Die Entwicklung superhochauflösender Fluoreszenzmikroskopie. Ein Meilenstein in der Molekülforschung

Inhaltsangabe

1. Einleitung

2. Auf der Suche nach den Bausteinen des Lebens

3. Die STED-Mikroskopie
3.1. Die Lichtmikroskopie
3.2. Die Fluoreszenz
3.3. Das Prinzip
3.4. Die Anwendungsmöglichkeiten

4. Zusammenfassung

5. Ausblick

6. Bibliografie

1. Einleitung

Im Jahr 2014 hat Stefan W. Hell zusammen mit Eric Betzig und William E. Moerner den Nobelpreis für Chemie aufgrund der Entwicklung superhochauflösender Fluoreszenzmikroskopie bekommen.^[1] In der vorliegenden Hausarbeit soll nun die von Hell entwickelte STED-Mikroskopie physikalisch beschrieben und erläutert werden, weshalb das Untersuchungsverfahren für Molekülstrukturen in der Forschung so herausragend ist, dass es mit dem Nobelpreis bedacht wurde.

Zuerst soll hierbei ein kleiner wissenschaftshistorischer Abriss stehen, der aufzeigt, wie lange es bereits Bestrebungen im Verstehen lebensweltlicher Prozesse gibt. Danach soll sich ausgiebig mit der STED-Mikroskopie beschäftigt werden. Dazu wird anfangs erklärt, wie die Lichtmikroskopie funktioniert. Hierbei wird auch die Abbe’sche Beugungsgrenze hergeleitet und diskutiert, weswegen diese die wesentliche Einschränkung der Lichtmikros­kopie ist. Außerdem sollen die Vorteile gegenüber der Elektronenmikroskopie aufgezeigt werden. Anschließend wird genauer auf die Wechselwirkung von Licht mit Materie eingegangen und die Fluoreszenz besonders herausgearbeitet. Im Anschluss daran soll mit der theoretischen Vorarbeit die STED-Mikroskopie insbesondere aus physikalischer Sicht dargestellt werden. Zuletzt werden noch Anwendungen dieser Methode angerissen, um die Erfolge des STED-Verfahrens zu verdeutlichen.

Am Ende dieser Hausarbeit werden dann die wichtigsten Erkenntnisse aus den obigen Betrachtungen zusammengetragen und die Frage beantwortet, weshalb die Entwicklung der STED-Mikroskopie ein großer Meilenstein in der Molekülforschung ist. Zudem gewährt ein Ausblick Einsicht in weitere Themenfelder, die in der Ausarbeitung nur skizziert werden konnten.

2. Auf der Suche nach den Bausteinen des Lebens

Bereits in der Antike versuchte man Erklärungen darüber zu finden, wie die Welt entstanden ist und was sie zusammenhält. Um 700 v. Chr. schreibt der griechische Dichter Hesiod in seiner Theogonie, dass die Erde eine Göttin und aus ihr der Himmel entstanden sei.^[2] Die Vorstellung, dass Götter die Welt erschaffen haben, findet sich auch schon wesentlich früher in einem babylonischen Lehrgedicht um 2.000 v. Chr.^[3] Daraus wird ersichtlich, dass man sich bereits in der Antike intensiv der Frage nach dem „großen Ganzen“ widmete. Zur Erklärung wurden meist mythologische Ansätze bevorzugt, bevor der griechische Philosoph Heraklit Ende des 6. Jahrhunderts v. Chr. einen anderen Vorstoß wagte. Ihm zufolge sind nicht mehr die Götter die alleinigen Schöpfer, sondern er postuliert den Logos als übergeordnetes Prinzip von allem.^[4] Im 5. Jahrhundert v. Chr. greift dann der Naturforscher Empedokles zentrale Theorien seiner Vorgänger auf und nennt vier Grundelemente der Welt, die er mit Göttern gleichsetzt. Ferner weist er diesen noch bis heute gültige Eigenschaften zu.^[5] Noch im selben Jahrhundert generiert Leukipp eine Theorie, wonach alles aus unteilbaren Stoffen, den Atomen, bestünde. Diese entwickelt Demokrit weiter und legt damit den Grundstein zur modernen Atomphysik.^[6] Im 4. Jahrhundert v. Chr. entwirft dann der griechische Philosoph Platon ein System, in dem unterschiedliche Kombinationen von Dreiecken das Grundgerüst von Stoffen seien. Zwischen den einzelnen Basisdreiecken gebe es Zusammenhänge, weswegen Umwandlungen untereinander möglich seien. Er ist damit ein gedanklicher Wegbereiter für die Existenz von Elementarteilchen.^[7]

Doch nicht nur im antiken Griechenland widmet man sich der Erforschung der Natur, sondern ebenso in Rom gibt es Bestrebungen die Weltordnung zu verstehen. Im 1. Jahrhundert v. Chr. schreibt Lukrez sein Lehrgedicht De rerum natura, in dem er die wichtigsten antiken Erkenntnisse über die Natur der Dinge vorträgt und verschiedene physikalische Phänomene erklärt. So seien Lichtatome kleiner als Wasseratome, da die ersten durch ein Horn hindurchgingen.^[8] Ferner findet sich in dem Werk die Erkenntnis wieder, dass Farbe kein Element sei, sondern eine Eigenschaft eines Körpers, wenn er mit Licht getroffen und dieses verschiedenartig zurückgeworfen wird.^[9] Damit wird ersichtlich, dass grundlegende Eigenschaften wie Emission und Absorption bereits in der Antike bekannt waren und bis heute ähnlich beschrieben werden. Ähnliche Strömungen können auch in der mittelalterlichen islamischen Wissenschaft und in China verortet werden.^[10]

Nach dem Ende des Römischen Reiches im 3. Jahrhundert n. Chr. ist der islamische Raum vor allem das Zentrum der Wissenschaft, solange bis das Abendland in der Neuzeit wieder erstarkt. Im 16. und 17. Jahrhundert machen viele Wissenschaftler auf Grundlage antiker Annahmen Entdeckungen und entwickeln Lehrsätze, die bis heute Gültigkeit haben. Herausragende Persönlichkeiten wie Galilei oder Newton bringen in dieser Zeit Experimente und Theorien hervor, die grundlegend auf dem Gebiet der Mechanik sind. Damit war also ein weiterer Grundstein gelegt, die Welt besser zu verstehen.^[11] Doch auch die Erforschung der „Bausteine des Lebens“ und der seit der Antike währende Streit über die Existenz von Atomen werden zunehmend lebhafter betrieben.^[12] Im 20. Jahrhundert wird die Suche nach den kleinsten Teilchen, die Demokrit und Platon bereits in der Antike postulierten, immer intensiver betrieben und führt zu den wichtigsten Ergebnissen in der Atomtheorie.^[13] Schon um 1900 kann von Atom- und Elementarteilchenphysikern gezeigt werden, dass alle Materie aus Atomen besteht. Nur 30 Jahre später erkennt man, dass Protonen, Elektronen und Neutronen elementare Bestandteile von Materie sind. Um 1975 kann mit den vielen Erkenntnissen aus der Wissenschaft dann das noch heute gültige „Standard-Modell“ der Elementarteilchen entwickelt werden.^[14]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3. Die STED-Mikroskopie

3.1. Die Lichtmikroskopie

Ein wesentlicher Aspekt bei der Verifizierung von Theorien war und ist die Mikroskopie, die zunehmend kleinere Strukturen für das menschliche Auge sichtbar machen kann und damit ein Eindruck davon gibt, wie Zellen und damit auch der menschliche Organismus funktionieren. Insbesondere die Lichtmikroskopie ist dabei das Mittel der Wahl, weil diese bei lebendigen, sich beweglichen Organismen die besten Ergebnisse liefert.^[15]

Zu den Hauptbestandteilen eines Lichtmikroskops gehören mindestens zwei Linsen, ein Objektiv Ob, das dem Gegenstand G zugewandt ist, und ein Okular Ok, wodurch das Auge des Betrachters blickt. Durch das Objektiv wird ein Zwischenbild B1 erzeugt, das ein vergrößertes reelles Bild des betrachteten Objekts ist. Der Gegenstand, der mit dem Okular als Lupe angeschaut wird, befindet sich demgemäß außerhalb der Objektivbrennweite. Bei einem völlig entspannten Auge ist das Zwischenbild in der Brennebene des Okulars zu verorten, das virtuelle Bild B2 des Zwischenbildes befindet sich dann im Unendlichen. Dahingehend ist die Vergrößerung des Mikroskops das Produkt aus der Lateralvergrößerung des Objektivs

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

und der Winkelvergrößerung des Okulars .

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Hierbei ist die deutliche Sehweite des Menschen mit einem Wert von 25 Zentimetern und der Abstand der Brennebenen von Okular und Objektiv. Dieser ist aufgrund der kurzen Brennweiten annähernd so groß wie die Tubuslänge , die als Abstand beider Linsen definiert ist. Damit ergibt sich folgende Mikroskop-Vergrößerung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten^[16]

Ein Lichtmikroskop kann allerdings nicht unendlich vergrößern, weil die Auflösung an irgendeinem Punkt so schlecht wird, dass zwei Objekte nicht mehr klar voneinander trennbar dargestellt werden können. Am einfachsten lässt sich dies erklären, wenn man annimmt, dass eine gitterartige Probe mit kohärentem Licht bestrahlt wird. Hier greift die Wellenoptik, die besagt, dass Licht sowohl direkt in Verlängerung des Beleuchtungsstrahls gemessen, als auch in gleichmäßigen Abständen auf beiden Seiten des Strahles bestimmt werden kann. Den geradeaus gemessenen Strahl bezeichnet man als „Strahl nullter Ordnung“, die folgenden Strahlen sind erster, zweiter etc. Ordnung. In einem Winkel ξ zur Achse findet sich die erste Ordnung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hierbei sind λ die Wellenlänge des kohärenten Lichts und d der Abstand der Gitterlinien.^[17] Daraus folgt, dass der Beugungswinkel ξ umso größer wird, desto kleiner der Abstand zwischen den Objektpunkten ist, wenn sich die Wellenlänge nicht ändert. Angewendet auf das Lichtmikroskop heißt das, dass der durch die Objektivlinse festgelegte maximale Winkel den Minimalabstand dmin bestimmt. Dessen Kehrwert ergibt das geometrische Auflösungsvermögen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten^[18]

Das Objektiv sammelt das Licht über den Öffnungswinkel, der für Berechnungen und Typenangaben gebraucht wird. Demzufolge ist der Winkel zwischen der optischen Achse und dem Objektiv gerade der halbe Öffnungswinkel α. Zwischen Präparat und Objektiv führt man meist eine Immersionsflüssigkeit mit dem Brechungsindex n ein, um den Öffnungswinkel zu vergrößern. Das Produkt aus Brechungsindex und dem Sinus des halben Öffnungswinkels ergibt die Numerische Apertur:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Hieraus wird ersichtlich, dass das Gittermuster bei Betrachtung des Zwischenbildes und des Beugungsbildes, während der Öffnungswinkel verändert wird, im Zwischenbild erst sichtbar wird, wenn neben dem ungebeugten Licht mindestens die erste Ordnung einbegriffen wird. Somit ergibt sich als Grenze für die Auflösung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Diese Gesetzmäßigkeit gilt für senkrecht auftreffendes Licht. Hierbei tragen drei Ordnungen zur Bildentstehung bei, da die Lichtstrahlen, die schon in dem Winkel zur ersten Ordnung verwendet werden, auch in der zweiten Ordnung vom Objektiv eingesammelt werden. Ernst Abbe hat 1873 dagegen herausgefunden, dass bereits zwei Ordnungen ausreichen, um ein gut aufgelöstes Bild entstehen zu lassen. Die Beleuchtung muss also lediglich die gleiche Apertur wie das Objektiv haben, um die Auflösung zu verbessern, was gerade der Hälfte der Wellenlänge entspricht. So ergibt sich das folgende Abbe-Limit für die maximal zu erreichende Auflösung in einem Lichtmikroskop:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten^[19]

Damit scheint die Lichtmikroskopie klar begrenzt zu sein und trotzdem bietet sie gegenüber der Elektronenmikroskopie klare Vorteile: Zum einen ist es mit Elektronenmikroskopen unmöglich, das Innere von Geweben und Zellen zu untersuchen, zum anderen interessieren die Wissenschaftler oft nur gewisse Bestandteile eines Gegenstands, die lediglich in der Lichtmikroskopie ohne großen Aufwand einzeln hervorgehoben werden können.^[20] Da diese Hervorhebung in den meisten Fällen durch Fluoreszenz vorgenommen wird, soll diese nun diskutiert werden.

3.2. Die Fluoreszenz

Es gibt drei verschiedene Arten wie Licht mit Materie wechselwirken kann: Eine Möglichkeit ist die Absorption, bei der ein Lichtquant von einem Atom oder Molekül aufgenommen wird. Der Absorber wird angeregt, da die Elektronenhülle Energie in Form des Lichtquants zugeführt wurde. Durch die quantisierte Energieaufnahme geht ein Elektron des Grundzustandes in einen energetisch höheren angeregten Zustand über. Bei der spontanen Emission gibt das angeregte Molekül bzw. Atom seine Energie in Form eines Lichtquants wieder ab. Das Elektron in der Hülle geht vom angeregten Zustand in den Grundzustand über. Dieser Prozess läuft vollkommen zufällig ab und ist nicht vorhersagbar. Dagegen wird bei der stimulierten Emission die Abregung vom angeregten Zustand in den Grundzustand gezielt gesteuert. Hierbei wird ein zusätzliches Photon eingebracht, das mit dem Elektron im angeregten Zustand wechselwirken und dieses in den Grundzustand abregen kann. Dabei wird neben dem auslösenden Lichtquant ein zusätzliches Photon mit den gleichen Eigenschaften emittiert, wodurch das Licht verstärkt wird.^[21]

Aus den obigen Betrachtungen erkennt man, dass ein Atom bzw. Molekül nach erfolgter Anregung vom angeregten Zustand Ei spontan durch Aussenden eines Photons der Energie in einen tieferen Zustand Ej übergeht, der aber nicht zwangsläufig der Grundzustand sein muss. Bei diesem Übergang wird dann Fluoreszenzlicht ausgesandt.^[22] Nach Abschalten des erregenden Lichts verschwindet die Fluoreszenz sofort. Allerdings besitzen nur bestimmte Stoffe, sogenannte Fluorophore, die Fähigkeit Licht ausgewählter Spektralgebiete zu absorbieren und danach Licht einer Wellenlänge zu emittieren. Für die betreffende Substanz ist das Fluoreszenzlicht charakteristisch, egal mit Licht welcher Wellenlänge dieses angeregt wurde.^[23] Fluoreszenz kann aber nur angeregt werden, wenn das absorbierte Licht höchstens genauso kurzwellig wie das zu emittierende ist.^[24]

Wie oben beschrieben, fällt das angeregte Atom bzw. Molekül nach erfolgter Anregung in den tiefsten Schwingungszustand, wobei die überschüssige Energie als Wärme abgegeben wird. Weil bereits Energie in Form von Wärme abgegeben wurde, haben die Photonen der Emission eine geringere Energie und damit eine längere Wellenlänge als die Photonen der Absorption. Prinzipiell ist der Vorgang solange wiederholbar, wie passendes Anregungslicht vorhanden ist. Da jedoch die Hüllenelektronen ebenfalls für chemische Reaktionen verantwortlich sind, wird das Atom bzw. Molekül insbesondere für Zerfallsreaktionen anfällig. Der Prozess ist also solange machbar, wie die Substanz intakt ist.^[25] Trotz dieser Einschränkung eignet sich die Fluoreszenz gut, um Teile von Atomen bzw. Molekülen für eine gewisse Zeit hervorzuheben, um sie eingehend zu untersuchen. Diesen Sachverhalt erkannte auch Hell, weswegen er die Fluoreszenzmikroskopie für das STED-Verfahren nutzt.

3.3. Das Prinzip

Die Auflösung in der Lichtmikroskopie ist nach Ernst Abbe klar begrenzt auf die Hälfte der Wellenlänge des Emissionslichts. Dennoch konnte die Einschränkung mit der Einführung der Höchstauflösungs-Mikroskopie überwunden werden. Neben dem noch zu erläuternden STED-Verfahren, schafft es beispielsweise die structured illumination micros­copy (SIM) die Auflösung um den Faktor 2 zu steigern, indem ein feines Gitter auf die Probe projiziert wird. Daneben gelingt eine Umgehung der Abbe’schen Beugungsgrenze mithilfe der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie, bei der die Auflösung durch mathematische Methoden sogar um den Faktor 10 verbessert wird.^[26]

Bis 1994 glaubte man, dass das Auflösungsvermögen auf 200 bis 300 Nanometer begrenzt sei. Doch noch im selben Jahr führen Hell und Wichmann die Methode der stimulated emission depletion (STED) ein, um die scheinbare Begrenzung zu überwinden. Mithilfe dieser Methode eröffneten sich neue Möglichkeiten in der Erforschung der Struktur und Funktion kleinster Moleküle.^[27] Im Gegensatz zu herkömmlichen Mikroskopen mit konfokalen Linsen, die wegen der erheblich größeren Länge als Breite nicht unter 500 Nanometer auflösen können, bedarf es Linsen die mit einem zuverlässigen Winkel von 4π fokussieren. Aus diesem Grund entwickelte Hell ein System zweier gegenüberliegender Linsen, um den Fokussierwinkel zu vergrößern und eine breitere Wellenfront zu synthetisieren. Damit konnte die axiale Auflösung auf 200 Nanometer verbessert werden.^[28]

[...]

^[1] Vgl. Meixner 2015, 1797.

^[2] Vgl. Hes. Theog. 116-128.

^[3] Vgl. Welsch 2013, 32f.

^[4] Vgl. Jaeger 2015, 24f.

^[5] Vgl. Welsch 2013, 33.

^[6] Vgl. Bleck-Neuhaus 2013, 1; 19.

^[7] Vgl. Welsch 2013, 34-36.

^[8] Vgl. Lucr. 2.388-390.

^[9] Vgl. Lucr. 2.757-800.

^[10] Vgl. Jaeger 2015, 51-59.

^[11] Vgl. Welsch 2013, 50-58.

^[12] Vgl. Bleck-Neuhaus 2013, 2.

^[13] Vgl. Welsch 2013, 98.

^[14] Vgl. Bleck-Neuhaus 2013, 19f.

^[15] Hell 2015, 8168 zeigt auf, dass die Lichtmikroskopie zu 80 Prozent bei Forschungen eingesetzt wird.

^[16] Vgl. Paus 2007, 787f.

^[17] Vgl. Borlinghaus 2016, 7.

^[18] Vgl. Paus 2007, 789.

^[19] Vgl. Borlinghaus 2016, 8-10.

^[20] Vgl. Hell 2015, 8167f.

^[21] Vgl. Borlinghaus 2016, 17f.

^[22] Vgl. Demtröder 2010, 244.

^[23] Vgl. Stuart/Klages 2015, 248f.

^[24] Vgl. Meschede 2015, 686.

^[25] Vgl. Borlinghaus 2016, 18.

^[26] Vgl. Eggert/Reimer 2015, 49.

^[27] Vgl. Bianchini 2015, 143.

^[28] Vgl. Hell 2003, 1348.