In Rahmen dieser Diplomarbeit konnte gezeigt werden, dass MSP119, das als potentieller Impfstoffkandidat für ein Malaria-Vakzin betrachtet wird, erfolgreich in Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana exprimiert werden kann. Es wurden Expressionsvektoren generiert, die die transiente Expression der vier homologen MSP119-Varianten 3D7, FUP, WELLCOME und TYPE2 sowohl einzeln, als auch als N-, sowie C-terminale Fusionen an DsRed, mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Systems, in Pflanzen ermöglichten. Die Gene der vier Isolate waren bei ihrem in silico Design unterschiedlich an die Codon-Präferenz von Tabak angepasst worden. Die Resultate der immunologischen Experimente, die mit Hilfe des MSP119-spezifischen mAB 5.2 durchgeführt wurden, zeigten auf, dass sich alle Varianten gut in Pflanzen exprimieren ließen. Die im Fall von TYPE2 gewählte Codon-Usage führte in allen Varianten zu der höchsten Akkumulation. Die C-terminalen Fusionen zeigten generell im direkten Vergleich mit ihren N-terminalen Gegenstücken eine um den Faktor zwei höhere Akkumulation in Tabakzellen. Dies gilt es aber in zukünftigen Versuchen zu verifizieren.
Das gereinigte MSP119_3D7-DsRed zeigte im Verhältnis zu den anderen Fusionsproteinen die wenigsten Degradationsbanden auf. Es fand eine weiterführende Evaluation mit Hilfe des Biacore T100-System statt, indem Interaktionen der MSP119-Varianten mit den MSP119-spezifischen und Konformations-abhängigen mAbs 12.8, 12.10, 5.2, 2F10 und 1E1 nachgewiesen werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass der MSP119-Teil des Fusionsproteins in seiner nativen Struktur vorliegt. In anschließenden Immunisierungsversuchen mit BALB/c-Mäusen, konnten humorale immunantworten gegen MSP119_3D7-DsRed nachgewiesen werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass im transienten Ansatz genügend pflanzliches MSP119 zur Evaluierung produziert wurde, das darüber hinaus sehr wahrscheinlich korrekt gefaltet. Darüber hinaus erwies sich MSP119_3D7-DsRed als immunogen. Hierdurch wurden entscheidende Vorraussetzungen für die weitere Entwicklung eines MSP119-basierten Vakzinkandidaten geschaffen.
Neben der Produktion verschiedener MSP119-Proteine, konnten während dieser Diplomarbeit auch chimäre Varianten der inhibitorischen monoklonalen Antikörper 12.8 und 12.10, die spezifisch gegen MSP119 sind, hergestellt werden. Dazu wurden die murinen variablen Domänen der schweren sowie der leichten Kette der mAbs 12.8 und 12.10 an die konstante Region......
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1.1 Der Lebenszyklus von Plasmodium falciparum
1.2 Blutstadien-Antigene und ihre Bedeutung für die Vakzinentwicklung
1.3 Merozoit-Oberflächen-Protein 1
1.4 MSP119 als Impfstoffkandidat
1.5 Die MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
1.6 DsRed – Das rot-fluoreszierende Protein
1.7 Pflanzen als Expressionssysteme
1.8 Zielsetzung
2 MATERIAL
2.1 Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
2.2 Enzyme, Antikörper und Reaktionkits
2.3 Medien, Lösungen und Puffer
2.4 Geräte, Apparaturen und Zubehör
2.5 Vektoren
2.6 Synthetische Gene
2.7 Synthetische Oligonukleotide (Primer)
2.8 Bakterienstämme und Pflanzen
3 METHODEN
3.1 Molekularbiolgische Methoden
3.1.1 Anzucht von E. coli und Herstellung von Stammkulturen
3.1.2 Hitzeschocktransformation von E.coli
3.1.3 Kultivierung von A. tumefaciens und Herstellung von Stammkulturen
3.1.4 Elektroporation von A. tumefaciens
3.1.5 Plasmidisolation aus E. coli (Minipräparation)
3.1.6 Restriktion von DNA
3.1.7 Analytische und präparative Agarosegelelektrophorese
3.1.7.1 Analytische Agarosegelelektrophorese
3.1.7.2 Präparative Agarosegelelektrophorese
3.1.8 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
3.1.9 Ligation
3.1.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.1.11 Kolonie-PCR rekombinanter Bakterien
3.1.12 Enzymatische DNA-Sequenzierung nach Sanger
3.2 Proteinchemische und immunologische Methoden
3.2.1 Extraktion löslicher Proteine aus Pflanzenmaterial
3.2.2 Hitzefällung des Pflanzenextraktes
3.2.3 Reinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie
3.2.4 Diskontinuierliche SDS-PAGE
3.2.5 Sensitive Coomasssie Blue R-250 Färbung
3.2.6 Western Blot
3.2.7 Korrelative Proteinquantifizierung mittels Fluoreszenzmessung
3.2.8 Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messung (Biacore)
3.2.9 Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)
3.3 Pflanzen
3.3.1 Kultivierung von N. tabacum und N. benthamiana im Gewächshaus
3.3.2 Transiente Expression in N. tabacum und N. benthamiana
3.4 Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed
4 ERGEBNISSE
4.1 Herstellung und Charakterisierung der MSP119-Varianten
4.1.1 Konstruktion der MSP119-Expressionsvektoren
4.1.2 Temperaturstabilität von HEK- und Tabak-produziertem MSP119
4.1.3 Transiente Expression der MSP119-Proteinvarianten in N. tabacum
4.1.4 Reinigung MSP119-Proteinvarianten
4.1.5 Charakterisierung der Fusionsproteine auf dem Biacore T100-System
4.1.6 Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed
4.2 Klonierung und Produktion chimärer Varianten der MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
4.2.1 Konstruktion der Expressionsvektoren für die schwere und leichte Kette der chimären mABs 12.8 und 12.10
4.2.2 Transiente Expression der chimären Antikörper
4.2.3 Reinigung der chimären mAbs 12.8 und 12.10
4.2.4 Charakterisierung der gereinigten chimären Antikörper mAb 12.8 und 12.10 auf dem Biacore T100-System
5 DISKUSSION UND AUSBLICK
5.1 Charakterisierung der MSP119-Proteinvarianten
5.2 Charakterisierung der chimären mAbs 12.8 und 12.10
6 ZUSAMMENFASSUNG
Zielsetzung & Themen
Diese Arbeit zielt darauf ab, vier verschiedene MSP119-Isolate (3D7, FUP, WELLCOME und TYPE2) in Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana transient zu exprimieren, um sie als Impfstoffkandidaten gegen Malaria zu evaluieren. Zusätzlich sollen chimäre Varianten von inhibitorischen monoklonalen Antikörpern (12.8 und 12.10) in Pflanzen produziert und charakterisiert werden, um deren Potenzial für Invasions-Assays zu prüfen.
- Produktion rekombinanter MSP119-Proteinvarianten in pflanzlichen Expressionssystemen
- Klonierung und Herstellung chimärer Maus-Mensch-Antikörper
- Charakterisierung mittels biochemischer und immunologischer Methoden (Biacore, Western Blot, ELISA)
- Immunisierungsstudien in Tiermodellen (BALB/c-Mäuse)
Auszug aus dem Buch
1.1 Der Lebenszyklus von Plasmodium falciparum
Der Lebenszyklus der Malaria-Erreger wird exemplarisch für Plasmodium falciparum in der nachfolgenden Abbildung aufgezeigt.
Wenn eine weibliche Anopheles-Mücke die Haut eines Menschen penetriert, um eine Blutmahlzeit zu sich zu nehmen, injiziert sie eine Mischung aus Speichelflüssigkeit und einem Antikoagulans (McGraw-Hill, 2009). Ist der Moskito mit Plasmodien infiziert, so erfolgt auch die Injektion von beweglichen spindel-förmigen asexuellen Zellen, den Sporozoiten, in den Blutkreislauf (1). Die Sporozoiten wandern zur Leber, in der sie Hepatozyten befallen und durch Invagination der Zellmembran eindringen, wobei die Leberzellen nicht zerstört werden (2). Es kommt zu asexuellen Teilungen des Parasiten. Diese sog. Schizogenie endet nach ungefähr 7 bis 10 Tagen mit der Freisetzung von Vesikeln, die die Merozoiten, eine birnenförmige Zwischenform des Parasiten, enthalten (3).
Zusammenfassung der Kapitel
1 EINLEITUNG: Einführung in die Problematik der Malaria, den Lebenszyklus des Parasiten und die Relevanz von MSP119 sowie pflanzlichen Expressionssystemen für die Vakzinentwicklung.
2 MATERIAL: Auflistung der verwendeten Chemikalien, Enzyme, Antikörper, Medien, Geräte und biologischen Stämme für die experimentelle Arbeit.
3 METHODEN: Detaillierte Beschreibung der molekularbiologischen, proteinchemischen und immunologischen Arbeitsschritte, einschließlich der transienten Expression in Pflanzen.
4 ERGEBNISSE: Darstellung der erfolgreichen Konstruktion der Expressionsvektoren, Reinigung der Proteinvarianten und chimären Antikörper sowie deren Charakterisierung mittels Biacore und Immunisierungsversuchen.
5 DISKUSSION UND AUSBLICK: Interpretation der erzielten Daten hinsichtlich der Reinheit, Stabilität und Immunogenität der produzierten Proteine und Antikörper sowie Vorschläge für Optimierungen.
6 ZUSAMMENFASSUNG: Zusammenfassender Überblick über die erfolgreiche Produktion und Charakterisierung der MSP119-Varianten und chimären Antikörper.
Schlüsselwörter
Plasmodium falciparum, MSP119, Malaria, Impfstoffkandidaten, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, transiente Expression, Agrobacterium tumefaciens, DsRed, chimäre Antikörper, Biacore, Immunisierung, Proteinreinigung, Molecular Farming.
Häufig gestellte Fragen
Was ist das übergeordnete Ziel der Arbeit?
Die Arbeit untersucht die Eignung von Tabakpflanzen als Expressionssystem für rekombinante MSP119-Varianten und chimäre Antikörper, um diese als potenzielle Malaria-Impfstoffkandidaten zu evaluieren.
Welche Organismen werden für die Produktion genutzt?
Es werden die Pflanzenarten Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana verwendet, in denen die Zielproteine mittels transienter Transformation durch das Agrobacterium-System exprimiert werden.
Warum ist MSP119 ein interessanter Impfstoffkandidat?
MSP119 ist ein stark konserviertes Fragment des Merozoit-Oberflächen-Proteins 1, das bei mehreren klinischen Studien als Teil von Vakzinkandidaten untersucht wird und als kleinstes Fragment noch einen schützenden immunologischen Effekt vermitteln kann.
Welche Methode wird zur Antikörper-Reinigung eingesetzt?
Zur Reinigung der chimären Antikörper wird die Protein A Affinitätschromatographie verwendet, bei der die Proteine an eine Protein A Matrix binden und anschließend eluiert werden.
Wie wird die Immunantwort untersucht?
Die Immunogenität wird in BALB/c-Mäusen geprüft, wobei Blutproben mittels ELISA auf die Reaktivität gegen MSP119 und DsRed analysiert werden.
Welche Rolle spielt das DsRed-Protein?
DsRed dient als Marker- oder Reporterprotein, um die Expression und Akkumulation der Zielproteine in den Pflanzenzellen nicht-invasiv durch Fluoreszenz detektieren zu können.
Wie wird die Stabilität der Proteine sichergestellt?
Es wurde eine Hitzefällung zur Reinigung implementiert und die Temperaturstabilität der Proteine mittels Biacore analysiert, um sicherzustellen, dass die Proteine auch bei höheren Temperaturen ihre konformative Stabilität beibehalten.
Welche spezifischen Antikörper werden zur Untersuchung genutzt?
Es kommen MSP119-spezifische monoklonale Antikörper wie mAb 5.2, 12.8 und 12.10 zum Einsatz, um die Bindungsaffinität und Spezifität der produzierten Fusionsproteine zu bestimmen.
- Arbeit zitieren
- Güven Edgü (Autor:in), 2010, Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/358437
