kristallstruktur im extrazellulären Bereich einigermaßen überein.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 3

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 4

2.1.4 Erstellung einer Vorhersage für transmembrane Proteine mithilfe von Transmem

Mit Hilfe von Transmem wird eine neue Strukturvorhersage mit DSC gemacht. Dabei zeigt Abbildung 5 einen Ausschnitt (rote Linie steht für eine α-Helix), der wiederum der gelb-markierten Helix in Abb. 4 entspricht. Bei dieser Methode stimmt die Vorhersage der Aminosäuresequenz mit der realen Struktur der Helix überein.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 5

2.1.5 Erstellung eines Sequenzalignments von 2RH1 und 4DKL

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 6

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 7

Ein Alignment der Struktur 4DKL mit 2RH1 liefert einen stark konservierten Bereich (Abb. 6). Die obere Sequenz repräsentiert 4DKL (μ-OR), die untere 2RH1 (β2AR). Die Domänen unterscheiden sich lediglich in einer Aminosäure, wobei es sich um den intrazellulären Loop 3 (Abb. 7) handelt, an welchem das G-Protein bei der Aktivierung koppelt. Beide Rezeptoren sind in der Realität Gi gekoppelt.[5],[6] Die große Übereinstimmung der Idendität lässt sich also auf die Zugehörigkeit zur Klasse A GPCRs des μ-OR und des β2AR erklären.[5],[7] Diese Klasse gehört zu den am besten studierten Rezeptoren. [7]

2.1.6 Erstellung eines Sequenzalignments von 4DKL sowie 2IQO (transmembraner Teil eines GPCRs)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

abb 8

Abbildung 8 stellt das Alignment von 4DKL und 2IQOdar, welches zeigt, dass nur die transmembranen Helices konserviert und an der Stelle des Loop 3 nur Gaps sind. Die Vernachlässigung des ausgedehnten Loops 3 führt zur einer anderen Anordnung der transmembranen Helices, trotz identischer AS-Sequenz. Die veränderte Anordnung hat eine Ummodellierung der Bindetasche zur Folge, welche die Affinität des Liganden drastisch reduziert. Somit ist das Modell untauglich, da einerseits die Bindetasche nicht richtig dargestellt wird und anderer-seits die Synthese eines endogenen Liganden nicht möglich ist.

2.2 Homologiemodell

2.2.1 paarweises und multiples Alignment

Ein Alignment dient dem Vergleich zweier oder mehrerer DNA- bzw. Proteinsequenzen und zeigt dabei die Homologien der beteiligten Sequenzen zueinander auf. Ein paarweises Alignment wird dabei verwendet, falls zwei Sequenzen beteiligt sind, ein multiples Alignment bei mehr als zwei Sequenzen.

Um ein Homologiemodell zu erstellen, benötigt man allerdings das multiple Alignement.

In evolutionär verwandten Proteinen ist meist die Sekundär- oder Tertiärstruktur die Eigenschaft, welche am stärksten konserviert ist. Hingegen sind Funktion und vor allem die Sequenz weniger stark konserviert. Daher können evolutionär oder funktionell verwandte Proteine sich in ihrer Sequenz stark unterscheiden und trotzdem dieselbe 3D-Struktur oder ähnliche Motive/Domänen besitzen. Sind in Sequenzen mit solch geringer Ähnlichkeit strukturell oder funktionell relevante Residuen breit über die Sequenz verstreut, so gehen die Alignments verwandter Proteinsequenzen möglicherweise im statistischen Rauschen unter. Solch schwache Signale können jedoch durch ein multiples Alignment verstärkt werden, da konservierte Residuen dann aus dem Rauschen hervortreten.[8]

2.2.2 + 2.2.3 Unterschied von BLAST produzierten Alignments und multiplem Alignment sowie Funktionsweise von BLAST

Im Gegensatz zu einem multiplen Alignment, das jeweils mehrere komplette Sequenzen miteinander vergleicht, führt BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) lokale Alignments durch, wobei einzelne Sequenzabschnitte als „Wörter“ definiert werden, nach denen gesucht wird. Werden Übereinstimmungen gefunden, kann die Suche ausgeweitet und durch Verlängerung der Sequenzabschnitte verbessert werden. Durch das Kurzhalten dieser Segmente, ist es möglich, die Abfragesequenz vor einer Suche zu bearbeiten und eine Tabelle aller möglichen Teilstücke mit ihrem Ursprung in der Originalsequenz vorzuhalten. Dabei stellt der Algorithmus eine Liste aller benachbarten Worte fester Länge auf, die einen Treffer auf der Abfragesequenz mit einem höheren Scoring als ein zu wählender Parameter erzeugen würden. Anschließend wird die Zieldatenbank nach Worten in dieser Liste abgefragt und die gefundenen Treffer erweitert, um mögliche maximale zusammenhängende Treffer in beiden Richtungen zu finden.[9] Der Vorteil dabei ist, dass die Suche relativ schnell vonstatten geht.

[...]

Ende der Leseprobe aus 21 Seiten

Details

Titel
Strukturmodellierung und Docking. Gen: Zebrafink XP_002187388
Untertitel
Abschlussprotokoll im Praktikum Molecular Modelling 2014
Hochschule
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg  (Theoretische Chemie)
Note
1.0
Autoren
Jahr
2014
Seiten
21
Katalognummer
V335476
ISBN (eBook)
9783668256217
ISBN (Buch)
9783668256224
Dateigröße
1518 KB
Sprache
Deutsch
Schlagworte
Molecular Modelling, Theoretische Chemie, Rezeptor-Ligand Interaktion
Arbeit zitieren
Manuel Langer (Autor)Daniel Hofbauer (Autor), 2014, Strukturmodellierung und Docking. Gen: Zebrafink XP_002187388, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/335476

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