Der 5′-UTR-Bereich des Coronavirus-229E-Genoms enthält einige konservierte RNA-Strukturelemente, die vermutlich als cis-aktive Elemente für die virale RNA-Synthese benötigt werden. Einige dieser Elemente sind möglicherweise auch an sogenannten long-range-Interaktionen mit dem 3′-terminalen Ende des Genoms beteiligt.
In dieser Bachelorarbeit wurde ein revers-genetischer Ansatz verwendet, um die Bedeutung der Stammschleifen (SL)-Strukturen 4 und 5 näher zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden Mutanten des humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E) erzeugt, die spezifische Nukleotidsubstitutionen in den SL4- bzw. SL-5-Strukturen enthielten, die (laut computergestützten Strukturvorhersagen) zu einer Destabilisierung der entsprechenden Strukturelemente führen sollten. Mögliche Auswirkungen der Mutationen auf die HCoV-229E-Replikation in Zellkultur wurden durch Bestimmung der Virustiter nach der Transfektion von In-vitro-transkribierter HCoV-229E-Genom-RNA (Wildtyp bzw. mutiert) untersucht. Außerdem wurde durch Sequenzanalysen von Teilbereichen der Genome der erhaltenen Viren untersucht, ob die eingeführten Mutationen stabil waren oder aber Reversionen oder kompensatorische Mutationen im 5′-UTR-Bereich auftraten. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass eine Destabilisierung des basalen Anteils der SL4-Struktur (Stamm 4a) relativ gut toleriert wird. In allen Fällen wurden lebensfähige Mutanten isoliert, wenngleich die Virustiter geringfügig reduziert waren und erste Hinweise für kompensatorische Mutationen bei einzelnen Virusmutanten erhalten wurden.
Zur Vorbereitung weiterer Studien wurden in einem zweiten Teil der Arbeit erste Schritte unternommen zur Herstellung von HCoV-229E-SL5-Mutanten, die spezifische Nukleotidsubstitutionen in den Schleifenregionen der SL5a/b/c-Strukturen enthalten.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Einführung
1.2 Klassifikation der Nidovirales
1.3 Morphologie der Coronavirinae
1.4 Genomorganisation und Replikation von Coronaviren
1.4.1 Genomstruktur
1.4.2 Replikation und Transkription
1.4.3 Sekundärstrukturen im UTR-Bereich
1.4.3.1 SL-Struktur 1 (SL1)
1.4.3.2 SL-Struktur 2 (SL2)
1.4.3.3 SL-Struktur 3 (SL3)
1.4.3.4 SL-Struktur 4 (SL4)
1.4.3.5 SL-Struktur 5 (SL5)
1.5 Zielsetzung
2 Material und Methoden:
2.1 Medien und Lösungen
2.1.1 Zellkulturmedium
2.1.2 TAE-Puffer (50x)
2.1.3 LB-Medium
2.1.3.1 LB-Medium + Agar
2.1.3.2 LB-Medium + Ampicillin
2.1.3.3 LB-Medium + Ampicillin + Agar
2.1.4 TE-Puffer
2.1.4.1 TE-Puffer + Saccharose
2.1.5 DNase-Puffer (10x)
2.1.6 Proteinase-K-Puffer (2x)
2.1.7 Minipräparation
2.2 Zellkultur
2.2.1 Zellen splitten
2.2.2 Zellen zählen
2.2.3.Verwendete Zelllinien
2.3 Virus
2.3.1 HCoV-229E
2.3.1.1 Transfektion
2.3.1.2 TCID50
2.3.1.3 Plaque-Test
2.3.1.4 Passagieren von HCoV-229E
2.3.2 Arbeiten mit Vacciniaviren
2.3.2.1 Virussufreinigung
2.3.2.2 DNA-Tranfektion von Vaccinia-infizierten Zellen
2.3.2.3 gpt-Negativselektion
2.4 RNA
2.4.1 RNA-Isolation
2.4.2 Quantifizierung der RNA-Konzentration
2.4.3 Reverse Transkription
2.4.4 In-vitro-Transkription
2.4.5 Auftrennung von RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese
2.5 DNA
2.5.1 PCR
2.5.2 Auftrennung von DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese
2.5.3 Restriktionsverdau
2.5.3.1 DpnI-Verdau
2.5.3.2 ClaI-Verdau
2.5.4 DNA-Sequenzierung
2.5.5 Plasmid-DNA-präparation (Minipräparation)
2.5.6 DNA-Fällung
2.5.7 Bestimmung der DNA-Konzentration
2.6 Bakterien
2.6.1 Transformation
2.7 Verwendete Kits
3 Ergebnisse
3.1 Stammschleife 5 (SL5) von HCoV-229E
3.1.1 Theoretischer Hintergrund
3.1.1.1 Deletionsmutanten
3.1.1.2 Single Nukleotidmutanten
3.1.1.3 Mehrfachmutante
3.1.2 Mutagenese
3.1.3 Negativselektion
3.2 SL4
3.2.1 Theoretischer Hintergrund
3.2.1.1 „Minimal“-mutanten
3.2.1.2 „Maximal“-mutanten
3.2.2 in-vitro-Transkription der Volllängen-HCoV-229E-Genom-RNA
3.2.3 Transfektion
3.2.4 TCID50-Bestimmung (Passage 0)
3.2.5 Sequenz-Analyse von SL4-Mutanten
3.2.5.1 Passage 0 #1
3.2.5.2 Passage 0 #2
3.2.6 Plaque-Test
3.2.7 Passagen 1-5
3.2.7.1 TCID50 Passage 1
3.2.8 Passage 6
3.2.8.1 Passage 6 #1
3.2.8.2 Passage 6 #2
4 Diskussion
5 Ausblick
6 Referenzen
Zielsetzung & Themen
Diese Arbeit zielt darauf ab, die Rolle putativer cis-aktiver RNA-Elemente (insbesondere der Stammschleifen SL4 und SL5) in der 5′-nichttranslatierten Region des Genoms des humanen Coronavirus 229E mittels revers-genetischer Ansätze zu untersuchen und deren Einfluss auf die virale Replikation zu charakterisieren.
- Charakterisierung von RNA-Sekundärstrukturen in der 5'-UTR von HCoV-229E
- Generierung spezifischer Virusmutanten durch Nukleotidsubstitutionen und Deletionen
- Analyse der Replikationseffizienz mittels Virustiterbestimmung (TCID50) und Plaque-Tests
- Untersuchung der genomischen Stabilität und potenzieller kompensatorischer Mutationen durch Sequenzanalysen
Auszug aus dem Buch
1.4.3 SEKUNDÄRSTRUKTUREN IM UTR-BEREICH
Sowohl bei Vertretern von Alpha-, Beta- als auch Gamma-Coronaviren konnte gezeigt werden, dass die 5'-terminalen 466-649 nt sowie die 388 bis 493 nt am 3'-terminalen Ende und der Poly-A Schwanz für die Genomreplikation benötigt werden (Sola et al. 2011). Diese Regionen beinhalten sowohl RNA-Sekundärstrukturen als auch komplexere DNA-Strukturen, welche, wie bereits erwähnt, als cis-aktive Elemente bezeichnet werden. Diese interagieren sowohl untereinander (RNA-RNA-Interaktion) als auch mit Proteinen. In den meisten Fällen befinden sich die Strukturen durchgehend im UTR-Bereich. Sie können sich aber in manchen Fällen bis in den kodierenden Bereich erstrecken (Sola et al. 2011).
Es wird angenommen, dass sich innerhalb des 5′-UTR 4-5 verschiedene SL-Strukturen befinden. Viele dieser Sekundärstrukturen sind über die ganze Subfamilie Coronavirinae hinweg konserviert, sodass ein Komplettaustausch von Sekundärstrukturen unterschiedlicher Viren ohne Verlust der Replikationsfähigkeit möglich ist (Kang et al. 2006; Chen & Olsthoorn 2010).
Durch Einsatz reverser Genetik konnte die Funktion der cis-aktiven Elemente innerhalb der UTR-Sequenz der Coronaviren auf Nukleotidebene erforscht werden. Dies hat innerhalb der letzten Jahre auch zur Entdeckung einiger long-range Interaktionen geführt, die für die Virusreplikation erforderlich sind.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Vermittelt grundlegende Kenntnisse über Coronaviren, deren Genomstruktur, Replikationsmechanismen und die Bedeutung konservierter Sekundärstrukturen in der UTR.
2 Material und Methoden: Beschreibt detailliert die verwendeten Zellkulturtechniken, Virusinfektionsmodelle, molekularbiologischen Methoden zur Mutagenese sowie die Analysetechniken für RNA und DNA.
3 Ergebnisse: Dokumentiert die Generierung von SL5- und SL4-Mutanten, deren Replikationsverhalten in Huh7-Zellen sowie die Sequenzanalyse zur Untersuchung von Stabilität und kompensatorischen Mutationen.
4 Diskussion: Interpretiert die experimentellen Daten hinsichtlich der strukturellen Bedeutung von SL4 und SL5 für die virale Replikation und erörtert mögliche Kompensationsmechanismen.
5 Ausblick: Schlägt weiterführende Studien vor, um die funktionelle Rolle der generierten Mutanten und die molekularen Mechanismen von long-range Interaktionen tiefergehend zu verstehen.
6 Referenzen: Listet die für diese Arbeit verwendete wissenschaftliche Fachliteratur auf.
Schlüsselwörter
Humanes Coronavirus 229E, HCoV-229E, 5'-UTR, cis-aktive RNA-Elemente, Stammschleifen, reverse Genetik, Replikation, Mutagenese, Virusmutanten, long-range Interaktionen, TCID50, Transkription, Genomstruktur, Sekundärstrukturen, RNA-Synthese.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Bachelorarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht die funktionelle Bedeutung spezifischer RNA-Strukturelemente (Stammschleifen 4 und 5) in der 5'-untranslatierten Region des Genoms von HCoV-229E.
Was sind die zentralen Themenfelder der Untersuchung?
Im Fokus stehen die Genomorganisation, die RNA-Sekundärstrukturen, die virale Replikation sowie die Auswirkungen von gezielten Mutationen auf die Lebensfähigkeit des Virus.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das Ziel ist die Charakterisierung putativer cis-aktiver RNA-Elemente durch Destabilisierung der Strukturen und die anschließende Bewertung der Auswirkungen auf den Replikationszyklus.
Welche wissenschaftliche Methode wird primär verwendet?
Es wird ein revers-genetischer Ansatz genutzt, um gezielte Mutationen in die virale cDNA einzuführen und deren Auswirkungen mittels Zellkultur-Assays zu analysieren.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil befasst sich mit der Erstellung computergestützter Vorhersagen zu Sekundärstrukturen, der praktischen Durchführung der Mutagenese sowie der virologischen und molekularbiologischen Auswertung der generierten Mutanten.
Welche Begriffe charakterisieren die Arbeit am besten?
Die Arbeit ist durch Begriffe wie Reverse Genetik, HCoV-229E, 5'-UTR, RNA-Sekundärstrukturen, Replikationskinetik und Sequenzanalyse geprägt.
Welche Bedeutung hat die SL4-Struktur für das Virus?
Die SL4-Struktur fungiert vermutlich als Spacer-Element, welches für den korrekten Abstand zwischen anderen wichtigen RNA-Strukturen während der Replikation sorgt.
Was deuten die beobachteten kompensatorischen Mutationen an?
Das Auftreten solcher Mutationen deutet darauf hin, dass das Virus versucht, durch sekundäre genetische Anpassungen die Destabilisierung der ursprünglichen RNA-Struktur auszugleichen, um die Replikationseffizienz wieder zu steigern.
- Arbeit zitieren
- Marvin Strauch (Autor:in), 2015, Charakterisierung von putativen cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-nichttranslatierten Region des RNA-Genoms des Humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E), München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/354215
