Affinitätschromatographie und Charakterisierung von Immunglobulinen

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Material & Methoden
2.1 Ammoniumsulfatfällung
2.2 Gelchromatographie
2.3 Affinitätschromatographie
2.4 Photometrische Bestimmung
2.5 Ouchterlony Doppeldiffusionstest

3 Ergebnisse

4 Diskussion

5 Literaturverzeichnis

6 Anhang

1 Einleitung

Zur Grundlage des inhaltlichen Verständnisses des Praktikumsversuches gehört die Frage nach der Bedeutung von Antikörpern. Daher soll im Folgenden die Frage „Was sind Antikörper?“ erörtert werden.

Da alle Lebewesen mit anderen Organismus ständig in Kontakt treten, v.a. auch Pathogenen, muss das Immunsystem des Körpers, bei einem Übertritt der physikalischen Barriere der Haut und Schleimhäute in den Körper, diese als fremd erkennen und zerstören, damit kein Schaden im Organismus entstehen kann. Bei der Immunität werden zwei Arten unterschieden: die zelluläre Immunität und die humorale Immunität.

Für die Betrachtung in diesem Protokoll wird sich auf die humorale Immunität beschränkt. Diese Immunität stellt einen sehr effektiven „Schutz vor bakteriellen Infektionen und extrazellulär auftretenden Viren“ (Voet/Voet, S. 229) dar. Die Antikörper bzw. Immunglobuline (=Proteine) bilden dabei den Träger diesen Vorganges. Die B-Lymphocyten oder B-Zellen, welche im Knochenmark heranreifen, produzieren die Antikörper.

„Die Immunglobuline (Ig) bilden eine verwandte, aber unglaublich diverse Proteingruppe“ (Voet/Voet, S. 229). Sie bestehen aus mindestens vier Untereinheiten: zwei leichten Ketten (L) und zwei schweren Ketten (H). Durch Disulfidbrücken und nicht kovalenten Wechselwirkungen entsteht eine Y- förmige symmetrische Molekülstruktur.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1 Schematische Darstellung eines menschlichen IgG-Moleküls (Voet/Voet, S. 231). Das Bild befindet sich in besserer Qualität im Anhang.

Es gibt fünf unterschiedliche Immunglobulinklassen, welche sich im Typ ihrer schweren Kette und in der Struktur der Untereinheiten unterscheiden:

- IgG ➔ wird im Rahmen einer langsamen Abwehrreaktion gebildet und bleibt lange im Körper enthalten.
- IgA ➔ ist darauf spezialisiert auf Körperoberflächen Krankheitserreger abzufangen.
- IgM ➔ ist bereits in der Frühphase der Immunabwehr aktiv.
- IgE ➔ vermittelt Schutz vor Parasiten.
- IgD ➔ spielt eine Rolle bei der Aktivierung der B- Lymphozyten.

Da als ein wichtiger Bestandteil des Experiments das BSA Serum (Bo- vine Serum Albumin) genutzt wird, soll in der Einleitung kurz darauf einge- gangen werden. Bei BSA (Rinderalbumin) handelt es sich um einen, durch Fraktionierung gewonnener, Bestandteil von Rinderplasma, welches zur Kali- brierung von Testverfahren und bei immunologischen Nachweisverfahren ver- wendet wird. Es wird dabei eingesetzt, um unspezifische Bindungen von Ig an die Kunststoffoberfläche der Mikrotiterplatte bzw. Agarose-Beads zu verhin- dern, weiterhin wird es in der Bioanalytik als Markerprotein bei der Gel- elektrophorese verwendet Es gehört zu der Gruppe der globulären Proteine.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2 Darstellung eines Rinderserumalbumins (https://data.epo.org/publication- server/image?imageName=imgb0007&docId=4618943)

2 Material & Methoden

In diesem Kapitel werden für jeden Versuchsteil zunächst allgemeine Angaben zur Funktionsweise und den Prinzipien gegeben. Anschließend erfolgt der Bericht der tatsächlichen Durchführung.

2.1 Ammoniumsulfatfällung

Das anti-BSA-Serum wird mit einer 40%igen Ammoniumsulfat- Fällung bearbeitet. Hierbei handelt es sich um eine Proteinfällung durch Aus- salzen. Der Vorgang ist insofern effektiv, da Salze das Löslichkeitsverhalten von Proteinen erheblich beeinflussen. In geringer Konzentration erhöhen sie die Löslichkeit eines Proteins, bei einer Erhöhung der Konzentration des Salzes nimmt die Löslichkeit von Proteinen ab und es kommt zum Aussalzen des Pro- teins aus der Lösung. Dieser Effekt beruht v.a. auf der Konkurrenz von Protei- nen und Salz-Ionen um die solvatisierenden Wasser-Moleküle. Bei der Salzfäl- lung wird ausgenutzt, dass Proteine nur dann in Lösung vorliegen, wenn sie über eine ausreichende Hydrathülle aus Wasser-Molekülen verfügen. In diesem Versuch wird Ammoniumsulfat verwendet, da es eine gute Löslichkeit auf- weist, es lassen sich somit hohe Ionenstärken erreichen und die ausgesalzenen Proteine werden nicht denaturiert, was für die weiterfolgenden Schritte von hoher Wichtigkeit ist. Dieser Schritt steht an erster Stelle des Versuchs, da im weiteren Verlauf mit dem Protein (außerhalb einer Lösung) gearbeitet werden soll.

In der tatsächlichen Durchführung wurden 240 μl anti-BSA-Serum und 165 μl Ammoniumsulfatlösung in ein Eppi unter ständiger Kühlung (via Eisbad) gegeben und miteinander durch Hoch- und Herunterpipettieren ver- mischt. Anschließend wurde bei 14.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand verworfen.

2.2 Gelchromatographie

Bei der Gelchromatographie handelt es sich um ein Trennverfahren, wobei als charakteristischer Faktor die Größe der Proteine zählt. Das Protein- gemisch wird mit einem geeigneten Puffer versetzt (in diesem Versuch 1xPBS¹ ) und über eine Säule mit einem inerten polymeren Material definierter Porengröße (in diesem Versuch Sephadex G50-Säule) gegeben. Proteine unter- schiedlicher Größe dringen unterschiedlich weit in diese Poren ein und wan- dern daher verschieden schnell durch die Säule. Je größer das Protein ist, desto schneller ist es.

Das Sediment (aus 2.1) wurde im weiteren Verlauf in 150 μl Waschpuf- fer, (1x PBS, pH 7,4) gelöst und mit einer Spatelspitze Hämoglobin als Marker für die Säulenchromatographie (Hb ist fast genauso groß wie das Protein) ver- setzt. Die Antikörper befanden sich somit in der roten Lösung. Die Sephadex G50-Säule wurde für den Versuch vorbereitet. Dazu wurde sie an ein Stativ befestigt und sowohl im oberen, wie auch im unteren Bereich geöffnet, damit die noch vorhandene Flüssigkeit (Ethanol als Konservierungsmittel) austreten konnte. Die Gelchromatographie-Säule wurde mit 15 ml Waschpuffer gewa- schen (die Säule wurde in Ethanol konserviert, weshalb ein Waschvorgang mit dem Puffer notwendig war, damit keine unerwünschten Reaktionen/ Verdün- nungsreihen entstanden). Dazu wurde abgewartet, dass kein Waschpuffer mehr aus der Säule austrat, wobei zur Sicherung der untere Deckel nochmals aufge- setzt wurde, damit eventuelle Ansammlungen nochmals bei Entfernen austre- ten konnten. Die Probe wurde anschließend auf die Säule gegeben und abge- wartet, dass sie eingesickert war:

[...]

¹ Phosphatgepufferte Salzlösung als Puffer: 8,1 mM Na2HPO4, 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4.