P53 als prognostischer Marker für hämatologische Neoplasien

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

1 Einleitung
1.1 P53
1.1.1 Funktion
1.1.2 Aufbau
1.1.3 Nachweis
1.2 P53 in hämatologischen Neoplasien
1.2.1 Übersicht
1.2.2 Chronisch Lymphatische Leukämie (CLL)
1.2.3 Diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom (DLBCL)
1.2.4 Haarzellenleukämie (HCL)
1.2.5 Chronische myeloische Leukämie (CML)
1.2.6 Myelodysplastisches Syndrom (MDS)
1.2.7 Akute myeloische Leukämie (AML)

2 Zielsetzung

3 Material und Methoden
3.1 Patientenmaterial
3.2 Antikörper
3.3 Protokoll zur Intrazellulären Färbung
3.4 Antikörper-Titration an Jurkat-Zellen
3.5 P53-Expression unterschiedlicher Zell-Populationen
3.6 Antikörper-Titration am Patienten
3.7 Vergleich mit gesunder Kontrollperson

4 Ergebnisse
4.1 Antikörper-Titration an Jurkat-Zellen
4.2 P53-Expression unterschiedlicher Zell-Populationen
4.3 Antiköper-Titration am Patienten
4.4 Vergleich mit gesunder Kontrollperson

5 Diskussion
5.1 Patientenmaterial
5.2 Antikörper-Titration an Jurkat-Zellen
5.3 P53-Expression unterschiedlicher Zell-Populationen
5.4 Antikörper-Titration am Patienten
5.5 Vergleich mit gesunden Kontrollpersonen
5.6 Bedeutung eines positiven Ergebnisses
5.7 Vorteile der Durchflusszytometrie

6 Anwendung und Aussicht

7 Zusammenfassung

8 Literatur

9 Anhang
9.1 P53 in hämatologischen Neoplasien - Zusammenfassung
9.2 Durchflusszytometrischer Nachweis von p53 - Übersicht
9.3 Klon DO-7 (Dako) - Vergleich mit gesunden Kontrollpersonen
9.4 Untersuchung von MDS-Patienten

Abstract

Title. P53 as a prognostic marker for hematological malignancies.

Background. The p53 tumor suppressor protein can be found in over half of all malignancies. Therefore p53 is assumed to play a crucial role in tumorgenesis. Although p53 prevalence is comparatively low in hematological malignancies (14 %), numerous studies pointed out its prognostic significance.

Objective. To establish a flow cytometric method for detecting p53-expression in hematological malignancies.

Methods. On the basis of ten CLL-Patients, four different antibodies were tested. For this, p53-expression of different cell-populations was investigated. For ascertaining an optimal antibody concentration, a titration was performed. Furthermore, on the basis of seven physiological specimens a cut-off for p53-expression was defined.

Results. Four CLL-Patients were found to be p53-positive by flow cytometric testing. Only one of the four tested antibodies (pS37 by Miltenyi Biotec) were considered appropriate for flow cytometry. However, the ascertained optimal concentration was four to forty times higher than the concentration suggested by data sheet. The p53-expression was the same for different examined lymphocyte subpopulations. The cut-off was set at a RFI (relative fluorescence intensity) of 2,1, which is considered to be low but still coincides with results from other working groups.

Conclusion. Flow Cytometry detects not the gene of p53, but the protein itself, which is why flow cytometry represents a good addition to conventional testing such as sequencing. The results of this work pave the way for establishing a flow cytometric analysis of p53 in different hematological malignancies. For an improved accuracy of the test, more patients should be tested and the results should be compared with reference methods. Plus, more physiological specimens should be measured and on the basis of these results the cut-off should be checked.

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildungs- und Tabellenverzeichnis

Abbildung 1 Dreidimensionaler Aufbau von p53

Abbildung 2 Prinzip der DHPLC

Abbildung 3 FASAY an Lymphozyten im PB

Abbildung 4 FISH 17p-Deletion

Abbildung 5 Immunhistochemischer Nachweis von p53

Abbildung 6 Hersteller-Testung der p53-Klone von Miltenyi Biotec

Abbildung 7 Hersteller-Testung des Klons DO-7 von BioLegend®

Abbildung 8 Darstellung der Lymphomzellen (CD5+/CD19+)

Abbildung 9 Darstellung der Lymphozyten-, Monozyten-, und Granulozytenpopulation

Abbildung 10 Vitalbestimmung der Jurkat-Zellen mittels PIhhhhhhhhhhhhhhh

Abbildung 11 Klon acK382

Abbildung 12 Klon pS37

Abbildung 13 Klon DO-7

Abbildung 14 Titration an Jurkat-Zelllen dreier unterschiedlicher p53-Klone

Abbildung 15 Klon sp37: p53-Expression unterschiedlicher Zell-Populationen

Abbildung 16 Klon Do-7 (Dako): p53-Expression unterschiedlicher Zell-Populationen

Abbildung 17 Klon acK382: p53-Expression unterschiedlicher Zell-Populationen

Abbildung 18 Klon DO-7 (BL): p53-Expression unterschiedlicher Zell-Populationen

Abbildung 19 Titration des Klons pS37

Abbildung 20 Titration des Klons DO-7 (Dako)

Abbildung 21 P53-Expression in gesunden Kontrollpersonen

Abbildung 22 P53-Expression in CLL-Patienten

Tabelle 1 p53-Fehlfunktionsrate bei CLL-Patienten

Tabelle 2 p53-Fehlfunktionsrate bei chemoresistenten CLL-Patienten

Tabelle 3 p53-Fehlfunktionsrate bei DLBCL-Patienten

Tabelle 4 TP53-Mutationsrate bei MDS-Patienten

Tabelle 5 TP53-Mutationsrate bei MDS-Patienten in Abhängigkeit der Entität

Tabelle 6 p53-Fehlfunktionsrate bei AML-KK

Tabelle 7 p53-Fehlfunktionsrate bei AML-Patienten

Tabelle 8 Überlebenszeit von AML-Patienten

Tabelle 9 Übersicht der getesteten CLL-Patienten

Tabelle 10 Übersicht verwendeter p53-Antikörper

Tabelle 11 Übersicht verwendeter Isotyp-Kontrollen

Tabelle 12 Verwendet CD-Antikörper zur Oberflächenmarkierung

Tabelle 13 Titration der p53-Antikörper Klone an JURKAT-Zellen

1 Einleitung

1.1 P53

1.1.1 Funktion

Das Protein p53 wurde im Jahr 1979 bei Versuchen mit Mauszellen zum ersten Mal entdeckt. Die Mauszellen wurden mit dem kanzerogenen Virus SV-40 transformiert. Hierbei stellte man fest, dass die viruseigenen Tumor-Antigene (TAG) mit bestimmten Proteinen der Mauszellen oligomere Komplexe ausbildeten.[64] Die von den TAG gebundenen Proteine hatten eine Masse von 53-kDa, worauf die Namensgebung p53 zurückzuführen ist.[70] 1979 ahnte man noch nicht, was für eine bahnbrechende Entdeckung man gemacht hatte. Erst im Laufe der Zeit erkannte die Wissenschaft, dass p53 eine maßgebliche Rolle in der Tumorgenese vieler Tumore spielt. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass das Gen TP53, welches für p53 codiert, das in Tumoren meist mutierte Gen ist. Woraufhin p53 1993 zum Molekül des Jahres gekürt wurde.[14]

Das Tumorsuppressorgen TP53 befindet sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 17 (17p13). Es umfasst 393 Codons (Codon = Sequenz dreier Nukleotidbasen), welche als Vorlage für den Transkriptionsfaktor p53 dienen. Als Produkt eines Tumorsuppressorgens sorgt p53 während der Zellteilung für die Integrität des Genoms. Es wird daher auch als „Wächter des Genoms“ bezeichnet.[63] Werden während der Zellteilung an so genannten Check-Points (englisch, Kontrollpunkte) Schäden an der DNS einer Zelle festgestellt, wird p53 aktiviert. P53 lagert sich als Transkriptionsfaktor an die DNS an und sorgt somit zur Transkription von Faktoren, welche den Vorgang der Zellteilung vorläufig stoppen (Arrest in G1/S-Phase), bis die Schäden an der DNS behoben wurden. Auf analoge Weise ist p53 in der Lage, die Zellen in den programmierten Zelltod (Apoptose) zu zwingen. Eine weitere wichtige Funktion von p53 ist die Verhinderung von Blutgefäßausbildungen, welche in der Tumorgenese eine entscheidende Rolle spielen.[124]

Das Protein p53 kann erst in höheren Konzentrationen aktiv werden. In gesunden Zellen liegt es nur in geringen Konzentrationen vor, da ein stetiger Abbau von p53 erfolgt. Dieser wird durch die Übertragung von Ubiquitin auf p53 (Ubiquitinierung) gewährleistet. Durch

die Ubiquitinierung wird der Abbau (Proteolyse) von p53 ermöglicht. Die Ubiquitinierung erfolgt in erster Linie durch das Onkogen MDM2. Bei zellulärem Stress (zum Beispiel DNS-Schäden) können die Bindungstellen für MDM2 geblockt oder verändert werden, sodass keine Ubiquitinierung von p53 mehr erfolgt. p53 wird somit nicht mehr proteolytisch abgebaut, reichert sich in der Zelle an und kann seine Funktion als „Wächter des Genoms“ ausüben.[83] In dieser physiologischen Form spricht man vom „Wild-Typ“ (WT)-p53.

So genannte „knock-out“ Mäuse, bei welchen TP53 so verändert wurde, dass es zu einem kompletten Funktionsverlust des Gens kam (Null-Mutation), bestätigten den Verdacht, dass p53 eine maßgebliche Rolle bei der zelleigenen Tumorprävention spielt. Die NullMutation führte dazu, dass die knock-out Mäuse ab einem Alter von sechs Monaten eine deutlich höhere Tumorrate als Mäuse mit intaktem TP53 aufwiesen.[17]

In der Natur unterscheidet man bislang drei unterschiedliche Arten, durch welche es zu einem Funktionsverlust des Gens TP53 kommen kann. (i) Wie oben beschrieben, kann p53 erst bei erhöhten Konzentrationen dessen Funktion ausüben. Diese können nur erreicht werden, wenn die stetige Proteolyse von p53 gehemmt wird. Erfolgt bei zellulärem Stress keine Blockierung mehr von MDM2, so kann p53 nicht mehr in der Zelle angereichert werden und dessen Funktion ausüben. (ii) P53 ist ein Transkriptionsfaktor. Das heißt, es lagert sich bei höheren Konzentrationen an die DNS an und sorgt somit für die Expression stromabwärts befindlicher Gene. Die Produkte dieser Gene (zum Beispiel MDM2 oder PUMA[126] ) tragen zur Überwachung des Genoms bei. Eine Störung dieser Produkte stellt also gleichzeitig einen Funktionsverlust des Tumorsuppressorgens TP53 dar. (iii) Die häufigste Ursache für eine in der Zelle fehlende Funktion des Gens TP53 sind Mutationen innerhalb der 393 Codons. Diese führen zu einem stabilen, jedoch inaktivem p53. Bei 94 Prozent der Mutationen ist lediglich eine Nukleinbase betroffen (Punktmutation).[126]

1.1.2 Aufbau

Das Protein p53 lässt sich in fünf Domänen einteilen. Eine aminoterminale Transaktivierungsdomäne (TAD), eine prolinreiche Domäne, eine DNS-Bindungsdomäne, eine Tetramärisationsdomäne und eine Carboxylterminale Domäne (CTD). [67] Die vertikalen Balken in Abbildung 1 stellen die relative Häufigkeitsverteilung der Missense- Mutationen (Punktmutationen, welchen den Einbau einer anderen Aminosäure zur Folge haben) in p53 bei human Tumoren dar. Nahezu alle Mutation befinden sich in der DNS- Bindungsdomäne. (siehe Abbildung 1) Diese ist maßgäblich für die Funktion von p53 als Transkriptionsfaktor und lässt sich in drei Loops (engl. „Schleifen“) aufteilen. Loop 1 beziehungsweise in Loop 3 scheinen bei der Funktionsausübung wichtiger als Loop 2 zu sein, da Tumorpatienten mit Mutationen in einer der beiden Loops eine geringere Überlebensrate aufweisen. Mutationen in Loop 2 hingegen haben keinen Einfluss auf die Überlebensdauer.[67] Um als Transkriptionsfaktor fungieren zu können, muss p53 zur DNS beziehungsweise in den Nukleus gelangen. Hierfür befinden sich auf der CTD mehrere sogenannter nukleärer Lokalisationssignale (NLS). Diese steuern die Migration von p53 in den Kern.[112] Bei Versuchen mit Zellkulturen, welche keine NLS besaßen, konnte p53 dessen suppressive Wirkung nicht ausüben.[113] Im Laufe des Zellzykluses wird p53 räumlich reguliert. In der G1-Phase sammelt es sich im Zytoplasma an. Zu Beginn der anschließenden S-Phase wandert es in den Kern, um dort während der anfänglichen DNS-Synthese dessen Kontrollfunktion auszuüben. Nach etwa drei Stunden ist p53 nicht mehr im Kern, sondern nur noch im Zytoplasma vorzufinden.[111]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: (Unten) Dreidimensionaler Aufbau von p53. (Oben) Relative Häufigkeitsverteilung der Missense-Mutationen in p53.[49]

1.1.3 Nachweis

1.1.3.1 Sequenzierung

Die Sequenzierung gilt in der Mutationsanalyse kleiner Gene als Gold-Standard. In der Großzahl der Studien wurde die Sequenzierung als Methode zur Mutationsanalyse von p53 beziehungsweise TP53 gewählt (siehe Kapitel „1.2 P53 in hämatologischen Neoplasien“). Für den klinischen Routine-Gebrauch stellt die Sequenzierung bis dato allerdings eine zu kostenintensive und zu aufwendige Methode dar, weshalb sie allenfalls zur Bestätigung von positiven Ergebnissen anderer Methoden herangezogen wird.

Bislang ist die Sequenzierung nach Sanger am gebräuchlichsten.[98] Sie wird auch als Kettenabbruch- oder Didesoxynukleotidverfahren bezeichnet. Der Ablauf ähnelt dem einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Allerdings werden dem Ansatz nicht nur dNTPs (2‘- Desoxynukleotidphosphate), sondern auch fluorochrom-markierte ddNTPS (2‘,3‘- Didesoxynukleotidphosphate) hinzugegeben, welche zu einem Kettenabbruch führen. Aufgrund des Kettenabbruchs erhält man DNS-Fragmente unterschiedlicher Längen, welche mittels Gelelektrophorese aufgetrennt werden. Die Detektion der jeweils am 5‘- Ende befindlichen fluorochrom-markierten ddNTPs durch ein laseroptisches System liefert die Sequenz des untersuchten Gens.

Unter NGS (englisch, next-generation-sequencing) werden weiterentwickelte Methoden zusammengefasst, welche eine Automatisierung der Sequenzierung erlauben. Grundlegende Unterschiede sind der mögliche Verzicht von vorheriger DNS-Klonierung und Verzicht der Gelelekrophorese. Stattdessen werden Kapillaren verwendet, welche ein kleineres Probenvolumen benötigen und somit Zeit und Kosten einsparen.[47]

NGS beruht auf drei unterschiedlichen Hersteller-spezifischen Prinzipien, welche für unterschiedliche Arten der Genomforschung angewandt werden. Zwei Studien, welche zum p53-Mutationsnachweis bei MDS-Patienten NGS verwendeten, gebrauchten die Methode GAllX von Illumina. [74, 91]

1.1.3.2 Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP)

Der sogenannte Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCP, engl. Single strand conformation polymorphism) wurde 2000 von Moore et al. für den Nachweis von p53- Mutationen etabliert.[84] Diese Nachweismethode ist vor allem für eine große Anzahl an Proben, wie sie beispielsweise bei Studien auftreten, nützlich. Die Untersuchung erfolgt anhand denaturierter und somit einzelsträngen PCR-Produkten. Eine Mutation des TP53- Gens hat eine Konformationsänderung der einzelsträngigen DNS, aufgrund derer starken Neigung zur Basenpaarung, zur Folge. Diese Konformationsänderung führt zu einer veränderten Wanderung der DNS innerhalb eines Elektrophorese-Gels, welche mit der Wanderung einer WT-DNS verglichen werden kann. Damit eine eindeutige Unterscheidung zwischen mutierter und WT-Probe erfolgen kann, sollten mehr als 10 - 20 Prozent der Amplifikate eine Mutation aufweisen. [58, 117] Der SSCP zeigte bei TP53- Mutationsanalysen eine deutlich höhere Sensitivität als der p53-Nachweis mittels Immunhistochemie.[19]

1.1.3.3 Denaturierende Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (DHPLC)

Die denaturierende Hochflüssigkeitschromatographie (englisch denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC) wurde 2001 erstmals für den Nachweis von p53-Mutationen etabliert.[52] Die Methode setzt voraus, dass in einer Probe mit vorliegender Mutation ebenfalls noch WT-Kopien vorhanden sind. Die PCR-Produkte der Probe werden zunächst durch Erhitzen denaturiert und lagern sich bei anschließender Abkühlung wieder an. Liegt eine Mutation vor, so kommt es zur Bildung sogenannter Heteroduplexe, welche an Stelle der Punktmutation nicht komplementär sind. Heteroduplexe und Homoduplexe weisen ein unterschiedliches Elutionverhalten und lassen sich somit anhand unterschiedlicher Retentionszeit voneinander unterscheiden (siehe Abbildung 2).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2 Prinzip der DHPLC. Durch Denaturierung und anschließender Abkühlung entstehen bei einer vorliegenden Mutation Heteroduplexe, welche ein abweichendes Elutionsverhalten aufweisen. Abgeändert nach http://www.zenonbio.hu/transgenomic/ (Februar 2016).

Die DHPLC zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität bei der Mutationsanalyse von p53 (95 - 97 Prozent) aus und ist im Verhältnis zur Sequenzierung preiswerter und effizienter. [52, 132]

1.1.3.4 Funktionelle Untersuchung von getrennten Allelen in Hefestämmen (FASAY)

Die funktionelle Untersuchung von getrennten Allelen in Hefestämmen (englisch functioncal analysis for seperated alleles in yeast, FASAY) wurde 1993 eigens für den Mutationsnachweis von p53 entwickelt.[43] Der Hefestamm yIG397 ist aufgrund einer Mutation in dem endogenem ADE2-Gen nicht in der Lage Adenin zu synthetisieren. Allerdings wurde der Stamm mit einem offenen Leseraster von ADE2 transformiert, dessen Promotorregion p53-abhängig ist. Die mRNA wird von dem zu untersuchendem (Patienten-) Material extrahiert und mittels Reverse Transkription-PCR zu cDNA umgeschrieben. Die vervielfältigte cDNA wird anschließend in den ylG397-Hefestamm eingebracht. Liegt eine Missense-Mutation von p53 vor, kann es seine Funktion als Transkriptionsfaktor nicht ausüben und somit nicht an die Promotorregion des offenen Leserasters von ADE2 binden. [124] Der Hefestamm ist weiterhin nicht in der Lage Adenin zu synthetisieren und erscheint rötlich aufgrund der Anreicherung einer Vorstufe des Adenin-Metabolismus. Wenn hingegen keine Mutation vorliegt, kann p53 seine Funktion als Transkriptionsfaktors ausüben und ADE2 wird abgelesen. Adenin wird somit in der Zelle gebildet und die Kolonien erscheinen in physiologischer weißlicher Farbe (siehe Abbildung 3).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3 FASAY an Lymphozyten im PB. (links) Gesunder Spender (5% rote Kolonien). (rechts) Patient mit p53-Mutation (55% rote Kolonien).[26]

FASAY ist ein leicht durchführbarer und kostengünstiger Nachweis zum erfassen von p53- Mutationen. Die größte Herausforderung bei diesem Test ist die Gewinnung und Erhaltung von qualitativ hochwertiger p53-RNA. Zudem liegt ein Ergebnis erst nach zwei bis drei Tagen vor.[26]

1.1.3.5 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ist eine in der Routine häufig angewandte Methode zur Detektion einer 17p-Deletion (Lokalisation des TP53-Gens). Sie liefert innerhalb zweier Tage ein Ergebnis. Die FISH ist ein zytogenetisches Verfahren, bei welchem der Genabschnitt von Interesse über eine Fluoreszenz-markierte Sonde sichtbar gemacht wird. Der Nachweis erfolgt an Knochenmarks- beziehungsweise peripheren Blutausstrichen. Die Fluoreszenz-markierte Sonde ist komplementär zu dem Genabschnitt von p53 und kann bei einer vorliegenden Deletion nicht binden. Zur besseren Orientierung und als interne Kontrolle werden die Zentromere des Chromosoms 17 mit einer weiteren Sonde anderer Farbe markiert (siehe Abbildung 4). [68]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4 FISH 17p-Deletion. In allen vier Zellen sind jeweils die beiden Zentromere der Chromosomen 17 (grün) zu sehen, allerdings jeweils nur eine p53-Frequenz (rot). Dies lässt auf eine 17p-Deletion in allen vier Zellen.[68]

Mutationen von p53 sind nahezu immer (96 - 97 Prozent) mit einer 17p-Deletion verbunden. Eine 17p-Deletion hingegen geht lediglich mit einer Wahrscheinlichkeit von 76 - 81 Prozent mit einer Mutation von p53 einher. [15, 138] Ob p53-Mutationen einen eventuellen Auslöser für eine 17p-Deletion darstellen könnten, ist nicht geklärt.

1.1.3.6 Immunhistochemie (IHC)

Der immunhistochemische Nachweis von p53 ist eine gängige Methode in der Pathologie beziehungsweise Histologie. Die Detektion von p53 erfolgt mittels Antikörpern direkt am Gewebe auf einem Objektträger. (Bei hämatologischen Neoplasien handelt es sich bei dem zu untersuchenden Gewebe vornehmlich um Lymphknoten oder Knochenmarkstanzen.) Die Bindung des Primärantikörpers an p53 wird mittels eines Fluorochrom- oder Enzymmarkierten Sekundärantikörpers sichtbar gemacht. Anschließend wird mikroskopisch der prozentuale Anteil p53-positiver Zellen ermittelt (siehe Abbildung 5). Es existiert keine einheitliche Prozentzahl für p53-postive Zellen, ab welcher der Patient als p53-positiv erachtet wird. Dies erschwert eine Vergleichbarkeit der IHC-Befunde unterschiedlicher Labore und kann bei niedrig festgelegtem Prozentsatz leicht zu falsch positiven Ergebnissen führen. [7, 12]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5: Immunhistochemischer Nachweis von p53. Braune Färbung (Peroxidase) p53- positiver Nuklei. (A) Zytospin von CLL-Lymphozyten: Koexistenz von p53-positiven und p53- negativen Zellen innerhalb einer Population. (B) Zytospin aus einem Mix von Raji-Zellen (p53- positiv) und gesunden Lymphozyten des peripheren Blutes (p53-negativ).[12]

1.1.3.7 Durchflusszyometrie (FACS)

Die Durchflusszytometrie (FACS, engl. „fluorescence-activated cell sorting“) erlaubt es, Zellen anhand ihrer Oberflächenmarker (Antigene) voneinander zu differenzieren. Dafür werden die Zellen mit Fluorochrom markierten Antikörpern, welche gegen die jeweiligen differenzierenden Antigene gerichtet sind, markiert. Am Durchflusszytometer werden die einzelnen Zellen entsprechend ihrer Fluorochrom-Markierung dargestellt. P53 befindet sich intrazellulär. Bei diesem Nachweis wird daher vor der Fluorochrom-Markierung zunächst die Zellmembran permeabilisiert, sodass die Fluorochrom markierten Antikörper intrazellulär binden können (siehe Kapitel „Material & Methoden“).

Der durchflusszytometrische Nachweis von p53 konnte sich bis dato weder im klinischen Alltag noch als Testverfahren in Studien durchsetzen. Im Rahmen der Literaturrecherche wurden neun Studien gefunden, welche sich für den Nachweis von p53 dieser Methode bedient haben. Eine Gegenüberstellung der jeweilig verwendeten Protokolle findet sich im Anhang („9.2 Durchflusszytometrischer Nachweis von p53 - Übersicht“).

In seiner mutierten Form bindet p53 an das Hitzeschock-Protein HSP70. P53 wird durch HSP70 stabilisiert und reichert sich in der Zelle an, sodass es durchflusszytometrisch nachgewiesen werden kann. [32, 79] Weitere Begründungen für die Anreicherung von p53 sind (i) Schäden von MDM2, (ii) Konformationsänderungen von p53, welchen dessen Abbau erschweren und (iii) übermäßige Stabilität und/oder Überexpression der p53- mRNA[36]

Ebenso wie bei der Immunhistochemie handelt es bei der Durchflusszytometrie um ein immunologisches Nachweisverfahren. Das heißt, die zu untersuchende Struktur wird mittels einer Antikörper-Antigen-Bindung (Immunkomplex) detektiert.

Bei diesen Testverfahren spielt daher die Auswahl des Antikörpers zur Detektion von p53 eine gesonderte Rolle. Hierbei ist darauf zu achten, ob der jeweilige p53-Klon WT-p53 und/oder das mutierte p53 bindet.

Sowohl humane als auch murine mit p53 immunisierte B-Zellen bilden Antikörper, welche entweder gegen die aminoterminale Transaktivierungsdomäne (TAD) oder die Carboxylterminale Domäne (CTD) gerichtet sind. [32, 76, 107] Da sich die Mutationen von p53 nachweislich, bis auf wenige Ausnahmen, in der mittleren DNS-Bindungsdomäne befinden (vergleiche Abbildung 1), unterscheiden sich WT-p53 und mutiertes p53 in den terminalen Domänen nicht. Aus diesem Grund detektieren die meisten erwerblichen Antikörper sowohl mutiertes als auch WT-p53. Der Aufwand für die Herstellung von Antikörpern welche ausschließlich gegen das mutierte p53 gerichtet sind, ist vergleichsweise hoch.[32]

90 Prozent der TP53-Mutationen sind Missense-Mutationen (vergleiche Abbildung 1) die aus oben genannten Gründen zu einer intrazellulären Anreicherung von p53 führen. Bei den weiteren zehn Prozent handelt es sich um Unsinn-Mutationen (engl. „ nonsense- mutations“) oder Leserasterverschiebungen (engl. „frameshift“), welche im Gegensatz zu Missense-Mutationen zu einer Instabilität von p53 führen und somit nicht mittels Antikörper nachgewiesen werden könnten.[36] Dies stellt einen Nachteil der Durchflusszytometrie gegenüber molekularbiologischen Methoden dar.

1.2 P53 in hämatologischen Neoplasien

1.2.1 Übersicht

Mehr als die Hälfte menschlicher Tumore weisen eine p53 Mutation auf. Bei hämatologischen Neoplasien hingegen ist die Mutationsrate von p53 vergleichsweise gering. Sie liegt bei etwa 14%.[38] Dennoch ist die Untersuchung von p53 auch bei diesen Erkrankungen lohnenswert. Mutationen oder Funktionsstörungen von p53 können eine schlechte Prognose für den Patienten darstellen. Entweder weil sie auf eine baldige Progression und somit kürzerer Überlebensdauer hinweisen oder weil sie mit einer Resistenz gegenüber verschiedener Chemotherapien einhergehen. Im Folgenden wird der Wert von p53-Untersuchungen für ausgewählte hämatologische Neoplasien erläutert. Es wurde eine Auswahl von hämatologischen Neoplasien getroffen, welche in einem hämatalogischen Speziallabor häufig untersucht werden. Auf Basis einer umfassenden Literaturrecherche wurde in dieser Arbeit für die jeweiligen hämatologischen Neoplasien eine Metaanalyse bezüglich der p53-(Fehlfunktions-)Prävalenz und damit einhergehende klinische Befunde erstellt. Eine zusammenfassende Übersicht über die im Folgenden erläuterten Ergebnisse findet sich im Anhang (siehe Anhang „9.1 P53 in hämatologischen Neoplasien - Zusammenfassung“).

1.2.2 Chronisch Lymphatische Leukämie (CLL)

Die Chronisch Lymphatische Leukämie (CLL), in einer bestimmten Ausprägungsform mit Lymphknotenbefall und geringer Ausschwemmung auch als kleinzelliges lymphozytisches Lymphom (SLL) bezeichnet, zählt zu den Non-Hodgkin Lymphomen (NHL) und ist in den westlichen Ländern mit einem Anteil von 30 Prozent die häufigste Leukämieform.[30] 2011 erkrankten in Deutschland 5.000 Menschen an einer CLL, 2.000 CLL-Patienten starben.[129]

Die CLL lässt sich in mehrere Stadien einteilen. Sowohl die RAI-Klassifikation (Stadium 0 - Stadium IV) als auch die BINET-Klassifikation (A-C) sind für die Stadieneinteilung international anerkannt. Für die Stadieneinteilung sind jeweils das klinische Bild (Lymphknoten-/ Leber-/ Milzvergrößerung) und das Blutbild (Lymphozytenzahl, Hämoglobin, Thrombozytenzahl) entscheidend.[30] In seltenen Fällen kann die CLL in ein aggresives Lymphom übergehen. Man spricht hierbei von einem Richter-Syndrom oder auch einer Richter-Transformation. 90 Prozent der Richter-Transformationen enden in einem diffusen großzelligen B-Zell Lymphom (DLBCL). Die weiteren zehn Prozent entwickeln sich zu einem Hodgkin-Lymphom, welches dann als „Hodgkin Variante des Richter-Syndroms“ bezeichnet wird.[45]

Zur Einschätzung des Gesamtüberlebens von CLL-Patienten gibt es zahlreiche Prognosefaktoren. Gebräuchlich sind unter anderem die Bestimmungen von ZAP70 (70- kD zeta-assoziiertes Protein), CD38 und IgVH (Mutationsstatus der Genregion für den variablen Teil der schweren Kette des Immunglobulins). [20, 99] Die wohl größte prognostische Bedeutung kommt allerdings der Deletion des Chromosoms 17 (Del(17p)), auf welchem sich der Genabschnitt für p53 befindet, zu. Dies wird durch den von Pflug et al. 2014 entwickelten Prognose-Index für CLL-Patienten deutlich. Bei diesem werden acht unterschiedliche Prognosefaktoren untersucht (Del(17p)), s-TK, s-β2m, IgVH, ECOG, Del(11q), Geschlecht und Alter), für welche insgesamt bis zu 14 Punkte vergeben werden können. Del(17p) ist mit einer Gewichtung von sechs Punkten mit Abstand der entscheidendste Prognosefaktor.[97]

Die Wahrscheinlichkeit, dass bei einem Patienten mit einer CLL, unabhängig vom Stadium, eine Mutation des Gens TP53 und/oder eine Deletion des Chromosom 17 (Del(17p)) (Mutation und Deletion werden im Folgenden als „p53-Fehlfunktion“ bezeichnet) vorliegt, liegt bei etwa 14 Prozent. Das geht aus zehn unterschiedliche Studien hervor, welche insgesamt 3067 zufällig ausgewählte CLL-Patienten durch unterschiedliche Methoden auf Mutationen im TP53 Gen (vor allem durch Sequenzierung) beziehungsweise auf eine Deletion des Chromosom 17 (FISH) untersucht haben. Der jeweilig prozentuale Anteil positiv getesteter CLL-Patienten schwankte von 7 - 18 Prozent (± 3 Prozent). (siehe Tabelle 1)

Tabelle 1 p53-Fehlfunktionsrate bei CLL-Patienten

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Mit dem Voranschreiten der Erkrankung nimmt die Wahrscheinlich für das Vorliegen einer p53-Fehlfunktion zu. [12, 65] So wiesen 8/108 (7 %) CLL-Patienten der Gruppe A (BINET-Klassifikation) eine Mutation von TP53 auf. CLL-Patienten der Gruppe B beziehungsweise der Gruppe C hingegen wiesen in 12/49 (24 %) beziehungsweise in 7/24 (29 %) der Fälle eine Mutation des TP53-Gens auf.[12] Auch die Art der Mutation ändert sich im Krankheitsverlauf. Während CLL-Patienten mit einer TP53-Mutation bei Erstdiagnose ausschließlich heterozygote Missense-Mutationen aufwiesen, fanden sich bei progressiven CLL-Erkrankungen vornehmlich homozygote Missense-Mutationen zusammen mit Mikrodeletionen.[78] Zudem konnte ein signifikanter Zusammenhang von TP53-Mutationen mit einer prozentualen Erhöhung der Prolymphozyten und einer prozentualen Erniedrigung residualer CD3+ T-Lymphozyten festgestellt werden. Alter, Geschlecht und absolute Lymphozytenzahl hingegen sind unabhängig von einer TP53 Mutation. [12, 65] Die Überlebensdauer wird bei CLL-Patienten mit einer p53- Fehlfunktion auf durchschnittlich 41 Monate geschätzt. Diese ist deutlich verkürzt im Verhältnis zu CLL-Patienten ohne eine p53-Fehlfunktion, welche eine durchschnittliche Überlebensdauer von 71 Monaten aufweisen.[138]

Die höchste p53-Fehlfunktionsrate findet sich bei CLL-Patienten, welche bereits eine Erstlinien-Chemotherapie erhalten haben und auf die Zweitlinien-Chemotherapie nicht ansprechen. Die Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer p53-Fehlfunktion liegt bei diesen Patienten bei etwa 34 Prozent. Das geht aus sechs voneinander unabhängigen Studien hervor, welche insgesamt 232 chemoresistente (gegen Fludarabin/ Chlorambucil/ CHOP) CLL-Patienten durch unterschiedliche Methoden auf Mutationen im TP53 Gen beziehungsweise auf eine Deletion des Chromosom 17 untersucht haben. Der jeweilig prozentuale Anteil an chemoresistenten CLL-Patienten mit einer p53-Fehlfunktion schwankte von 21 - 100 Prozent (± 28 Prozent) (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2 p53-Fehlfunktionsrate bei chemoresistenten CLL-Patienten

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Man geht davon aus, dass der durch die Chemotherapie hervorgerufene Selektionsdruck eine p53-Fehlfunktion begünstigt. Die Mutationen von TP53 befinden sich vor allem an einem CpG-Dinukleotid. Die Häufigkeit der TP53-Mutationen, die sich an einem CpG- Dinukleotid befinden, nimmt mit Fortschritt der Krankheit ab und ist bei chemoresistenten Patienten am geringsten (bei Diagnose 50%, bei progressiver CLL 33% und bei Chemoresistenten 20%).[78] CpG-Mutationen werden vornehmlich endogen gesteuert (Der zu Grunde liegende Mechanismus basiert auf der DNS-Glykosylase- Aktivität, welche so genannte AP-Stellen erzeugt und somit eine Mutationsentstehung begünstigt).[21] Dies lässt darauf schließen, dass die Mutationen bei chemoresistenten Patienten, welche relativ seltener an einem CpG-Dinukleotid auftreten, exogen herbeigeführt werden. Aller Vermutung nach durch die vorangegangene Chemotherapie.

Weiterhin konnten Untersuchungen an Opfern der Tschernobyl-Reaktorkatastrophe einen Zusammenhang der CLL-Pathogenese mit einer p53-Fehlfunktion aufdecken. Die häufigste Neoplasie, welche diese Opfer entwickelten war eine CLL. Kurz nach der Katastrophe hatte man bei diesen eine Erniedrigung der LGL-Zellen (englisch, large granular lymphocytes) festgestellt. LGL-Zellen weisen eine Zytotoxität gegenüber CLL- Lymphomzellen auf. Dieser Mechanismus ist vermutlich auf die Erkennung der LGL- Zellen von p53 zurückzuführen.[87] Sodass eine p53-Fehlfunktion die Zerstörung von Lymphomzellen erschweren und somit eine CLL-Entstehung begünstigen könnte.

1.2.3 Diffuses großzelliges B-Zell-Lymphom (DLBCL)

Bei einem Großteil der B-NHL handelt es sich um ein diffuses großzelliges B-Zell- Lymphom (DLBCL). Das DLBCL ist ein aggressives schnell wachsendes Lymphom und häufig Folge einer Transformation von einem vorangegangenen weniger malignem Lymphom. Das Lymphom befindet sich zu 40 Prozent extranodal. Die häufigste Manifestation ist der Gastrointestinaltrakt. Doch auch an allen weiteren Organen, selbst im Gehirn, kann sich das DLBCL ausbreiten.[30]

Der International Prognostic Index (IPI), beziehungsweise seit 2014 der National Comprehensive Cancer Network-IPI (NCCN-IPI), ermöglicht es, eine Aussage über die Schwere des weiteren Krankheitsverlaufes zu machen. Der Index ergibt sich aus einer Bewertung des Alters, des Krankheitsstadiums, der Anzahl extranodaler Herde, dem Allgemeinzustand und der LDH-Konzentration im Serum. Genetische Aberrationen wie beispielsweise eine del(17) werden nicht berücksichtigt.[139]

Ob das Vorliegen einer p53-Fehlfunktion bei DLBCL-Patienten mit einer schlechteren Überlebensrate assoziiert ist, ist umstritten. Allerdings kam ein Großteil der vorliegenden Studien zu dem Ergebnis, dass die Überlebensrate bei DLBCL-Patienten mit einer p53- Fehlfunktion deutlich schlechter ausfiel, als bei DLBCL-Patienten ohne eine p53- Fehlfunktion. [3, 53, 61, 66, 72, 115, 130, 131, 134, 136] Die Minderheit der Studien konnte keinen Zusammenhang zwischen dem Vorliegen einer p53-Fehlfunktion und einer verschlechterten Übelebenrate bei DLBCL-Patienten feststellen. [60, 102, 114, 135]

Die Wahrscheinlichkeit, dass ein DLBCL-Patient eine p53-Fehlfunktion aufweist, liegt bei etwa 25 Prozent. Das geht aus 19 voneinander unabhängigen Studien hervor, welche insgesamt 2314 DLBCL-Patienten durch unterschiedliche Methoden auf eine p53- Fehlfunktion testeten. Der jeweilig prozentuale Anteil positiv getesteter DLBCL-Patienten schwankte von 13 - 54 Prozent (± 12 Prozent) (siehe Tabelle 3).

Tabelle 3 p53-Fehlfunktionsrate bei DLBCL-Patienten

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Die Häufigkeit einer p53-Fehlfunktion bei DLBCL-Patienten steht in keinem Zusammenhang mit dem Alter, dem LDH-Wert oder einer B-Symptomatik (Fieber, Nachtschweiß und Gewichtsverlust).[61] Ob ältere Patienten signifikant häufiger eine p53- Fehlfunktion aufweisen, ist umstritten. [48, 61] Aus einer weiteren Studie geht jedoch hervor, dass die Bestimmung der p53-Expression ohnehin nur für DLBCL-Patienten unter 65 Jahren von prognostischer Bedeutung sei. Da nur bei diesen eine Korrelation zwischen einer p53-Überexpression und der Wahrscheinlichkeit für eine komplette Remission und einer erhöhten 5-Jahres Überlebensrate festgestellt werden konnte.[77]

1.2.4 Haarzellenleukämie (HCL)

Die Haarzellenleukämie (HCL) zählt zu den B-NHL. Die Namensgebung rührt von der Morphologie der Lymphozyten, deren Zytoplasma feinhaarige Ausziehung aufweisen. Männer sind deutlich häufiger betroffen als Frauen (5:1). 10 - 20 Prozent der HCL treten als HCL-V, eine Variante der Haarzellenleukämie, auf. Diese verläuft aggressiver. HCL-V Patienten weisen eine kürzere Überlebenszeit auf und sprechen schlechter auf herkömmliche Therapieformen an.[30]

Die Mutationsrate von p53 bei HCL-Patienten liegt bei etwa 28 Prozent.[58] Bei HCL-V Patienten fanden sich mehr p53-postive Zellen als bei Patienten mit einer typischen HCL. [123]

1.2.5 Chronische myeloische Leukämie (CML)

Die chronisch myeloische Leukämie (CML) zählt zu den Myeloproliferativen Neoplasien (MPN). Die Pathogenese der typischen CML hat ihren Ursprung in dem BCR/ABL- Fusionsgen (t(9;22); Philadelphia-Chromosom). Die CML hat einen Anteil von 20 - 30 Prozent an den Erwachsenenleukämien und kann grundsätzlich in jedem Alter auftreten.

Der Krankheitsverlauf der CML lässt sich typischerweise in drei Stadien einteilen: Die chronische Phase, das Akzelerationsstadium und die Blastenkrise. Letzteres ist seit Einführung der Tyrosinkinaseinhibitoren im klinischen Alltag kaum noch vorzufinden. [31]

Mutationen von p53 wurden in 12 - 30 Prozent getesteter CML-Patienten nachgewiesen. [9, 34, 96]. Wobei die Mutationsrate im Akzelerationsstadium höher war als in der chronischen Phase und in der Blastenkrise wiederum höher war als im Akzelerationsstadium. [8, 96] Man geht davon aus, dass die Blastenkrise mit Mutationen des TP53-Gens zusammenhängen und dass 25 Prozent der CML-Progressionen durch eine p53-Funktionseinschränkung hervorgerufen werden. [23, 42] Sodass p53 auch bei der CML als prognostischer Marker fungieren könnte. Zudem konnte eine Korrelation zwischen p53-Expression und der Expression so genannter Multidrug Resistance-Related Proteine festgestellt werden.[9] Die Detektion von p53 könnte also auch bei CML-Patienten auf eine mögliche Therapie-Resistenz hinweisen.

1.2.6 Myelodysplastisches Syndrom (MDS)

Das myelodysplastische Syndrom (MDS) ist ein vielseitiges Krankheitsbild, bei welchem die Stammzellen im Knochenmark in dem Maße geschädigt sind, dass es zu Fehlbildungen der hämatopoetischen Zelllinien kommt (Dysplasie). Im Knochenmark zeigt sich eine überschiessende Proliferation. Im peripheren Blut hingehen liegt eine Zytopenie einer oder mehrere hämapoetischer Zellinien vor.[29]

In Deutschland liegt die jährliche Inzidenz der Neuerkrankungen bei 4/100.000 Einwohner. Betroffen sind vor allem ältere Menschen. Vier von fünf MDS-Patienten sind bei der Erstdiagnose über 60 Jahre alt.[41]

Zur Einteilung von MDS-Patienten in unterschiedliche Risikogruppen gibt es verschiedene Punktesysteme. Das wohl am häufigsten verwendete Punktesystem ist das Internationale prognostische Scoring-System (IPSS). Bei diesem werden Punkte für die Zahl der Blasten im Knochenmark, den Karyotypen und die Zytopenie im peripherem Blut vergeben. Von der jeweils erreichten Punktzahl wird eine mediane Überlebenszeit abgeleitet.[33] Eine Deletion des Chromosoms 17 beziehungsweise eine TP53-Mutation spielt bei dem IPSS eine untergeordnete Rolle und wird auch nicht explizit erwähnt. Sie wird nur bei der Anzahl der Anomalien im Karyotyp erfasst.

Nichtsdestotrotz konnten zahlreiche Studien zeigen, dass MDS-Patienten mit einer vorliegenden TP53-Mutation eine deutlich kürzere Gesamtüberlebenszeit aufweisen, als MDS-Patienten ohne eine TP53-Mutation. [4, 55, 57, 62, 89, 91, 108, 117, 125] So hatten MDS-Patienten ohne eine TP53-Mutation eine mediane Gesamtüberlebenszeit von 55 Monaten, während MDS-Patienten mit einer TP53-Mutation eine mediane Gesamtüberlebenszeit von 10 Monaten aufwiesen. [4, 57, 62]

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