Charakterisierung von putativen cis-aktiven RNA-Elementen in der 5'-nichttranslatierten Region des RNA-Genoms des Humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E)

Inhaltsverzeichnis

Abbildungen

Abkürzungen

Zusammenfassung

Abstract

1 Einleitung
1.1 Einführung
1.2 Klassifikation derNidovirales
1.3 Morphologie der Coronavirinae
1.4 Genomorganisation und Replikation von Coronaviren
1.4.1 Genomstruktur
1.4.2 Replikation und Transkription
1.4.3 Sekundärstrukturen im UTRBereich
1.4.3.1 SLStruktur 1 (SL1)
1.4.3.2 SLStruktur 2 (SL2)
1.4.3.3 SLStruktur 3 (SL3)
1.4.3.4 SLStruktur 4 (SL4)
1.4.3.5 SLStruktur 5 (SL5)
1.5 Zielsetzung

2 Material und Methoden:
2.1 Medien und Lösungen
2.1.1 Zellkulturmedium
2.1.2 TAEPuffer (50x)
2.1.3 LBMedium
2.1.3.1 LBMedium + Agar
2.1.3.2 LBMedium + Ampicillin
2.1.3.3 LBMedium + Ampicillin + Agar
2.1.4 TEPuffer
2.1.4.1 TEPuffer + Saccharose
2.1.5 DNasePuffer (10x)
2.1.6 ProteinaseKPuffer (2x)
2.1.7 Minipräparation
2.2 Zellkultur
2.2.1 Zellen splitten
2.2.2 Zellen zählen
2.2.3.Verwendete Zelllinien
2.3 Virus
2.3.1 HCoV229E
2.3.1.1 Transfektion
2.3.1.2 TCID50
2.3.1.3 PlaqueTest
2.3.1.4 Passagieren von HCoV229E
2.3.2 Arbeiten mit Vacciniaviren
2.3.2.1 Virussufreinigung
2.3.2.2 DNATranfektion von Vacciniainfizierten Zellen
2.3.2.3gptNegativselektion
2.4 RNA
2.4.1 RNAIsolation
2.4.2 Quantifizierung der RNAKonzentration
2.4.3 Reverse Transkription
2.4.4InvitroTranskription
2.4.5 Auftrennung von RNA mittels AgaroseGelelektrophorese
2.5 DNA
2.5.1 PCR
2.5.2 Auftrennung von DNA mittels AgaroseGelelektrophorese
2.5.3 Restriktionsverdau
2.5.3.1 DpnIVerdau
2.5.3.2 ClaIVerdau
2.5.4 DNASequenzierung
2.5.5 PlasmidDNApräparation (Minipräparation)
2.5.6 DNAFällung
2.5.7 Bestimmung der DNAKonzentration
2.6 Bakterien
2.6.1 Transformation
2.7 Verwendete Kits

3 Ergebnisse
3.1 Stammschleife 5 (SL5) von HCoV229E
3.1.1 Theoretischer Hintergrund
3.1.1.1 Deletionsmutanten
3.1.1.2 Single Nukleotidmutanten
3.1.1.3 Mehrfachmutante
3.1.2 Mutagenese
3.1.3 Negativselektion
3.2 SL4
3.2.1 Theoretischer Hintergrund
3.2.1.1 „Minimal“mutanten
3.2.1.2 „Maximal“mutanten
3.2.2 invitroTranskription der VolllängenHCoV229EGenomRNA
3.2.3 Transfektion
3.2.4 TCID50Bestimmung (Passage 0)
3.2.5 SequenzAnalyse von SL4Mutanten
3.2.5.1 Passage 0 #1
3.2.5.2 Passage 0 #2
3.2.6 PlaqueTest
3.2.7 Passagen 15
3.2.4.2 TCID50 Passage 1
3.2.8 Passage 6
3.2.8.1 Passage 6 #1
3.2.8.2 Passage 6 #2

4 Diskussion

5 Ausblick

6 Referenzen

ABBILDUNGEN

Abbildung 1: Klassifikation der Ordnung Nidovirales

Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Coronaviruspartikels

Abbildung 3 ; Genomorganisation und Replikationsverlauf bei Humanen Coronavirus 229E

Abbildung 4; Proteolytische Prozessierung der Polyproteine (pp)1a und 1ab.

Abbildung 5; Putative Sekundärstrukturen im 5 ′ UTRBereich des HCoV229E . ...

Abbildung 6; Schematische Darstellung der 5 ‘ terminalen Region (nt 1602) des Genoms des Humanen Coronavirus 229E

Abbildung 7; Gegenüberstellung der im WildtypHCoV229E vorkommenden SL5 (Stammschleife 5) und SL6 (Stammschleife 6) mit Sekundärstruktur (links) im Vergleich mit der für die Mutante vorhergesagten HCoV_ ∆ SL5aSekundärstruktur und SL6 (rechts)

Abbildung 8; Gegenüberstellung des im WildtypHCoV229E vorkommenden SL5 (Stammschleife 5) und SL6 (Stammschleife 6) mit Sekundärstruktur (links) im Vergleich mit der für die Mutante vorhergesagten HCoV_ ∆ SL5bSekundärstruktur und SL6 (rechts)

Abbildung 9; Gegenüberstellung des im Wildtyp HCoV229E vorkommenden SL5 (Stammschleife 5) und SL6 (Stammschleife 6) mit Sekundärstruktur (links) im Vergleich mit der für die Mutante vorhergesagten HCoV_ ∆ SL5cSekundärstruktur und SL6 (rechts)

Abbildung 10; Gegenüberstellung des im Wildtyp HCoV229E vorkommenden SL5 (Stammschleife 5) und SL6 (Stammschleife 6) mit Sekundärstruktur (links) im Vergleich mit der für die Mutante vorhergesagte HCoV_C186GSekundärstruktur und SL6 (rechts)

Abbildung 11; Gegenüberstellung des im WildtypHCoV229E vorkommenden SL5 (Stammschleife 5) und SL6 (Stammschleife 6) mit Sekundärstruktur (links) im Vergleich mit der für die Mutante vorhergesagte HCoV_G187C Sekundärstruktur und SL6 (rechts)

Abbildung 12; Gegenüberstellung der im WildtypHCoV229E vorkommenden SL5 (Stammschleife 5) und SL6 (Stammschleife 6) mit Sekundärstruktur (links) im Vergleich mit der für die Mutante vorhergesagte HCoV_CCSL5abcAA Sekundärstruktur und SL6 (rechts)

Abbildung 13; Gelelektrophorese der MutagenesePCRProdukte in einem 1% Agarosegel

Abbildung 14 A,B,C,D,E,F; Ergebnis der Sequenzanalyse nach Sanger 30 Eine

Abbildung 15; Schematische Darstellung der verwendeten Strategie zur homologen Rekombination in den infizierten und transfizierten CV1Zellen.

Abbildung 16; Gelelektrophorese der mit HCoV229E spezifischen Primern erhaltenen PCR in einem 1% Agarosegel

Abbildung 17; Gelelektrophorese der PCR mit gptspezifischen Primern in einem 1% Agarosegel

Abbildung 18 A,B,C,D,E,F; Ergebnis der Sequenzanalyse nach Sanger

Abbildung 19 Schematische Darstellung der 5 ‘ terminalen Region (nt 1602) des Genoms des Humanen Coronavirus 229E Genoms

Abbildung 20 A,B,C,D; Vorhergesagte Sekundärstrukturen der Mutanten HCoV 229E_G88C und HCoV229E_C112G sowie der Mutante HCoV 229E_G88C/C112G (B,C,D) im vergleich zur HCoV229EWildtypStruktur (A) ....

Abbildung 21 A,B,C,D; Vorhergesagte Sekundärstrukturen der Mutanten HCoV 229E_C84G und HCoV229E_G116C sowie der Mutanten HCoV 229E_C84G/G116C (B,C,D) im vergleich mit der HCoV229EWildtypStruktur (A)

Abbildung 22; Gelelektrophorese der ClaISpaltung der vHCoV229E_SL4 Mutanten in einem 1% Agarose Gel

Abbildung 23; Gelelektrophorese des InvitroTranskriptionsproduktes (1,25 µ g RNA) in einem 1% Agarose Gel mit 0,1% SDS

Abbildung 24; TCID 50 Auswertung von Ansatz p0

Abbildung 25; Gelelektrophorese von PCRProdukten zur Analyse der 5 ′ Bereiche des Genoms von HCoV229E (wt bzw. Mutanten) der Passage 0

Abbildung 26; Gelelektrophorese der PCRProdukte des 3 ′ Endes des HCoV 229EGenoms (Passage 0)

Abbildung 27; A,B; Chromatogramme der Sequenzreaktionen von p0 #1

Abbildung 28; A,B; Chromatogramme der Sequenzreaktionen von p0 #2

Abbildung 29; Sequenzanalyse der Sekundärmutation A89G innerhalb der Mutante G116C

Abbildung 30; PlaqueTest der verwendeten SL4Mutanten der Passage 0 Ansatz II

Abbildung 31; TCID 50 Auswertung von Ansatz p1

Abbildung 32; Virustiter (TCID 50 ) von wt und Mutanten nach der sechsten Passage in Huh7Zellen

Abbildung 33; Gelelektrophorese von PCRProdukten zur Analyse der 5 ′ Bereiche des Genoms von HCoV229E (wt bzw. Mutanten) der Passage 6

Abbildung 34; Gelelektrophorese der PCRProdukte des 3 ′ Endes des HCoV 229EGenoms (Passage 6)

Abbildung 35 A,B; A,B; Chromatogramme der Sequenzreaktionen von p6 #1 .. .

Abbildung 36 A,B; Chromatogramme der Sequenzreaktionen von p6 #2

Abbildung 37; Sequenzanalyse der Sekundärmutation A89G bei der Mutante G116C p6

Abbildung 38 A,B,C; Verhergesagte 5'UTRSekundärstrukturen der Mutanten HCoV_G116C (B) sowie der Mutanten HCoV_G116CG89A (C) gegenüber der verhergesagten HCoV229E5'UTRWildtypStruktur (A)

ABKÜRZUNGEN

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

ZUSAMMENFASSUNG

Der 5′-UTR-Bereich des Coronavirus-229E-Genoms enthält einige konservierte RNA- Strukturelemente, die vermutlich als cis -aktive Elemente für die virale RNA-Synthese benötigt werden. Einige dieser Elemente sind möglicherweise auch an sogenannten long-range - Interaktionen mit dem 3′-terminalen Ende des Genoms beteiligt. In dieser Bachelorarbeit wurde ein revers-genetischer Ansatz verwendet, um die Bedeutung der Stammschleifen (SL)- Strukturen 4 und 5 näher zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurden Mutanten des humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E) erzeugt, die spezifische Nukleotidsubstitutionen in den SL4- bzw. SL-5-Strukturen enthielten, die (laut computergestützten Strukturvorhersagen) zu einer Destabilisierung der entsprechenden Strukturelemente führen sollten. Mögliche Auswirkungen der Mutationen auf die HCoV-229E-Replikation in Zellkultur wurden durch Bestimmung der Virustiter nach der Transfektion von In-vitro- transkribierter HCoV-229E- Genom-RNA (Wildtyp bzw. mutiert) untersucht. Außerdem wurde durch Sequenzanalysen von Teilbereichen der Genome der erhaltenen Viren untersucht, ob die eingeführten Mutationen stabil waren oder aber Reversionen oder kompensatorische Mutationen im 5′-UTR-Bereich auftraten. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass eine Destabilisierung des basalen Anteils der SL4-Struktur (Stamm 4a) relativ gut toleriert wird. In allen Fällen wurden lebensfähige Mutanten isoliert, wenngleich die Virustiter geringfügig reduziert waren und erste Hinweise für kompensatorische Mutationen bei einzelnen Virusmutanten erhalten wurden.

Zur Vorbereitung weiterer Studien wurden in einem zweiten Teil der Arbeit erste Schritte unternommen zur Herstellung von HCoV-229E-SL5-Mutanten, die spezifische Nukleotidsubstitutionen in den Schleifenregionen der SL5a/b/c-Strukturen enthalten.

ABSTRACT

The 5′ untranslated region (5'-UTR) of the human coronavirus 229E (HCoV-229E) genome contains conserved RNA structure elements that, most probably, act as cis- active elements in viral RNA synthesis. Some of these elements may also be involved in long-range -interactions with 3′-terminal genome regions. In this B.Sc thesis, a reverse-genetic approach was used to further characterize the functions of stem-loop (SL) structures 4 and 5 in the coronavirus 5'- UTR. To this end, a set of HCoV-229E mutants containing specific nucleotide substitutions in SL4 and SL5 was generated. According to computer-based predictions, these substitutions were expected to destabilize the respective RNA structural elements. Possible effects of the mutations on HCoV-229E replication in cell culture were investigated by determining virus titers following transfection of in vitro transcribed HCoV-229E genome RNA (wildtype and mutant, respectively) into Huh7 cells. Furthermore, partial genome sequence analyses were performed to investigate if (i) the introduced nucleotide substitutions were retained or (ii) possible reversions to the wild-type sequence or compensatory mutations in the 5’-UTR occurred. Taken together, the data revealed that mutations predicted to destabilize the basal part of SL4 (stem 4a) are relatively well tolerated. In all cases, viable mutants could be isolated, although the titers of the virus mutants were slightly reduced compared to the titer of the wild-type virus. Also, there was initial evidence for compensatory mutations in some virus mutants.

To facilitate future studies on RNA structure elements in the HCoV-229E 5'-UTR, a set of HCoV-229E SL5 mutants was generated using the vaccinia-based cloning and mutagenesis system for full-length HCoV-229E cDNA. The mutants produced in this work contained specific nucleotide substitutions in the loop regions of SL5a/b/c.

1 EINLEITUNG

1.1 EINFÜHRUNG

Der Großteil der bisher bekannten Coronaviren infizieren den respiratorischen Trakt von Säugetieren und Vögeln. Sie können jedoch ebenso eine Vielzahl von anderen Erkrankungen verursachen wie Gastroenteritis, Hepatitis, Enzephalitis sowie auch Urogenitalerkrankungen (Weiss & Navas-Martin 2005). Da Coronaviren sowohl Nutztiere als auch Menschen befallen können und am Beispiel von SARS-CoV auch eine für den Menschen tödliche, durch Zoonose verursachte Erkrankung erfolgen kann, sowie seit neustem auch eine Epidemie des MERSCoV im Umlauf ist, erhalten Coronaviren und damit die Ordnung Nidovirales derzeit besondere Aufmerksamkeit (Rota et al. 2003; Anon n.d.; Scobey et al. 2013).

1.2 KLASSIFIKATION DERNIDOVIRALES

Coronaviren (Coronavirinae) bilden eine Unterfamilie in der Ordnung Nidovirales und bilden dort zusammen eine zweite Unterfamilie, der Toroviriniae, die Familie Coronaviridae. Die folgenden Abbildung 1 zeigt die derzeitige Klassifikation der Ordnung Nidovirales.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Klassifikation der Ordnung Nidovirales

Die Ordnung Nidovirales enthält die Familien Coronavirdae, Roniviridae, Arteriviridae und Mesoniviridae. Im Gegensatz zu den Coronaviridae sind in den anderen Famlilien bisher nur eine Gattung und wenige Arten beschrieben worden. Die größte Familie repräsentieren die Coronaviridae, mit ihren beiden Subfamilien Coronavirinae und Torovirinae. Sie enthalten zusammen sechs Gattungen, bei welchen vier den Coronavirinae angehören. Den Torovirinae zugehörig sind dabei Torovirus und Bafinivirus. Zu den Coronaviridae gehören die Alpha-, Beta-, Gamma- und Delta-Coronaviren.

1.3 MORPHOLOGIE DER CORONAVIRINAE

Coronaviren haben einen Durchmesser von etwa 120-160nm und besitzen die 4 Hauptstrukturproteine S, E, M und N. Das S-Protein verleiht dem Coronavirus (lat.: corona = Krone) hierbei seine typische Struktur, welche im Elektronenmikroskop an die Zacken einer Krone erinnern. Bei den viralen Hauptstrukturproteinen N, E, M und S handelt es sich um virale Strukturproteine, von denen drei (S, E, M) in der Lipidhülle verankert sind und unterschiedliche Aufgaben übernehmen (Siehe Abb.2).

N-Protein:

Bei dem N-Protein (Nukleokapsidprotein) handelt es sich um ein Phosphoprotein. Zusammen mit der genomischen RNA bildet es das helikale Nukleokapsid (Schelle et al. 2006; Zúñiga et al. 2010).

E-Protein:

Das E-Protein (engl. envelope protein = Hüllprotein) ist ein integrales Membranprotein, welches essentiell für die Virus-Partikelbildung ist (Kuo & Masters 2003).

M-Protein:

Das M-Protein (engl. membrane protein = Membranprotein) ist ein glykosyliertes Membranprotein, welches eine Dreitransmembran-Domäne im N-terminalen Bereich besitzt und in der Lage ist mit dem N-Protein zu interagieren (Narayanan et al. 2000).

S-Protein:

Bei dem S-Protein (engl. spike protein) handelt es sich um ein glykosyliertes Typ-1- Membranprotein, welches sowohl die Bindung an den Wirtszellrezeptor als auch die Fusion der Virushülle mit der Wirtszelle vermittelt (Breslin et al. 2003).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Coronaviruspartikels.

Die Abb. zeigt schematisch die einzelnen Virusbestandteile eines Coronaviruspartikels, Spike-Protein S, virale RNA, Virushülle, Membran Protein E, Membran Protein M, Nukleus Kapsid Protein N.

1.4 GENOMORGANISATION UND REPLIKATION VON CORONAVIREN

1.4.1 GENOMSTRUKTUR

Das Genom der Coronaviren besteht aus einzelsträngiger, positiv orientierter RNA mit einer Größe von etwa 30.000 Nukleotiden. Damit sind Coronaviren die bisher größten bekannten RNA-Viren.

Wie auch eukaryotische RNA besitzt die RNA der Coronaviren einen Poly-A-Schwanz am 3′-terminalen Ende sowie eine Cap-1-Struktur (7 MeGpppN2′-0Me) am 5′ terminalen Ende (Lai et al. 1984). Somit weist das coronavirale Genom alle Merkmale einer messenger RNA (mRNA) auf (Abb.3).

Sowohl am 5′- als auch am 3′- terminalen Ende des Genoms befinden sich Nukleotidsequenzen, welche nicht translatiert werden (UTR). Diese Sequenzen spielen eine zentrale Rolle bei der Replikation und Transkription der Coronaviren und werden allgemein als cis -aktive Elemente bezeichnet (Chang et al. 1994; Lin et al. 1994; Sola et al. 2011).

Zwei Drittel des Coronavirusgenoms am 5′-Ende werden von zwei überlappenden offenen Leserastern (ORF1a und ORF1b) eingenommen, die für die zwei Polyproteine 1a und 1ab kodieren. Die Translation des Polyproteins 1ab geschieht nur in 20-30% der Fälle, da die Expression des C-terminalen Anteils eine ribosomale Leserasterverschiebung (engl. frameshift = Rahmenwechsel) erfordert. Hierbei „rutscht“ das Ribosom auf einer speziellen, sieben Nukleotid langen „ slippery Sequenz“ (engl. slippery = rutschig) ein Nukleotid in die 5′- Richtung, wodurch vor Erreichen des Translations-Stopkodons des ORF1a ein Wechsel in den (-1)-Leserahmen erfolgt und das Polyprotein pp1ab (~750kDa) synthetisiert werden kann (Abb.3). Wenn keine Leserasterverschiebung erfolgt, wird statt pp1ab das Polyprotein pp1a (~450kDa) synthetisiert (Abb.3) (Bredenbeek et al. 1990).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3 ; Genomorganisation und Replikationsverlauf bei Humanen Coronavirus 229E.

Die im oberen Teil der Abb. aufgezeigten Zahlen zeigen die Genomlänge des Virus in Nukleotiden an. Direkt darunter werden die beiden überlappenden ORF 1a und 1b gezeigt. Rechts daneben sind die Gene der Strukturproteine des Virus innerhalb des Genoms schematisch dargestellt. In 70-80% der Fälle werden bei der Translation der mRNA das Polyprotein (pp)1a gebildet welches durch Proteolyse zu den nsp’s 1-11 gespalten wird und in 20-30% der Fälle das Polyprotein (pp)1ab (durch eine slippery Sequenz bei einem komplexen Pseudokoten) aus welche ebenfalls durch Proteolyse die nsp’s 1-16 gebildet werden.

(Modifiziert nach Susanne Modrow, Dietrich Falke, Uwe Truyen, Hermann Schätzl; Molekulare Virologie; 3. Auflage; Kapitel 14.8.3; Seite 249; Abb.14,23)

Die bereits erwähnten Polyproteine 1a und 1ab werden posttranslational, je nach Virusspezies, durch zwei bis drei viruseigene Proteasen in 15 bis 16 Nichtstrukturproteine (nsp) (siehe Tabelle 1 und Abb.3 sowie Abb.4) gespalten sowie wahrscheinlich zahlreiche Intermediate (Ulferts & Ziebuhr 2011).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4; Proteolytische Prozessierung der Polyproteine (pp)1a und 1ab.

Zu sehen sind die farbig Markierten Protease-Schnittstellen sowie die konservierten Domänen in pp1a und pp1ab. Hellgrüne Pfeile stellen hier die PL2pro Schnittstelle da und dunkelblaue die PL1pro Schnittstelle. Die roten Pfeile zeigen die Mpro-Schnittstellen. Ac = acidic domain; PL1pro und PL2pro = papain-like proteases 1 und 2; X = Adenosindiphosphat-Ribose-1‘‘-Phosphatase-Domäne (oder X-Domäne); TM1, TM2, TM3 = Transmembran-Domäne; Mpro = Hauptprotease; RDRP = RNA- dependent RNA Polymerase; ZBD = Zinkbindende Domäne; HEL = Helicase; ExoN = Exonuclease; NendoU = Endonuclease; MTR = Methyltransferase.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Bekannte Funktionen der coronaviralen Nichtstrukturproteine.

Tabellarisch aufgelistet sind die Nichtstrukturproteine (nsp’s) und der für sie kodierende ORF (links daneben). Zu jedem nsp ist die ungefähre Größe in kDa angegeben sowie die bisher beschriebenen Funktionen.

(Modifiziert nach Susanne Modrow, Dietrich Falke, Uwe Truyen, Hermann Schätzl; Molekulare Virologie; 3. Auflage; Kapitel 14.8.3; Seite 251-252; Tabelle 14.19)

1.4.2 REPLIKATION UND TRANSKRIPTION

Gemeinsam mit zellulären-Proteinen und dem Nukleokapsidprotein N bilden die nsp′s den viralen Replikations-Transkriptions Komplex (RTC) (Schelle et al. 2005).

Der RTC ist als Multiproteinkomplex in der Lage die coronavirale RNA zu replizieren und 6-9 subgenomische RNA′s (sgRNA) zu synthetisieren, welche als mRNA‘s für die Translation der coronaviralen Strukturproteine (Kapitel 1.3) dienen.

Die sgRNA′s besitzen am 5′ Ende eine leader- Sequenz, welche mit dem 5′-Ende des Genoms übereinstimmt (Abb.3) (Sawicki et al. 2007). Dies wird erreicht, indem der entstehende Komplementärstrang der negativen sgRNA an seinem 3′ Ende als letzten Schritt eine Kopie der leader- Sequenz angehängt bekommt, was allgemein als „diskontinuierliche Extension“ von Negativsträngen bekannt ist (Sethna et al. 1991).

Es wird angenommen, dass die Replikation wie auch die Transkription über RNA-RNA sowie RNA-Protein und Protein-Protein Interaktionen gesteuert wird. Dabei scheinen long- range (engl. long-range = über große Reichweite) Interaktionen und lokale RNA-RNA- Interaktionen als eine Art molekularer Schalter zu fungieren, welcher die Verwendung bestimmter RNA’s für die Replikation Transkription oder Translation festlegt (Sola et al. 2011).

1.4.3 SEKUNDÄRSTRUKTUREN IM UTR-BEREICH

Sowohl bei Vertretern von Alpha-, Beta- als auch Gamma -Coronaviren konnte gezeigt werden, dass die 5'-terminalen 466-649 nt sowie die 388 bis 493 nt am 3'-terminalen Ende und der Poly-A Schwanz für die Genomreplikation benötigt werden (Sola et al. 2011). Diese Regionen beinhalten sowohl RNA-Sekundärstrukturen als auch komplexere DNA-Strukturen, welche, wie bereits erwähnt, als cis -aktive Elemente bezeichnet werden. Diese interagieren sowohl untereinander (RNA-RNA-Interaktion) als auch mit Proteinen. In den meisten Fällen befinden sich die Strukturen durchgehend im UTR-Bereich. Sie können sich aber in manchen Fällen bis in den kodierenden Bereich erstrecken (Sola et al. 2011).

Es wird angenommen, dass sich innerhalb des 5′-UTR 4-5 verschiedene SL-Strukturen befinden. Viele dieser Sekundärstrukturen sind über die ganze Subfamilie Coronavirinae hinweg konserviert, sodass ein Komplettaustausch von Sekundärstrukturen unterschiedlicher Viren ohne Verlust der Replikationsfähigkeit möglich ist (Kang et al. 2006; Chen & Olsthoorn 2010).

Durch Einsatz reverser Genetik konnte die Funktion der cis- aktiven Elemente innerhalb der UTR-Sequenz der Coronaviren auf Nukleotidebene erforscht werden. Dies hat innerhalb der letzten Jahre auch zur Entdeckung einiger long-range Interaktionen geführt, die für die Virusreplikation erforderlich sind.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5; Putative Sekundärstrukturen im 5 ಿ -UTR-Bereich des HCoV-229E.

Die angegebenen Zahlen repräsentieren die Nukleotid Nummerierung innerhalb des Genoms. SL= SL-Struktur, TRS-L= Transkriptions-regulations-Sequenz, grau hinterlegt = Startcodon des ORF1a.

(Modifiziert von Madhugiri et al., unveröffentlichte Daten).

1.4.3.1 SL-STRUKTUR 1 (SL1)

Die Struktur SL1 (Abb.5) wird bei allen Coronaviren als konserviert angesehen (Chen & Olsthoorn 2010).

Es wird angenommen, dass es sich bei SL1 (Abb.5) um eine dynamische SL-Struktur handelt, welche durch unterschiedliche long-range- RNA-RNA-Interaktionen an der viralen Replikation und Transkription beteiligt ist (Li et al. 2008).

Ob diese long-range- Interaktionen auf trans- oder cis- Basis stattfindet ist bisher jedoch noch nicht bekannt (Li et al. 2008).

1.4.3.2 SL-STRUKTUR 2 (SL2)

Wie SL1 ist auch SL2 (Abb.5) eine in allen bisher bekannten Coronaviren eine hochkonservierte SL-Struktur (Chen & Olsthoorn 2010).

Durch bisherige Untersuchungen in MHV (mouse hepatitis virus) konnte bereits gezeigt werden, dass SL2 (Abb.5) vermutlich eine wichtige Rolle bei der Coronavirusreplikation spielt und höchstwahrscheinlich auch bei der Entstehung von sgRNA´s beteiligt ist (Liu et al. 2009).

1.4.3.3 SL-STRUKTUR 3 (SL3)

Bei der SL-Struktur SL3 (Abb.5) handelt es sich um eine nur bei wenigen Coronaviren vorkommende RNA-Sekundärstruktur (Madhugiri et al. 2014).

Bei BCoV und Arteriviridae befindet sich die TRS-L-Kernsequenz in der Schleifenregion der SL-Struktur 3 (van den Born et al. 2005; van den Born 2004).

1.4.3.4 SL-STRUKTUR 4 (SL4)

Für SL4 (Abb.5) wurde vorgeschlagen, dass es sich um eine Haarnadel-Struktur handelt, welche sich gegebenenfalls in zwei Unterstrukturen, SL4a und SL4b (nicht dargestellt), aufteilen lässt (Yang et al. 2011). SL4a ist dabei der doppelsträngige untere Teil der Stammstruktur und SL4b der doppelsträngige Stamm überhalb der Stammschleife.

Innerhalb der SL4 Struktur (Abb.5) befindet sich ein kurzer ORF. Dieser wird aufgrund seiner Lage upstream (engl. upstream = stromaufwärts) des ORF1a als uORF bezeichnet (Wu et al. 2014). Durch verschiedene Untersuchungen an MHV wird angenommen, dass der uORF die Translation des ORF1a hemmt (Yang et al. 2011).

Trotz der starken Konservierung des SL4 (Abb.5) toleriert dieses stärkere Mutationen und Deletionen in SL4a und SL4b relativ gut. Bei vollständiger Deletion von SL4 (Abb.5) ist das Virus jedoch nicht lebensfähig (Yang et al. 2011).

Dies lässt möglicherweise auf eine spacer (engl. spacer = Platzhalter) Funktion von SL4 (Abb.5) schließen, welche SL1, SL2 (Abb.5) und die TRS-L-Sequenz im erforderlichen Abstand zu anderen Strukturen/Sequenzen hält (Yang et al. 2011).

Auch bei SL4 (Abb.5) wurden strikte Konservierungen bei allen Coronaviren vorhergesagt (Chen & Olsthoorn 2010; Raman & Brian 2005).

1.4.3.5 SL-STRUKTUR 5 (SL5)

Die Existenz der SL-Struktur 5 (SL5) (Abb.5) wird ebenfalls in mehreren Gattungen der Coronavirinae vermutet. Bei Alpha -Coronaviren und Beta -Coronaviren befindet sich der Beginn des ORF1a im SL5.(Chen & Olsthoorn 2010)

Vor allem in Alpha -Coronaviren ist eine Konservierung der Sequenz erkennbar. So finden sich in SL5 drei Haarnadel-Strukturen - SL5a, SL5b, SL5c (Abb.5) - welche jeweils die gleiche konservierte Stammschleifen-Sequenz - 5′-UUYCGU-3′ - (Abb.5) besitzen.(Chen & Olsthoorn 2010; Madhugiri et al. 2014)

1.5 ZIELSETZUNG

Das in dieser Bachelorarbeit angestrebte Ziel ist die Charakterisierung von putativen cis- aktiven RNA-Elementen (SL-Strukturen SL4 und SL5) in der 5′-nichttranslatierten Region des RNA-Genoms des humanen Coronavirus 229E (HCoV-229E), welche zuvor durch RNA structure probing ermittelt wurden. Dadurch soll ersichtlich werden, ob sich die jeweilige Struktur oder sogar Sequenz auf den viralen Replikationszyklus auswirken. SL4-Virusmutanten, bei welchen durch Einführung von Punktmutationen in der SL4 Struktur die Stammschleife destabilisiert bzw. durch kompensatorische Mutationen wieder hergestellt werden soll, werden im Vergleich zu HCoV-229E wt untersucht. Eventuelle funktionale Effekte auf den viralen Replikationszyklus von lebensfähigen SL4-Mutanten im Vergleich zum wt werden durch die Bestimmung einer Wachstumskinetik der jeweiligen Mutanten untersucht. Durch Sequenzanalyse des 5'- und 3'- Bereichs dieser Mutanten in einer frühen Passage (p0) im Vergleich zu Passage 6 sollen Rückschlüsse auf die Stabilität der Mutation (oder Reversion zum Wildtyp) und auf mögliche RNA-RNA- oder RNA-Protein Interaktionen ermöglicht werden, die sich aus dem Nachweis möglicher „kompensatorischer“ Mutationen in anderen Genombereichen ergeben könnten.

Weiterhin werden für die detaillierte Charakterisierung der SL-Struktur 5 durch Rekombination verschiedene SL5-Punktmutationen und Deletionen in das rekombinierte vHCoV-inf-1-Genom eingeführt (Thiel et al. 2001).

2 MATERIAL UND METHODEN:

2.1 MEDIEN UND LÖSUNGEN

2.1.1 ZELLKULTURMEDIUM

DMEM versetzt mit

10 % [v/v] Fötales Kälberserum

1x NEAA (non essential amino acids)

10.000 Units/ml Penecillin

10,000 µg/ml Streptomycin

2.1.2 TAE-PUFFER (50X)

2,0 M Tris-Azetat

0,95 M Eisessig

100 mM Na2EDTA*2H2O in ddH2O

2.1.3 LB-MEDIUM

1 % [w/v] Trypton

0,5 % [w/v] Hefeextrakt

1 % [w/v] NaCl in ddH2O

2.1.3.1 LB-MEDIUM + AGAR

1 % [w/v] Trypton

0,5 % [w/v] Hefeextrakt

1 % [w/v] NaCl

1,5 % [w/v] Agar in ddH2O

2.1.3.2 LB-MEDIUM + AMPICILLIN

LB-Medium

100 µg/ml Ampicillin in ddH2O

(Zugabe des Ampicillins nach dem Autoklavieren)

2.1.3.3 LB-MEDIUM + AMPICILLIN + AGAR

LB-Medium

1,5 % [w/v] Agar

100 µg/ml Ampicillin in ddH2O

(Zugabe des Ampicillins erst nach dem Abkühlen, unmittelbar vor dem Gießen der Platten)

2.1.4 TE-PUFFER

10 mM TRIS pH8

1 mM EDTA pH8 in ddH2O

2.1.4.1 TE-PUFFER + SACCHAROSE

10 mM TRIS pH8

1 mM EDTA

36 % [w/v] Saccharose in ddH2O

2.1.5 DNASE-PUFFER (10X)

400 mM TRIS pH8

100 mM MgSO4

10 mM CaCl2 in ddH2O

2.1.6 PROTEINASE-K-PUFFER (2X)

0,1 M Tris-HCl pH7,5

0,2 M NaCl

5 mM EDTA

0,2 % [w/v] SDS in ddH2O

2.1.7 MINIPRÄPARATION

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 ZELLKULTUR

2.2.1 ZELLEN SPLITTEN

Alle Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 inkubiert. Nachdem die Zellen 80 - 90% Konfluenz erreicht hatten, wurde das Zellmedium abgenommen, die Zellen einmal mit PBS gewaschen und durch Inkubation mit 1x Trypsin (in PBS verdünnt) vom Boden abgelöst. Nach einer Inkubationszeit von 5 min. wurde die Reaktion durch Zugabe von Medium gestoppt, die Zellen durch wiederholtes Pipettieren vereinzelt und anschließend in der gewünschten Zellkonzentration ausgesät.

2.2.2 ZELLEN ZÄHLEN

Die Zellen wurden mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer gezählt.

2.2.3.VERWENDETE ZELLLINIEN

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2 Ü bersichtüber die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien.

2.3 VIRUS

2.3.1 HCOV-229E

2.3.1.1 TRANSFEKTION

Für die Transfektion von HCoV-229E-RNA wurde die humane Hepatomzelllinie Huh7 verwendet. Diese wurden zu 0,3x106 Zellen/Napf auf 6-Lochplatten ausgesät. Die Zellen wurden bei einer Temperatur von 37°C und in einer Atmosphäre mit 5 % CO2 für 24 Stunden bis zu einer 90%iger Konfluenz inkubiert.

Als Transfektionsmittel wurde Trans IT® verwendet. Hierbei handelt es sich um ein Zweikomponenten-Transfektionssystem, welches aus Trans IT®-mRNA-Reagenz und einem Boost-Reagenz besteht.

Das Zellkulturmedium wurde durch 2,5ml frisches Zellkulturmedium ausgetauscht. Anschließend wurden für jeden Ansatz 250µl Opti-MEM® (Reduced Serum Medium) zu 1,25µg Volllängen-HCoV-229E-RNA und 0,75µg HCoV-229E-N-RNA gegeben. Nach der Zugabe von 3µl Boost-Reagenz wurden 5µl Trans IT®-Reagenz zugegeben, der Ansatz 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend auf die Zellen getropft. Die transfizierten Zellen wurden 72 Stunden bei 33°C und 5% CO2 inkubiert.

2.3.1.2 TCID50

Huh7-Zellen wurden, wie in Kapitel 2.1 beschrieben, trypsiniert, jeweils 100µl der Zellsuspension wurden in die Näpfe einer 96-Lochmikrotiterplatte ausgesät, und die Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C und einer Atmosphäre von 5% CO2 bis zu 100%iger Konfluenz inkubiert.

Die Zellen wurden mit je 100µl HCoV-229E Virussuspension einer logarithmischen Verdünnungsreihe (10-1 - 10-8 ) infiziert (12 Näpfe/Verdünnungsstufe) und 5 Tage bei 33°C und 5 % CO2 inkubiert. Der zytopathische Effekt wurde mit Hilfe eines Lichtmikroskops ausgewertet und die TCID50 (tissue culture infective dose 50%) wurde anhand der Titerberechnung nach Reed und Muench mit folgender Formel berechnet:

TCID50/ml = 10log Verdünnung >50 % - (Pxlog h)

wobei P = % der infizierten Näpfe > 50% -50% / % der infizierten Näpfe >50% -% der infizierten Näpfe <50% und h = Verdünnungsfaktor ist.

2.3.1.3 PLAQUE-TEST

Huh7-Zellen wurden in einer Verdünnungsreihe von 10-1 -10-6 mit dem Überstand des p0- Ansatzes infiziert und 1 Stunde bei 33°C inkubiert. Der virushaltige Überstand wurde abgenommen und anschließend wurden pro Napf 2ml 1xMEM (mit 10% FCS, 1,2% Avicel) auf die Zellen gegeben.

Nach drei Tagen wurden die Näpfe 2x mit 1xPBS gewaschen und die Zellen mit 0,1% Kristallviolett angefärbt.

2.3.1.4 PASSAGIEREN VON HCOV-229E

Um mit einem einheitlichen Titer das Passagieren beginnen zu können, wurden zunächst die TCID50 der Passage 0 (P0) ausgewertet und der Titer berechnet (Kapitel 2.3.1.2). Anschließend wurden Huh7-Zellen mit einer MOI (multiplicity of infection) von 0,01 TCID50/Zelle infiziert.

Für die ersten 5 Passagen wurden Huh7-Zellen mit je 200µl Zellkulturüberstand der jeweils vorherigen Passage mit 800 µl Zellkulturmedium gemischt und für die Infektion von 106 Zellen verwendet. Nach jeweils 48 Stunden bei 33°C und einer Atmosphäre von 5% CO2 wurde der Zellkulturüberstand abgenommen.

2.3.2 ARBEITEN MIT VACCINIAVIREN

2.3.2.1 VIRUSSUFREINIGUNG

Das Zellpellet von infizierten BHK-Zellen aus 4x 175cm2 -Zellkulturflaschen wurde in 3ml TE- Puffer (Kapitel 2.1.4) resuspendiert und anschließend auf 4 Magnalyser-beads-Röhrchen verteilt. Der Zellaufschluss erfolgte in einem MagNA Lyser® (Geschwindigkeit: 5000; Zeit: 20 Sek.). Anschließend wurde der Zelldebris für 5min. bei 960xg pelletiert. Der Überstand wurde in ein neues Reagenzgefäß überführt, 400µl 1xTrypsin zugegeben und für 30min. bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden nun bei 1000xg 2min. zentrifugiert und der Überstand langsam auf 25ml TE-Puffer + Saccharose (Kapitel 2.1.4.1) überschichtet. Die Vacciniaviren wurden eine 1 Stunde 20min. bei 27000xg und 4°C durch dieses Saccharose-Kissen pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet wurde in 300µl TE-Puffer (Kapitel 2.1.4) resuspendiert und in Reaktionsgefäße überführt. 40µl 10xDNase Puffer (Kapitel 2.1.5) wurden zugegeben sowie 2µl DNase zur enzymatischen Spaltung der zellulären DNA, da die virale DNA durch das Nukleokapsid geschützt ist. Die Proben wurden anschließend bei 37°C 20min. inkubiert. Hiernach wurde EDTA (Endkonzentration von 20mM) zugegeben und die Proben auf 65°C 10min. erhitzt, um die DNase zu inaktivieren. Anschließend wurde ein Volumen 2xProteinase K Puffer (Kapitel 2.1.6) beigegeben und nach der Zugabe von 5µl Proteinase K die Proben 2 Stunden bei 55°C inkubiert.

2.3.2.2 DNA-TRANFEKTION VON VACCINIA-INFIZIERTEN ZELLEN

Das für die Rekombination verwendete Vacciniavirus v5‘-GPT wurde von der AG Ziebuhr zur Verfügung gestellt und enthielt eine komplette cDNA-Kopie des HCoV-229E Genoms, bei dem jedoch die ersten 1000nt durch das gpt -Gen ersetzt worden waren.

CV1-Zellen wurden mit v5‘-GPT mit einer MOI von 1 TCID50/Zelle in 500µl Medium eine Stunde bei 37°C infiziert. Währenddessen wurde der Transfektionsansatz vorbereitet. Hierfür wurden 4µg mutagenisierte Plasmid-DNA mit 250µl Optimem gemischt und 10µl Lipofectamine2000 zu ebenfalls 250µl Optimem gegeben. Nach einer Inkubation von 5min bei Raumtemperatur wurden die beiden Ansätze vereint und weitere 20min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Stunde Inkubation wurde der Infektionsüberstand abgenommen und durch den Transfektionsansatz, der auf die infizierten Zellen getropft wurde, ersetzt. Nach 5 Stunden Inkubation bei 37°C wurde der Überstand durch 1ml frisches Zellkulturmedium ersetzt und die Zellen 24 bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in das Medium geschabt. Dieser sogenannte „Transfektionsstock“ wurde dann für die folgende Negativselektion verwendet.

2.3.2.3 gpt-NEGATIVSELEKTION

Das Enzym Guanine-Phosphoribosyltransferase (gpt aus E.coli) setzt 6TG in 6-Thioguanine- Monophosphat (TGMP) um. TGMP ist zytotoxisch, da es anstelle von GMP in Zelluläre RNA und DNA eingebaut wird. Säugerzellen kodieren das Enzym HGPRT, das ebenfalls Guanin, aber auch 6-TG (und Hypoxanthin) phosphorylieren kann! Für die Negativselektion wurden daher D980R-Zellen verwendet, die hprt -negativ sind.

Um einzelne rekombinierte Virusklone zu erhalten, wurden D980R-Zellen unter Selektion mit 6-TG (1µg/ml) mit verschiedenen Verdünnungen des „Transfektionsstocks“ (10-1 bis 10-3 ) über Nacht mit dem Transfektionsstock (Kapitel 2.3.2.2) bei 37°C infiziert. Anschließend wurde ein Agarose overlay (eng. overlay = Auflage) auf die bereits infizierten Zellen gegeben (1x MEM, 1% w/v low melting point Agarose, 10% FCS, 1µg/ml 6TG) und die Zellen wieder 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Mit Hilfe eines Lichtmikroskops wurden einzelne Plaque identifiziert, mit einer Pipettenspitze abkratzt und erneut frische D980R-Zellen mit den isolierten Virusklonen unter Selektionsdruck infiziert. Dies wurde insgesamt viermal wiederholt, bevor dann CV1- Zellen mit den isolierten Virusklonen infiziert wurden. Die infizierten Zellen wurden steril im Medium abgeschabt, die Hälfte wurde als Virusstock bei -20°C gelagert, und aus der anderen Hälfte wurde DNA isoliert, wie in Kapitel 2.3.2.1 beschrieben. Mit Hilfe von PCR wurde überprüft ob der angestrebte Austausch des gpt- Gens mit der gewünschten Sequenz (durch homologe Rekombination) erfolgt war.

2.4 RNA

2.4.1 RNA-ISOLATION

Das Zellkulturmedium wurde abgenommen, die Zellen in 1ml PBS abgekratzt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Die Zellen wurden 10 Minuten bei 200xg pelletiert und der Überstand verworfen. Anschließend wurde das Zellpellet in 0,5ml TRIzol® resuspendiert und die Gesamt-RNA nach Herstellerangaben isoliert. Die RNA wurde in 20µl Nuklease-freiem Wasser gelöst.

2.4.2 QUANTIFIZIERUNG DER RNA-KONZENTRATION

Die Quantifizierung der RNA-Konzentration erfolgte durch eine OD-Messung bei einer Wellenlänge von 260nm. Als Umrechnungsfaktor wurde 1 OD = 40µg/ml RNA verwendet.

2.4.3 REVERSE TRANSKRIPTION

Bei der reversen Transkription wird RNA durch das Enzym reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben.

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