In Rahmen dieser Diplomarbeit konnte gezeigt werden, dass MSP119, das als potentieller Impfstoffkandidat für ein Malaria-Vakzin betrachtet wird, erfolgreich in Nicotiana tabacum und Nicotiana benthamiana exprimiert werden kann. Es wurden Expressionsvektoren generiert, die die transiente Expression der vier homologen MSP119-Varianten 3D7, FUP, WELLCOME und TYPE2 sowohl einzeln, als auch als N-, sowie C-terminale Fusionen an DsRed, mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Systems, in Pflanzen ermöglichten. Die Gene der vier Isolate waren bei ihrem in silico Design unterschiedlich an die Codon-Präferenz von Tabak angepasst worden. Die Resultate der immunologischen Experimente, die mit Hilfe des MSP119-spezifischen mAB 5.2 durchgeführt wurden, zeigten auf, dass sich alle Varianten gut in Pflanzen exprimieren ließen. Die im Fall von TYPE2 gewählte Codon-Usage führte in allen Varianten zu der höchsten Akkumulation. Die C-terminalen Fusionen zeigten generell im direkten Vergleich mit ihren N-terminalen Gegenstücken eine um den Faktor zwei höhere Akkumulation in Tabakzellen. Dies gilt es aber in zukünftigen Versuchen zu verifizieren.
Das gereinigte MSP119_3D7-DsRed zeigte im Verhältnis zu den anderen Fusionsproteinen die wenigsten Degradationsbanden auf. Es fand eine weiterführende Evaluation mit Hilfe des Biacore T100-System statt, indem Interaktionen der MSP119-Varianten mit den MSP119-spezifischen und Konformations-abhängigen mAbs 12.8, 12.10, 5.2, 2F10 und 1E1 nachgewiesen werden konnte. Dies deutet darauf hin, dass der MSP119-Teil des Fusionsproteins in seiner nativen Struktur vorliegt. In anschließenden Immunisierungsversuchen mit BALB/c-Mäusen, konnten humorale immunantworten gegen MSP119_3D7-DsRed nachgewiesen werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass im transienten Ansatz genügend pflanzliches MSP119 zur Evaluierung produziert wurde, das darüber hinaus sehr wahrscheinlich korrekt gefaltet. Darüber hinaus erwies sich MSP119_3D7-DsRed als immunogen. Hierdurch wurden entscheidende Vorraussetzungen für die weitere Entwicklung eines MSP119-basierten Vakzinkandidaten geschaffen.
Neben der Produktion verschiedener MSP119-Proteine, konnten während dieser Diplomarbeit auch chimäre Varianten der inhibitorischen monoklonalen Antikörper 12.8 und 12.10, die spezifisch gegen MSP119 sind, hergestellt werden. Dazu wurden die murinen variablen Domänen der schweren sowie der leichten Kette der mAbs 12.8 und 12.10 an die konstante Region......
Inhaltsverzeichnis
- EINLEITUNG
- Der Lebenszyklus von Plasmodium falciparum
- Blutstadien-Antigene und ihre Bedeutung für die Vakzinentwicklung
- Merozoit-Oberflächen-Protein 1
- MSP119 als Impfstoffkandidat
- Die MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
- DsRed - Das rot-fluoreszierende Protein
- Pflanzen als Expressionssysteme
- Zielsetzung
- MATERIAL
- Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
- Enzyme, Antikörper und Reaktionkits
- Medien, Lösungen und Puffer
- Geräte, Apparaturen und Zubehör
- Vektoren
- Synthetische Gene
- Synthetische Oligonukleotide (Primer)
- Bakterienstämme und Pflanzen
- METHODEN
- Molekularbiolgische Methoden
- Anzucht von E. coli und Herstellung von Stammkulturen
- Hitzeschocktransformation von E. coli
- Kultivierung von A. tumefaciens und Herstellung von Stammkulturen
- Elektroporation von A. tumefaciens
- Plasmidisolation aus E. coli (Minipräparation)
- Restriktion von DNA
- Analytische und präparative Agarosegelelektrophorese
- Analytische Agarosegelelektrophorese
- Präparative Agarosegelelektrophorese
- Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
- Ligation
- Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
- Kolonie-PCR rekombinanter Bakterien
- Enzymatische DNA-Sequenzierung nach Sanger
- Proteinchemische und immunologische Methoden
- Extraktion löslicher Proteine aus Pflanzenmaterial
- Hitzefällung des Pflanzenextraktes
- Reinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie
- Diskontinuierliche SDS-PAGE
- Sensitive Coomasssie Blue R-250 Färbung
- Western Blot
- Korrelative Proteinquantifizierung mittels Fluoreszenzmessung
- Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Messung (Biacore)
- Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)
- Pflanzen
- Kultivierung von N. tabacum und N. benthamiana im Gewächshaus
- Transiente Expression in N. tabacum und N. benthamiana
- Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed
- ERGEBNISSE
- Herstellung und Charakterisierung der MSP119-Varianten
- Konstruktion der MSP119-Expressionsvektoren
- Temperaturstabilität von HEK- und Tabak-produziertem MSP119
- Transiente Expression der MSP119-Proteinvarianten in N. tabacum
- Reinigung MSP119-Proteinvarianten
- Charakterisierung der Fusionsproteine auf dem Biacore T100-System
- Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed
- Klonierung und Produktion chimärer Varianten der MSP119-spezifischen inhibitorischen mAbs 12.8 und 12.10
- Konstruktion der Expressionsvektoren für die schwere und leichte Kette der chimären mABs 12.8 und 12.10
- Transiente Expression der chimären Antikörper
- Reinigung der chimären mAbs 12.8 und 12.10
- Charakterisierung der gereinigten chimären Antikörper mAb 12.8 und 12.10 auf dem Biacore T100-System
- DISKUSSION UND AUSBLICK
- Charakterisierung der MSP119-Proteinvarianten
- Charakterisierung der chimären mAbs 12.8 und 12.10
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Die vorliegende Diplomarbeit beschäftigt sich mit der Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten. Ziel der Arbeit ist es, die Eignung von Tabakpflanzen als Expressionssystem für die Herstellung von MSP119-Proteinvarianten zu untersuchen und die erhaltenen Proteine auf ihre Immunogenität und ihre Fähigkeit, die In vitro-Wachstum von Plasmodium falciparum zu hemmen, zu untersuchen.
- Entwicklung von Expressionsvektoren für die Produktion von MSP119-Varianten in Tabakpflanzen
- Charakterisierung der in Tabakpflanzen produzierten MSP119-Varianten hinsichtlich ihrer Struktur, Stabilität und Immunogenität
- Evaluierung der Fähigkeit der MSP119-Varianten, das Wachstum von Plasmodium falciparum in vitro zu hemmen
- Untersuchung der Eignung von Tabakpflanzen als Expressionssystem für die Produktion von rekombinanten Malaria-Impfstoffen
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung gibt einen Überblick über den Lebenszyklus von Plasmodium falciparum und die Bedeutung von Blutstadien-Antigenen für die Vakzinentwicklung. Das Merozoit-Oberflächen-Protein 1 (MSP1) wird als vielversprechendes Impfstoffziel vorgestellt. Die Arbeit konzentriert sich auf die MSP119-Region des MSP1, ein wichtiges Epitop, das von inhibitorischen Antikörpern erkannt wird. Es werden verschiedene Ansätze zur Produktion von rekombinanten MSP119-Varianten in Pflanzen, insbesondere Nicotiana tabacum, diskutiert.
Kapitel 2 beschreibt die verwendeten Materialien, inklusive der Vektoren, Gene, Primer und Bakterienstämme. Kapitel 3 erläutert die Methoden, die zur Herstellung und Charakterisierung der MSP119-Varianten eingesetzt werden. Dazu gehören molekularbiologische Methoden wie PCR, Klonierung und Sequenzierung, sowie proteinchemische und immunologische Verfahren wie SDS-PAGE, Western Blot und ELISA. Kapitel 4 präsentiert die Ergebnisse der Arbeit. Es wird gezeigt, dass die MSP119-Varianten erfolgreich in Tabakpflanzen produziert und gereinigt werden konnten. Die charakterisierten Proteine zeigten eine hohe Stabilität und Immunogenität. Schließlich werden die Ergebnisse der Immunisierung von Mäusen mit Tabak-produziertem MSP119_3D7-DsRed vorgestellt.
Schlüsselwörter
Plasmodium falciparum, Malaria, Impfstoff, MSP119, Nicotiana tabacum, rekombinante Proteine, Expressionssystem, Immunogenität, Antikörper, Biacore, ELISA.
- Citar trabajo
- Güven Edgü (Autor), 2010, Produktion rekombinanter MSP119-Varianten von Plasmodium falciparum in Nicotiana tabacum zur Evaluierung als Malaria-Impfstoffkandidaten, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/358437
