Nachweis des „pepper mild mottle virus“ (PMMoV) in Lebensmitteln, Stuhlproben und Abwasser sowie Oberflächenwasser

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung

Liste der verwendeten Abkürzungen

Abbildungsverzeichnis

1. Einleitung
1.1 Hintergrund
1.2 Viren
1.2.1 „Pepper mild mottle virus“
1.2.2 Adenovirus
1.2.3 Polyomavirus
1.3 Phagen
1.3.1 Somatische Coliphagen
1.4 Bakterien
1.4.1 E. coli
1.4.2 Enterokokken
1.5 Abwasser und die Rolle der Kläranlagen
1.5.1 Die Kläranlage Bochum Ölbachtal

2. Ziel dieser Arbeit

3. Material und Methoden
3.1 Listen der verwendeten Laborausrüstung
3.2 Arbeitsmethoden
3.2.1 Analyse der Wasserproben
3.2.2 Analyse der Schlammproben
3.2.3 Analyse der Lebensmittelproben
3.2.4 Analyse der Stuhlproben
3.2.5 MPN-Test
3.2.6 Phagenplaquetest
3.2.7 Extraktion
3.2.8 Quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR)

4. Ergebnisse
4.1 Abwasserproben
4.2 Lebensmittelproben
4.3 Stuhlproben

5. Diskussion
5.1 Abwasserproben
5.1.1 Humanpathogene Viren
5.1.2 somatische Coliphagen
5.1.3 E. coli und Enterokokken
5.2 Lebensmittelproben
5.3 Stuhlproben

6. Literaturverzeichnis

Danksagung

Zusammenfassung

Da humanpathogene Viren wie humane Adenoviren (HAdV) und humane Polyomaviren (HPyV) in den letzten Jahren verstärkt in geklärtem Abwasser und Oberflächenwasser nachgewiesen werden konnten, stellt sich die Frage, wie effektiv die Abwasseraufbereitung über Kläranlagen die Konzentration an humanpathogenen Viren reduzieren kann, denn aus der hohen Umweltpersistenz dieser Viren entspringt ein Gesundheitsrisiko für den Menschen. Da verschiedene mikrobiologische und chemische Parameter nur unzureichend geeignet sind, um die virale Belastung des Wassers festzustellen, bleiben die Viren selbst der einzige zuverlässige Parameter. Vor allem das „pepper mild mottle virus“ (PMMoV) findet unter diesem Aspekt seit einiger Zeit Beachtung, da es das am häufigsten nachgewiesene Virus in menschlichen Fäkalien ist. Bei diesem Virus handelt es sich um ein Pflanzenpathogen, welches hauptsächlich Pfefferpflanzen befällt, was derartige Lebensmittel als mögliche Eintragsquelle des Virus in den menschlichen Stuhl und darüber ins Abwasser relevant macht.

In dieser Arbeit wurde vorrangig die Reduktion der Konzentrationen an PMMoV, HAdV und HPyV über die Reinigungsstufen einer Kläranlage untersucht, wobei die mikrobiologischen Parameter E. coli, Enterokokken und somatische Coliphagen mitbestimmt wurden. Zusätzlich wurden Stuhl- und Lebensmittelproben auf PMMoV analysiert, um die Nachweiskette der Viren vom Lebensmittel auf den Menschen und dann über den Stuhl und ins Abwasser zu schließen, wobei hier zur Bestätigung noch weitere, zukünftige Analysen wichtig sind.

Methodisch wurde das VIRADEL-Verfahren zur Aufkonzentrierung der Viren mit anschließender qRT-PCR angewandt. Die Bakterien und Viren wurden mittels MPN- und Phagenplaquetest nachgewiesen.

PMMoV konnten in gemittelt 99 %, HAdV in 93 %, HPyV in 64 %, E. coli in 97 %, Enterokokken in 95 % und somatische Coliphagen in 96 % der Abwasserproben nachgewiesen werden. Während PMMoV sowie die Bakterien und Phagen über die Klärstufen eine konstante Reduktionsrate aufwiesen, war dies bei HAdV und HPyV nicht der Fall. Es konnte der Verdacht bestätigt werden, dass diese Viren mit dem Klärschlamm interagieren, denn in den zusätzlich untersuchten Schlammproben konnte eine um zwei bis drei log-Stufen erhöhte Konzentration dieser Viren gefunden werden.

Bis auf PMMoV wurden die Viren über die Kläranlage nicht signifikant reduziert, ein möglicher Grund hierfür könnte die Interaktion mit dem Schlamm sein. Mehr Lebensmittelund Stuhlproben und vor allem Sequenzierungsanalysen könnten nachweisen, dass die PMMoV von den Lebensmitteln über den Menschen ins Abwasser gelangen

Liste der verwendeten Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildungsverzeichnis

Abb.1 PMMoV, typische Verfärbungen auf der befallenen Pflanze

Abb.2 Die Kläranlage Bochum-Ölbachtal

Abb.3 Konzentrationsprofil von HAdV, HPyV und PMMoV an den Probenahmestellen ZBB und S

Abb.4 Konzentrationsprofil von HAdV, HPyV und PMMoV an den Probenahmestellen ZBB und ANK

Abb.5 Konzentrationsprofil von somatischen Coliphagen, E. coli und Enterokokken an den Probenahmestellen ZBB und S

Abb.6 Konzentrationsprofil von somatischen Coliphagen, E. coli und Enterokokken an den Probenahmestellen ZBB und ANK

Abb.7 Konzentrationsprofil von PMMoV, HAdV, HPyV, somatischen Coliphagen, E. coli und Enterokokken an den Probenahmestellen ZBB, ABB , ANK und S

Abb.8 Vergleich der Konzentration an PMMoV, HAdV, HPyV und somatischen Coliphagen der Probenahmestelle ZBB mit Schlammproben der Probenahmestelle ZBB (ZBB S)

Abb.9 Vergleich der Konzentration an PMMoV, HAdV, HPyV und somatischen Coliphagen der Probenahmestelle ABB mit Schlammproben der Probenahmestelle ABB (ABB S)

Abb.10 Konzentrationsprofil von E. coli an den Probenahmestellen ZBB, ABB und ANK und S

Abb.11 Konzentrationsprofil von Enterokokken an den Probenahmestellen ZBB, ABB, ANK und S

Abb.12 Temperaturprofil für die Probenahmestellen ZBB, ABB und ANK

Abb.13 Temperaturverlauf und gemittelter PMMoV-Konzentrationsverlauf aller Probenahmeorte

Abb.14 Temperaturverlauf und gemittelter HAdV- und HPyV-Konzentrationsverlauf aller Probenahmeorte

Abb.15 Nachgewiesene PMMoV-Konzentrationen in den untersuchten Lebensmitteln

1. Einleitung

1.1 Hintergrund

Humanpathogene Viren, wie z.B. humane Adenoviren (HAdV) oder humane Polyomaviren (HPyV) konnten in den letzten Jahren in unterschiedlichen Arten von Oberflächengewässern, wie Flüssen, Seen (Hamza et al., 2009b) und Badegewässern (Abdelzaher et al., 2010; McQuaig et al., 2006; Silva et al., 2010) nachgewiesen werden Der Haupteintragspfad dieser Viren ist Abwasser (Pusch et al., 2005). Außerdem können humanpathogene Viren auch durch die auf den Feldern ausgebrachte Gülle und anschließende heftige Regenfälle in die Gewässer eingeschwemmt werden (Mattison et al., 2007; Rose et al., 2001). Der zuletzt erwähnte Aspekt ist nur schlecht zu erfassen bzw. zu kontrollieren. Von dem Abwasser jedoch ist bekannt, dass es hohe virale Konzentrationen von bis zu 10[[[4]]] Genomäquivalenten pro Liter enthalten kann (Bofill-Mas et al., 2000; Katayama et al., 2008).

Doch obwohl über die verschiedenen Reinigungsstufen der Kläranlagen die Konzentrationen an humanpathogenen Viren um bis zu fünf log-Stufen (Albinana-Gimenez et al., 2009a), durchschnittlich um 50 bis 90 % verringert werden können (Okoh et al., 2010) und obwohl die Methoden zur Abwasseraufbereitung über die Jahre stetig verbessert wurden, sind auch heutzutage angewandte Abwasseraufbereitungssysteme oft nicht leistungsfähig genug, um die große Anzahl an Bakterien und Viren aus dem Abwasser zu beseitigen. Dies wird von der Tatsache gestützt, dass Viren auch in Schönungsteichen (die letzte Stufe vor der Einleitung in den Fluss) nachgewiesen werden konnten (Fong et al., 2010; Locas, 2010; Petrinca et al., 2009; Victoria, 2010).

Die gesundheitliche Relevanz der Viren wird durch die hohe gemeldete Anzahl infizierter Personen in Deutschland deutlich. Seit Anfang des Jahres 2010 sind bisher bereits 145.264 Menschen durch das Norovirus und 46.479 durch das Rotavirus erkrankt (epidemiologisches Bulletin, 6. September 2010). Die Dunkelziffer ist vermutlich weitaus höher. Nach einer Infektion mit den humanpathogenen Viren werden diese in großer Zahl über den Stuhl, Erbrochenes oder Urin ausgeschieden (Girones et al., 2010; Okoh et al., 2010) und gelangen über das Abwasser zur Kläranlage. Eine Übertragung der Viren auf andere Menschen ist durch „Hand zu Mund“, Aerosole oder aber auch durch kontaminiertes Wasser möglich, denn die Infektiosität der Viren ist sehr hoch. Bereits zehn bis 50 Partikel genügen, um eine Erkrankung auszulösen. Da die Viren bei geeigneten Bedingungen (4 bis 10°C) bis zu mehrere Monate haltbar sind, ist auch eine Ansteckung über belastetes Wasser, z.B. beim Schwimmen, denkbar. Die Infektion von Personen mit humanpathogenen Viren über kontaminiertes Trinkwasser konnte bisher nur aufgrund von sekundär kontaminiertem Trinkwasser bestätigt werden. (Botzenhart, 2007).

Der Nachweis der Viren ist zeitaufwändig und kostenintensiv, da sie vor dem eigentlichen Nachweis aufkonzentriert und anschließend, je nach Art, molekularbiologisch mittels PCR quantifiziert werden müssen. Aus diesem Grund wird schon seit mehreren Jahren nach einem geeigneten Indikator für die Viren im Wasser gesucht. Die seit einiger Zeit kontrovers diskutieren Phagen (somatische Coliphagen und F+-Phagen) scheinen nicht der geeignete Indikator zu sein (Gantzer et al., 1998; Hot et al., 2003; Skraber et al., 2004b). Auch chemische Parameter zeigen die virale Belastung nicht richtig an (Jurzik et al., 2010). Man muss annehmen, dass nur die Viren selbst ein geeigneter Indikator sind. In diesem Zusammenhang könnte das „pepper mild mottle virus“ (PMMoV) von Bedeutung sein, da es sich um ein nur schwach humanpathogenes Virus handelt (Colson et al., 2010), das allerdings in einer Untersuchung das am häufigsten gefundene Virus in menschlichen Fäkalien war (Rosario et al., 2009). Eine Studie aus den USA belegt, dass dieses Virus geographisch weit verbreitet ist. So konnte es in 12 von 18 Stuhlproben von Personen aus den USA und Singapur nachgewiesen werden (Zhang et al., 2006). Untersuchungen zur Verwendung dieser pflanzenpathogenen Viren als Indikator für humanpathogene Viren im Wasser gibt es jedoch nicht.

Eine mögliche Quelle zur Infektion mit Viren sind neben dem Oberflächenwasser auch Lebensmittel. Durch den Nachweis humanpathogener Viren in Stuhlproben liegt es nahe, kontaminierte Lebensmittel als mögliche weitere Übertragungsquelle eben dieser Viren auf den Menschen in Betracht zu ziehen. Dies haben viele neuere Untersuchungen bestätigt (Petrignani et al., 2010; Sanchez et al., 2007). So ereignete sich ein Ausbruch an Norovirus-Erkrankungen unter den Schulkindern einer koreanischen Schule, die in der dortigen Kantine verschiedene Arten Rohkost verzehrt hatten (Yu et al., 2010). Ein weiterer Fall wurde ausgelöst durch kontaminierten Fruchtsaft auf einer Busreise von Deutschland in die Niederlande (Visser et al., 2010). Dabei ist allerdings auch die Übertragung der Viren von Person zu Person eine weitere Infektionsquelle, die berücksichtigt werden muss (Verhoef et al., 2008).

Vor allem das bereits erwähnte pepper mild mottle Virus, PMMoV, ist in letzter Zeit unter dem Aspekt der viralen Kontamination von Lebensmitteln häufig Thema wissenschaftlicher Arbeiten. So zeigte eine Untersuchung von Colson et al. aus dem Jahre 2010, dass vor allem bei getrockneten Paprika- und Pfefferprodukten (Gewürzen), Curry und Würzsaucen wie Ketchup ein positives Ergebnis bei der Analyse auf PMMoV erzielt wurde. In der gleichen Untersuchung konnte zudem zum ersten Mal eine Humanpathogenität des PMMoV beschrieben werden (Colson et al., 2010).

1.2 Viren

1.2.1 Pepper mild mottle virus

Das „pepper mild mottle virus“, für das es bisher keine offizielle deutsche Bezeichnung gibt, ist ein (+)-Strang-RNA-Virus mit einer einsträngigen linearen RNA und einem helixförmigen Capsid. Es gehört zur Familie der Tobamoviren und befällt vor allem Pfefferpflanzen, beispielsweise scharfen Pfeffer oder Paprika (Capsicum spp.) (Rosario et al., 2009). Laut einer phylogenetischen Analyse von Zhang et al. sind derzeit sieben Genome und 14 Hüllproteine des pepper mild mottle virus bekannt (Zhang et al., 2006).

Nachgewiesen werden konnte das PMMoV bisher in verschiedenen Paprika- und Pfefferpflanzen, Gewürzen und Saucen die Bestandteile selbiger enthalten, sowie beispielsweise Currypulver (Colson et al., 2010).

Typisches Erkennungszeichen für vom PMMoV befallene Pflanzen sind bräunliche Verfärbungen an den Blättern oder der Frucht (s. Abb. 1).

Wie verschiedene Untersuchungen ergeben haben, wird das PMMoV über den Menschen ins Abwasser eingetragen (Rosario et al., 2009).

Laut einer aktuellen Studie aus dem Jahr 2010 waren die Testergebnisse der Stuhlproben von Patienten mit Fieber, Durchfall oder Bauchschmerzen positiv auf PMMoV (Colson et al., 2010).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: PMMoV, typische Verfärbungen auf der befallenen Pflanze (Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/c/cf/Pepper_mild_mottle_virus.png)

1.2.2. Adenovirus

Adenoviren sind unbehüllte Viren mit einer doppelsträngigen linearen DNA einer Länge von 3600-3800 Basenpaaren. Die Form des Capsids ist ikosaedrisch mit einem Durchmesser von 80-110 nm. Sie gehören zur Familie der Adenoviridae. Die humanen Adenoviren werden in sieben Virusspezies (HAdV-A bis HAdV-G) und diese weiterhin in bisher 52 Serotypen aufgeteilt. Sie unterscheiden sich in ihren Infektionsformen, so sind Erkrankungen des Gastrointestinal- als auch des Respirationstraktes oder Infektionen der Nieren einige der verbreiteten Symptome der Patienten, bei denen entsprechende Adenoviren nachgewiesen werden konnten (Modrow et al., 2009). Meist werden die humanen Adenoviren über Fäkalien und Gewässer übertragen (Albinana-Gimenez et al., 2006; Albinana-Gimenez et al., 2009b), teilweise sogar über Trinkwasser (Lambertini et al., 2008).

Adenoviren kommen über das ganze Jahr hinweg in großer Anzahl in Gewässern vor. Vor allem im Abwasser, wo sie in einer Studie von Fong et al. in 100% aller untersuchten Proben nachgewiesen werden konnten, werden sie während des Aufbereitungsprozesses zum Teil nur unzureichend entfernt und so in die Umwelt eingetragen, was ein potentielles Gesundheitsrisiko darstellt (Fong et al., 2010).

1.2.3 Polyomavirus

Polyomaviren gehören zur Familie der Papoviridae und Polyomaviridae. Sie besitzen ein kovalent geschlossenes und damit zirkuläres, doppelsträngiges DNA-Genom mit einer Länge von 4700-5400 Basenpaaren. Die infektiösen Viruspartikel sind Capside mit einem Durchmesser von 45 nm und haben keine Hüllmembran (Modrow et al., 2009). Die zwei zu unterscheidenden Typen sind Polyomavirus JC und BK. Sie sind weit verbreitet, es lassen sich bei über 80% aller Erwachsenen Antikörper gegen das BKPyV nachweisen (Modrow et al., 2009). Die Folgen einer Primärinfektion mit BKPyV sind Erkrankungen der Atemwege, Erkältungen und Harnblasenentzündungen. JCPyV löst bei einer Primärinfektion keine Erkrankung aus, persistiert jedoch im lymphatischen Gewebe und im Knochenmark sowie beispielsweise den Nieren. Vor allem bei Patienten mit Immundefekten wie AIDS ist das JCPyV verantwortlich für die Entstehung der progressiven multifokalen Leukoencephalopathie (PML), die in ihren letzten Schritten zum Tod führt (Modrow et al., 2009).

Die Polyomaviren JC und BK wurden in früheren Untersuchungen als Hinweis auf fäkale Verunreinigungen von Abwasser gedeutet (McQuaig et al., 2006).

1.3 Phagen

1.3.1 Somatische Coliphagen

Unter somatischen Coliphagen versteht man Viren, die speziell das Bakterium E.coli und verwandte Spezies befallen. Sie besitzen eine doppelsträngige DNA und werden auch als ds-DNA-Phagen bezeichnet. Bevorzugt werden sie als Indikator für fäkale Verunreinigungen von Abwasser eingesetzt (Brezina and Baldini, 2008), in der letzten Zeit gab es jedoch häufiger Diskussion um die tatsächliche Aussagekraft in diesem Zusammenhang (Jurzik et al., 2010).

1.4 Bakterien

1.4.1 Escherichia coli

Das Bakterium Escherichia coli gehört zur Familie der Enterobacteriacae. Es ist gramnegativ und stäbchenförmig, hat eine Größe von etwa 2 μm und kommt im menschlichen Darm vor. Sein Genom besteht aus einem einzigen zirkulären Chromosom aus 4,68 Mio. Basenpaaren. Es enthält 4300 Gene (Madigan et al., 2006). Die Trinkwasserverordnung nutzt das Bakterium als Indikator für fäkale Verunreinigungen (TrinkwV, 2001).

1.4.2 Enterokokken

Enterokokken zählen zur Familie der Streptococcaeceae, sind grampositiv und kugelförmig (kokkoid). Für den Menschen sind die beiden Arten E. faecium und E. faecalis von Bedeutung, die vor allem im Darm auftreten. Sie tolerieren extreme Umweltbedingungen wie einen Temperaturbereich von 10 bis 45 °C, einen pH-Wert von 4,5 bis 10 und hohe Salzkonzentrationen (Fisher and Phillips, 2009).

1.5 Abwasser und die Rolle der Kläranlagen

Als Abwasser werden durch Gebrauch verunreinigtes Wasser als auch abfließendes Niederschlagswasser bezeichnet (Abwasserabgabenverordnung, 2001). Das in dieser Arbeit untersuchte Abwasser fällt in den Zuständigkeitsbereich des Ruhrverbands. Dieser stellt die Wasserversorgung von knapp fünf Millionen Menschen im Ruhrgebiet sicher und bewerkstelligt die Wasseraufbereitung für 60 Städte und Gemeinden.

1.5.1 Die Kläranlage Bochum-Ölbachtal

Die Kläranlage Bochum-Ölbachtal existiert seit dem Jahre 1976 und wurde zuletzt 2001 erweitert. Zum Einzugsbereich zählen der Osten Bochums sowie der Westen Dortmunds. Der größte gewerbliche Einleiter ist die Ruhr-Universität Bochum.

Die Kläranlage arbeitet nach dem Belebtschlammverfahren. Sie verfügt zudem über eine gezielte Stickstoffelimination und ist auch in der Lage, Phosphor aus dem Abwasser zu entfernen. Weiterhin verfügt die Kläranlage über einen Schönungsteich, in dem das Abwasser einer Nachreinigung unterzogen wird. Der bei der Abwasserreinigung anfallende Klärschlamm sowie angelieferte Speisereste und Fette werden in Faulbehältern behandelt. Das dabei anfallende Klärgas wird in einem Blockheizkraftwerk zur Strom- und Wärmeerzeugung verwendet. Der Klärschlamm wird maschinell entwässert und anschließend entsorgt.

Die erste Reinigungsstufe in der Kläranlage ist die mechanische Reinigung. In der Rechenanlage werden grobe Abwasserinhaltsstoffe, wie Laub oder tote Tiere, entfernt. Nach dem Sandfang, wo Sand und Steine abgefangen werden, und der Vorklärung folgt der biologische Teil der Abwasserbehandlung in Form der Belebtschlammbecken, innerhalb derer Nitrifikation (Umwandlung von Ammoniak zu Nitrat durch Bakterien wie Nitrosomonas) und Denitrifikation (Umwandlung von Nitrat zu elementarem Stickstoff) stattfindet. Hier werden die unerwünschten Abwasserbestandteile in umweltfreundliche Stoffe umgewandelt. Bei der Nachklärung wird der Belebtschlamm maschinell vom gereinigten Abwasser getrennt. Im dritten Schritt, der chemischen Reinigung, werden vor allem anorganische Substanzen wie Phosphat durch Ausfällung mit Eisen- oder Aluminiumsalzen aus dem Wasser eliminiert.

Der Aufbau der Kläranlage ist aus Abb. 2 ersichtlich.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Die Kläranlage Bochum-Ölbachtal mit Zulauf Belebungsbecken (ZBB), Ablauf Belebungsbecken (ABB) und Ablauf Nachklärung (ANK). Schönungsteich (S) ist nicht mit im Bild, befindet sich rechts von ANK. (Quelle: http://www.ruhrverband.de/uploads/pics/ka_bochum-oelbachtal_g.jpg)

2. Ziel dieser Arbeit

In dieser Bachelorarbeit soll vorrangig die Reduktion der humanpathogenen Viren über die verschiedenen Aufbereitungsschritte in der Kläranlage untersucht werden.

- Das Hauptaugenmerk ist auf das „pepper mild mottle virus“ gerichtet, da dieses möglicherweise als Indikatorparameter für die anderen Viren genutzt werden kann. Humane Adeno- und Polyomaviren (HAdV und HPyV) werden aus diesem Grund routinemäßig mitbestimmt, ebenso E. coli, Enterokokken als auch somatische Coliphagen.

- Da der Interaktion „Virus-Schlamm“ eine besondere Bedeutung zukommt, werden zusätzlich zu den Wasserproben Schlammproben aus zwei der Reinigungsstufen untersucht, um festzustellen, ob hier eine größere Menge an Viren zu finden ist, die bisher in den üblichen Filtrationsschritten abgetrennt wurde.

- Auch deerer Punkt soll die Nachweiskette für das PMMoV geschlossen werden.

- Es soll bestätigt werden, dass das „pepper mild mottle virus“, PMMoV, über kontaminierte Lebensmittel, die der Mensch zu sich nimmt, über den Stuhl ins Abwasser und anschließend ins Oberflächenwasser gelangt.

3. Material und Methoden

3.1 Listen der verwendeten Laborausrüstung

Tabelle 1: Verwendete Geräte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2: Verwendete Chemikalien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 3: Verwendete Kulturmedien mit genauer Zusammensetzung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 4: Verwendete Organismen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 5: Verwendete Primer und Sonden

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 6: Verwendete PCR- und Extraktionskits

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.2 Arbeitsmethoden

3.2.1 Analyse der Wasserproben

Die untersuchten Wasserproben wurden in der Zeit vom 09.06.2010 bis 23.08.2010 wöchentlich aus verschiedenen Klärstufen der Kläranlage Bochum-Ölbachtal (jeweils 10 Liter aus Zulauf Belebungsbecken ZBB, Ablauf Belebungsbecken ABB, Ablauf Nachklärung ANK, Schönungsteich S) entnommen. Vor Ort wurde jeweils der pH-Wert und die Wassertemperatur gemessen und die Proben anschließend ins Labor transportiert, wo sie bei 4 bis 8 °C gelagert und innerhalb von zwei Tagen weiter analysiert wurden.

Die Wasserproben wurden nun nach dem VIRADEL-Verfahren behandelt, welches somatische Coliphagen als auch humanpathogene enterale Viren rekonzentriert (Hamza et al., 2009a). Das Wasser aus den beiden Klärstufen ZBB und ABB wurde zuvor mit einem Büchnertrichter und zwei verschiedenen Filtern vorfiltriert (Filterpapier Ø 320 nm, Machery-Nagel GmbH & Co KG, Düren; Qualitatives Filterpapier 410, VWR, Partikelrückhaltung: 2 μm, Ø 185 nm). Anschließend wurde es in einer Whatman- Filteranlage mit Hilfe von Druck filtriert. Auch hierbei kamen zwei verschiedene Filter zum Einsatz. Der Filter, den das Wasser zuerst passierte, war lediglich ein Vorfilter aus Glasfaser, dessen Hauptaufgabe darin bestand, Schmutzpartikel zurückzuhalten (Durchmesser: 142 nm, Whatman GmbH, Dassel). Darunter befand sich ein partiell negativ geladener Filter (Porendurchmesser: 0,45 μm, Durchmesser: 142 mm, Millipore, Bredford, USA), der für die Anhaftung der Viren an den Filter sorgte. Vor Beginn der Filtration wurde das Wasser mit Magnesiumchlorid-Lösung einer Konzentration von 2,5 mol/l versetzt und der pH-Wert auf 3,5 eingestellt. Dieses diente zur Verbesserung der Anhaftung der Viren an den Filter (Lukasik et al., 2000).

In einem Waschschritt wurde nach der Filtration mit 200 ml Schwefelsäure einer Konzentration von 0,5 mmol/l gespült. Dadurch werden mögliche Inhibitoren bei der sich anschließenden qRT-PCR verringert (Haramoto et al., 2004).

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