Optische Mikroskope sind eine der wenigen Möglichkeiten, um lebende Organismen zu untersuchen. Ihre Auflösungsfähigkeit ist jedoch durch Beugungseffekte auf einige hundert Nanometer begrenzt, sodass molekulare Strukturen lange Zeit im Verborgenen blieben. Durch das Markieren bestimmter Arten von Proteinen mit fluoreszenten Molekülen ist es jedoch gelungen, Aussagen über molekulare Strukturen in der Größenordnung weniger Nanometer zu treffen und das Zellinnere näher zu erforschen. Bei diesem Versuch werden wir die Methode des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) kennenlernen und anwenden, um Proteinabstände in einigen Proben menschlicher HeLa-Zellen zu bestimmen und die in dem Prozess auftretenden Fehlerquellen zu untersuchen.
Inhaltsverzeichnis
1. Zielstellung des Versuches
2. Theoretischer Hintergrund
3. Fragen zur Vorbereitung
4. Versuchsaufbau und Messtechniken
5. Messprotokoll
5.1. Kamerarauschen und Identifikation von Fehlerquellen
5.2. Einstellung der Feldblende
5.3. Köhlerbeleuchtung
5.4. Shading Correction
5.5. Bildregistrierung
5.6. FRET-Messung
6. Auswertung
6.1. Kamerarauschen und Identifikation von Fehlerquellen
6.2. Ausbleichen der Zellen
6.3. Shading Correction
6.4. FRET-Messung
6.5. Untersuchungen an lebenden Zellen
7. Fazit
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht die Anwendung der Methode des Förster-Resonanzenergietransfers (FRET) zur Bestimmung molekularer Abstände in lebenden menschlichen HeLa-Zellen. Dabei liegt der Fokus auf der Analyse von Proteinabständen innerhalb der Zellmembran sowie der Untersuchung von Fehlerquellen und zellinternen Dynamiken unter Einwirkung verschiedener Chemikalien.
- Physikalische Grundlagen des Förster-Resonanzenergietransfers
- Experimenteller Aufbau und Optimierung der Fluoreszenzmikroskopie
- Quantifizierung von Bildrauschen und Ausbleicheffekten
- Analyse der zellinternen Dynamik nach chemischer Stimulation
Auszug aus dem Buch
Theoretischer Hintergrund
FRET ist ein physikalischer Effekt, der die strahlungsfreie Übertragung von Energie zwischen zwei mit unterschiedlichen Farbstoffen markierten Molekülen beschreibt. Der Effekt kann in beide Richtungen ablaufen, wir beschränken uns jedoch auf die Energieübertragung in eine Richtung. Einer der Farbstoffe (Donor) wird mit Licht angeregt. Wenn Moleküle des zweiten Farbstoffes (Akzeptor) in der Nähe des Donors sind, werden diese durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen angeregt und geben selbst Photonen einer größeren Wellenlänge beim Übergang in den Grundzustand ab.
Der Donor wird durch ein Photon in einen angeregten Schwingungszustand gebracht und geht innerhalb von Picosekunden in den normalen angeregten Zustand über. Von dort aus könnte der Donor durch Abgabe eines Photons wieder in den Grundzustand übergehen (Fluoreszenz). Ist ein geeigneter Akzeptor in der Nähe, wird durch Dipol-Dipol-Wechselwirkungen die Energie auf diesen strahlungsfrei übertragen. Der Akzeptor geht erneut durch Relaxation von seinem angeregten Schwingungszustand in seinen angeregten Zustand über, von dem aus er durch Abgabe eines langwelligen Photons in den Grundzustand gelangt. FRET äußert sich also in einer Verminderung der Fluoreszenz des Donors und in einer Erhöhung der Emission im Spektrum des Donors.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Zielstellung des Versuches: Einführung in die Problematik der mikroskopischen Auflösungsgrenzen und Vorstellung von FRET als Methode zur Untersuchung molekularer Strukturen.
2. Theoretischer Hintergrund: Erläuterung des physikalischen Prinzips des Energietransfers zwischen Donor- und Akzeptormolekülen sowie der Abhängigkeit vom Försterradius.
3. Fragen zur Vorbereitung: Theoretische Auseinandersetzung mit Dipol-Wechselwirkungen, Orientierungseffekten und experimentellen Korrekturen.
4. Versuchsaufbau und Messtechniken: Beschreibung der verwendeten Geräte und der Methodik zur Bestimmung der FRET-Effizienz mittels Sensitized Emission.
5. Messprotokoll: Dokumentation der experimentellen Parameter, des Kamerarauschens und der Vorgehensweise bei der Bildaufnahme unter verschiedenen Bedingungen.
6. Auswertung: Detaillierte Analyse der Kameradaten, der Ausbleichraten von Farbstoffen und der Berechnung der FRET-Effizienz in verschiedenen Zellbereichen.
7. Fazit: Kritische Reflexion über die Herausforderungen des Versuchsaufbaus und die beobachteten biologischen Prozesse wie die Bläschenbildung unter Lichteinfluss.
Schlüsselwörter
FRET, Förster-Resonanzenergietransfer, Fluoreszenzmikroskopie, HeLa-Zellen, Donor, Akzeptor, Bildrauschen, Sensitized Emission, Zellmembran, Proteindynamik, Ausbleichen, Phototoxizität, Dipol-Wechselwirkung, Försterradius, Mikroskopie
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit behandelt die Durchführung eines physikalischen Versuchs zur Messung von Molekülabständen mittels Förster-Resonanzenergietransfer in lebenden Zellen.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themen sind Fluoreszenzmikroskopie, physikalische Energietransfer-Mechanismen, Bildverarbeitung von Fluoreszenzdaten und die Beobachtung zellbiologischer Reaktionen.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Ziel ist es, die Methode des FRET anzuwenden, um die Abstände zwischen spezifisch markierten Proteinen in HeLa-Zellen zu bestimmen und die Einflüsse von Stimuli zu analysieren.
Welche wissenschaftliche Methode kommt zum Einsatz?
Es wird das Verfahren der Sensitized Emission unter Verwendung eines Epi-Fluoreszenzmikroskops und anschließender digitaler Bildkorrektur und Auswertung angewandt.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil umfasst den Versuchsaufbau, die Protokollierung der Messdaten unter Berücksichtigung von Rauschen und Ausbleicheffekten sowie die mathematische Auswertung der Bildserien.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die wichtigsten Begriffe sind FRET, Fluoreszenzmikroskopie, HeLa-Zellen, Donor, Akzeptor, Bildrauschen und Sensitized Emission.
Warum spielt das Ausbleichen der Zellen eine wichtige Rolle?
Das Ausbleichen ist ein signifikanter Störfaktor im Experiment, der durch toxische Radikalbildung unter Lichteinwirkung entsteht und die Genauigkeit der Messungen beeinträchtigt.
Welche Bedeutung hat die Bläschenbildung in der Untersuchung?
Die Bläschenbildung ist eine unerwartete Reaktion der Zellen auf die intensive Belichtung, die als zellulärer Schutzmechanismus oder Folge von Phototoxizität interpretiert wird.
Welchen Einfluss haben Chemikalien wie Bradykinin auf das Experiment?
Die Zugabe der Chemikalien sollte eigentlich eine Änderung der FRET-Effizienz bewirken; jedoch wurden diese Prozesse stark durch das generelle Ausbleichen und Absterben der Zellen überlagert.
- Arbeit zitieren
- Moritz Lehmann (Autor:in), Niklas Stenger (Autor:in), 2017, Förster-Resonanzenergietransfer. Physikalisches Praktikum für Fortgeschrittene, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/378242
