Die Arbeit beschäftigt sich mit einem Fluoreszenzplarisationsassay für die Detektion von Tee und Tee-Extrakten.
Koffein ist ein Xanthinalkaloid, welches natürlich in über 60 verschiedenen Pflanzen vorkommt z.B. in Kakaobohnen, in Teeblättern und in der Kolanuss. Es wurde erstmals 1820 von Friedlieb Ferdinand Runge aus Kaffeebohnen gewonnen und 1895 von Emil Fischer synthetisiert.
Koffein hat eine anregende Wirkung und zählt daher zu den Stimulantien. Es kommt nicht nur natürlich vor, sondern wird außerdem pharmazeutisch in Form von Tabletten und Pulver verwendet z.B. bei der Beseitigung von Ermüdungserscheinungen und zur Behandlung von Migräneanfällen. Auf Grund der stimulierenden Wirkung wird Koffein auch in Getränken (z.B. in Energy Drinks) zugesetzt.
Die Wirkung des Koffeins ist abhängig von der Dosis. In geringen Mengen (ca. 50 -150 mg) kommt es zu einer anregenden Wirkung. Der Blutdruck und der Herzschlag werden erhöht, dadurch werden Ermüdungserscheinungen beseitig und die Konzentration und die Aufmerksamkeit erhöht. In höheren Dosen (ab 150 mg) kommt es zu einer erregenden Wirkung auf die Atmung und des Kreislaufes. Es kann zu unangenehmen Nebenwirkungen wie Händezittern und Druck in der Herzgegend kommen. Die letale Dosis beim Menschen liegt zwischen 5 und 30 g.
Koffein kann mit Hilfe verschiedener chromatographischer Verfahren nachgewiesen werden. Bevorzugt werden die High Performance Liquid Chromatography und die Gaschromatographie, sowie Kopplungen dieser Verfahren mit der Massenspektrometrie. Mittlerweile stehen auch Immunoassays zur Verfügung, deren Grundlage die Antikörper-Antigen-Reaktion bilden.
In dieser Arbeit wurde ein, zu den antikörperbasierenden Screening Verfahren zählender, kinetischer Immunoassays verwendet, welcher zur Detektion die Fluoreszenz-Polarisation nutzt. Dieses Verfahren wurde von der delta AG entwickelt um Mykotoxine in Getreide nachzuweisen. Das Biotechnologie Unternehmen hat sich auf den Nachweis von Mykotoxinen mittels eines Fluoreszenz-Polarisations- Immunoassay spezialisiert und ist auf dem Campus-Buch in Berlin ansässig.
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN
2.1 GRUNDLAGEN ZUR FLUORESZENZPOLARISATIONSSPEKTROSKOPIE
2.2 GRUNDLAGEN EINES IMMUNOASSAYS
2.2.1 Aufbau von Antikörpern
2.2.2 Antigen-Antikörper-Bindung
2.2.3 Immunoassays
2.3 GRUNDLAGEN ZUR MESSUNG MITTELS DELTA SYSTEM
2.3.1 Aufbau und Funktionsweise der Liquid Handling Workstation LHW 03
2.3.2 Aufbau und Funktionsweise des deltaspectrometerFP470
2.4 ZIELSTELLUNG
3 MATERIAL
3.1 MATERIALIEN UND GERÄTE
3.2 CHEMIKALIEN
3.3 VERWENDETE ANTIKÖPER
4 METHODEN
4.1 ALLGEMEINE DURCHFÜHRUNG DES DELTA VERFAHRENS
4.1.1 Die delta mycontrol Software
4.1.2 Bestimmung der Konzentration mittels deltamycontrol Software
4.2 TITRATION DER ANTIKÖRPER
4.3 ERSTELLUNG EINER TESTKALIBRIERUNG
4.4 STABILITÄTSTEST DER F-CAF UND A-CAF REAGENZIEN
4.5 UNTERSUCHUNG AUF KREUZREAKTIONEN
4.6 BESTIMMUNG DER KOFFEINKONZENTRATION IN VERSCHIEDENEN TEEPROBEN
5 ERGEBNISSE
5.1 TITRATION DER ANTIKÖRPER
5.2 ERSTELLUNG EINER TESTKALIBRIERUNG
5.3 STABILIÄTSTEST DER F-CAF UND A-CAF REAGENZIEN
5.4 UNTERSUCHUNG AUF KREUZREAKTIONEN
5.5 BESTIMMUNG DER KOFFEINKONZENTRATION IN VERSCHIEDENEN TEEPROBEN
6 DISKUSSION
6.1 TITRATION DER ANTIKÖRPER
6.2 ERSTELLUNG EINER TESTKALIBRIERUNG
6.3 STABILITÄTSTEST DER F-CAF UND A-CAF REAGENZIEN
6.4 UNTERSUCHUNG AUF KREUZREAKTIONEN
6.5 BESTIMMUNG DER KOFFEINKONZENTRATION IN DEN TEEPROBEN
7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK
7.1 ZUSAMMENFASSUNG
7.2 AUSBLICK
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays (FPIA) zur effizienten Quantifizierung von Koffein in Tee und Tee-Extrakten, um eine zeit- und kosteneffiziente Alternative zur etablierten UHPLC-Analytik bereitzustellen.
- Methodische Optimierung der Antikörpertitration und Kalibrierung.
- Analyse der Kreuzreaktivität gegenüber ähnlichen Substanzen wie Theobromin, Theophyllin und (+)-Catechin.
- Untersuchung der Langzeitstabilität der eingesetzten F-CAF und A-CAF Reagenzien.
- Validierung des Assays durch Vergleich mit Referenzwerten aus der UHPLC-Qualitätskontrolle.
Auszug aus dem Buch
2.3 Grundlagen zur Messung mittels delta System
Mit dem vom delta entwickelten Verfahren können die zu untersuchenden Analyte mittels kompetitiven Immunoassays analysiert und mit Hilfe der kinetischen Fluoreszenzpolarisation detektiert werden. Die Analysen mit den delta Assays sind schnell und einfach in der Handhabung. Bei den Assays handelt es sich um homogene Assays, daher sind keine Immobilisierungs- und Waschschritte notwendig. Der kompetitive Immunoassay besteht aus einem Antikörper, dem Antigen, sowie dem fluoreszenzmarkierten Antigen.
Beim delta Verfahren ist die Polarisation direkt von der Molekülgröße des Fluorophors abhängig. Deshalb müssen Temperatur und die Viskosität der Lösung immer gleich sein. Die kleinen Moleküle (ungebundenes, fluoreszenzmarkiertes Antigen) werden durch das linear polarisierte Licht angeregt, rotieren schnell und haben zum Zeitpunkt der Emission einen niedrigen Polarisationswert. Große Moleküle, wie das an den Antikörper gebundene floureszenzmarkierte Antigen, rotieren langsamer und haben daher einen höheren Polarisationswert. Wenn kein Antigen in der Probe vorhanden ist, dann bindet das fluoreszenzmarkiere Antigen an den Antikörper und führt auf Grund der niedrigen Rotation zu einem hohem Polarisationsgrad. Ist in der Probe allerdings ein Antigen vorhanden, bindet das Antigen der Probe an den Antiköper und das fluoreszenzmarkierter Antigen bindet kaum oder nicht an den Antikörper.
Dadurch, dass das Antigen mit dem floureszenzmarkierte Antigen um die Bindungsstelle am Antikörper konkurriert, ist die gemessene Polarisation vom Verhältnis der Menge des gebundenen und des ungebundenen Fluorophors abhängig. Die Volumina des Fluorophors, des Antikörpers und der Probe sind bei der Messung bekannt und immer gleich. Dadurch kann anhand des gemessenen Polarisationsgrades die Konzentration des Analyten in der Probe bestimmt werden. Zuvor muss allerdings eine Kalibrierung mit bekannten Konzentrationen erstellt werden. Die Auswertung erfolgt dann mit Hilfe der deltamycontrol Software [23].
Zusammenfassung der Kapitel
1 EINLEITUNG: Einführung in die Thematik der Koffeindetektion und die Notwendigkeit für ein effizienteres, antikörperbasiertes Screening-Verfahren in der Lebensmittelanalytik.
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN: Erläuterung der physikalischen Grundlagen der Fluoreszenz-Polarisationsspektroskopie, der Funktionsweise von Immunoassays sowie der technischen Komponenten des delta Messsystems.
3 MATERIAL: Auflistung der verwendeten Laborgeräte, Chemikalien sowie der spezifisch verwendeten monoklonalen Antikörper zur Durchführung der Versuche.
4 METHODEN: Detaillierte Beschreibung der experimentellen Abläufe, von der Softwaresteuerung über die Titration und Kalibrierung bis hin zur Stabilitätsprüfung und Probenvorbereitung.
5 ERGEBNISSE: Darstellung der experimentellen Daten zur Antikörpertitration, Testkalibrierung, Reagenzien-Stabilität, Kreuzreaktivitätsanalysen und den Messergebnissen der verschiedenen Teeproben.
6 DISKUSSION: Interpretation der erzielten Ergebnisse hinsichtlich Sensitivität, Reproduzierbarkeit und Eignung des Verfahrens im Vergleich zur Referenzmethode.
7 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK: Zusammenfassende Bewertung der erreichten Ziele und Diskussion potenzieller zukünftiger Einsatzmöglichkeiten des Koffein-Assays in anderen Getränkematrizes.
Schlüsselwörter
Koffein, Immunoassay, Fluoreszenz-Polarisation, FPIA, Antikörper, Titration, Tee-Analyse, Kreuzreaktivität, Stabilitätstest, Quantifizierung, delta System, Bioprozesstechnik, Analytik, Reproduzierbarkeit, Lebensmittelqualität.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Bachelorarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Validierung eines Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays zur Bestimmung des Koffeingehaltes in Tee und Tee-Extrakten.
Welche zentralen Themenfelder werden behandelt?
Die zentralen Felder umfassen die Antikörpercharakterisierung, die Optimierung des kompetitiven Immunoassays, die Untersuchung der Kreuzreaktivität zu verwandten Verbindungen und die Stabilitätsprüfung der Reagenzien.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das primäre Ziel ist es, eine schnellere und kostengünstigere Methode zur Qualitätskontrolle für Tee-Produkte zu etablieren, die die zeitintensive UHPLC-Analytik ersetzt oder ergänzt.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es wird ein kinetischer, kompetitiver Immunoassay basierend auf der Fluoreszenz-Polarisation unter Verwendung eines spezifischen delta-Messsystems genutzt.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die theoretischen Grundlagen des Messverfahrens, die methodische Beschreibung der Durchführung, die Darstellung der experimentellen Ergebnisse sowie eine kritische Diskussion der Datenqualität.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit lässt sich primär durch die Begriffe Koffein, Fluoreszenz-Polarisation, Immunoassay, Antikörper, Tee-Analytik und analytische Validierung charakterisieren.
Warum wurde G115EG12 als bevorzugter Antikörper gewählt?
Aufgrund der Titrationsergebnisse zeigte sich dieser Antikörper als besonders geeignet für den gewünschten Messbereich bis zu 1000 nM, was eine Reduktion der notwendigen Probenverdünnungsschritte ermöglichte.
Wie sicher ist die Unterscheidung des Assays gegenüber Theobromin?
Die Untersuchungen zeigten eine geringe Kreuzreaktivität von etwa 3 % bei hohen Konzentrationen, während bei Konzentrationen unter 250 nM keine signifikante Kreuzreaktion mehr nachweisbar war, was die Spezifität des Assays für Koffein in den relevanten Bereichen untermauert.
- Arbeit zitieren
- Michael Neumann (Autor:in), 2017, Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay für die Detektion von Koffein in Tee und Tee-Extrakten, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/383479
