Excerpt
II
Inhaltsverzeichnis
I. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... IV
II. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ... V
III. TABELLENVERZEICHNIS ... VI
1
EINLEITUNG ... 1
2
THEORETISCHE GRUNDLAGEN ... 2
2.1
G
RUNDLAGEN ZUR
F
LUORESZENZPOLARISATIONSSPEKTROSKOPIE
... 2
2.2
G
RUNDLAGEN EINES
I
MMUNOASSAYS
... 4
2.2.1
Aufbau von Antikörpern ... 4
2.2.2
Antigen-Antikörper-Bindung ... 5
2.2.3
Immunoassays ... 5
2.3
G
RUNDLAGEN ZUR
M
ESSUNG MITTELS DELTA
S
YSTEM
... 6
2.3.1
Aufbau und Funktionsweise der Liquid Handling Workstation LHW 03 ... 7
2.3.2
Aufbau und Funktionsweise des deltaspectrometerFP470 ... 7
2.4
Z
IELSTELLUNG
... 9
3
MATERIAL ... 10
3.1
M
ATERIALIEN UND
G
ERÄTE
... 10
3.2
C
HEMIKALIEN
... 10
3.3
V
ERWENDETE
A
NTIKÖPER
... 10
4
METHODEN ... 11
4.1
A
LLGEMEINE
D
URCHFÜHRUNG DES DELTA
V
ERFAHRENS
... 11
4.1.1
Die delta mycontrol Software ... 11
4.1.2
Bestimmung der Konzentration mittels deltamycontrol Software ... 13
4.2
T
ITRATION DER
A
NTIKÖRPER
... 16
4.3
E
RSTELLUNG EINER
T
ESTKALIBRIERUNG
... 17
4.4
S
TABILITÄTSTEST DER
F-CAF
UND
A-CAF
R
EAGENZIEN
... 18
4.5
U
NTERSUCHUNG AUF
K
REUZREAKTIONEN
... 19
4.6
B
ESTIMMUNG DER
K
OFFEINKONZENTRATION IN VERSCHIEDENEN
T
EEPROBEN
... 21
5
ERGEBNISSE ... 22
5.1
T
ITRATION DER
A
NTIKÖRPER
... 22
5.2
E
RSTELLUNG EINER
T
ESTKALIBRIERUNG
... 25
5.3
S
TABILIÄTSTEST DER
F-CAF
UND
A-CAF
R
EAGENZIEN
... 26
5.4
U
NTERSUCHUNG AUF
K
REUZREAKTIONEN
... 28
5.5
B
ESTIMMUNG DER
K
OFFEINKONZENTRATION IN VERSCHIEDENEN
T
EEPROBEN
... 29
III
6
DISKUSSION ... 33
6.1
T
ITRATION DER
A
NTIKÖRPER
... 33
6.2
E
RSTELLUNG EINER
T
ESTKALIBRIERUNG
... 34
6.3
S
TABILITÄTSTEST DER
F-CAF
UND
A-CAF
R
EAGENZIEN
... 35
6.4
U
NTERSUCHUNG AUF
K
REUZREAKTIONEN
... 36
6.5
B
ESTIMMUNG DER
K
OFFEINKONZENTRATION IN DEN
T
EEPROBEN
... 37
7
ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK... 39
7.1
Z
USAMMENFASSUNG
... 39
7.2
A
USBLICK
... 39
8
LITERATURVERZEICHNIS ... 40
IV
I. Abkürzungsverzeichnis
A-CAF
Antikörper gegen Koffein
BSA
Bovine Serum Albumin
CAF
Koffein
D
Dunkelspannung
P
Änderung der Polarisation in mP
F-CAF
Fluoreszenzmarkiertes Koffein
FP470
Fluoreszenz-Spektrometer
FPIA
Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay
H
Horizontal eingestellter Polarisator
UHPLC
Ultra High Performance Liquid Chromatography
LHW03
Liquid Handling Workstation
PBS
Phosphate Buffered Saline
PMT 1
Photomultiplier Tube 1
PMT 2
Photomultiplier Tube 2
RP
Reaktionspuffer
RT
Raumtemperatur
SBG
Sample Background
V
Vertikal eingestellter Polarisator
VE-Wasser
Vollentsalztes Wasser
VH
Vertikal eingestellter Polarisator und horizontal eingestellter Emissionspolarisator
VV
Vertikal eingestellter Polarisator und Emissionspolarisator
V
II. Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: vereinfachtes Jablonski Diagramm ... 2
Abbildung 2: Schematischer Aufbau des IgG ... 4
Abbildung 3: Draufsicht auf das Probenrack ... 7
Abbildung 4: deltaspektrometer FP470 mit Küvette und drehbaren Polarisator ... 8
Abbildung 5: Schematischer Aufbau des deltaspectrometerFP470 ... 8
Abbildung 6: Signalintensität beider Detektoren (PMT 1 und PMT 2) am Beispiel einer Koffeinmessung
(Standard 125 nM, Probenvolumen 200 L) über die gesamte Messdauer ... 12
Abbildung 7: Darstellung eines Messpunktes bei einen bestimmten Zeitpunkt in der Kalibrierung (A) und
Lage des Messpunktes über der Zeit dargestellten Konzentration (B),am Beispiel einer Kalibrierungsmessung
bei Koffein bei einer Konzentration von 125 nM ... 15
Abbildung 8: Titration des Antikörpers G115EG12 bei einer Koffeinkonzentration von 1000 nM ... 22
Abbildung 9: Ergebnis der Titration des Antikörpers G115EG12 ... 22
Abbildung 10: Ergebnis der Titration des Antikörpers G115ED4 ... 23
Abbildung 11: Ergebnis der Titration des Antikörpers G115EH2 ... 24
Abbildung 12: Kalibrierung mit dem Antikörper G115ED4 zwischen 1000 und 0 nM ... 25
Abbildung 13: Kalibrierung der mit dem Antikörper G115EG12 zwischen 2000 nM und 0 nM ... 25
Abbildung 14: Langzeitstabilitätstest von F-CAF bei unterschiedlichen Lagerbedingungen: Intensität von F-
CAF in Abhängigkeit von der Lagerzeit ... 26
Abbildung 15: Langzeitstabilitätstest von A-CAF bei unterschiedlichen Lagerbedingungen ... 27
Abbildung 16: Vergleich der Kalibrierung nach dem Ansetzen der Lösungen und nach 30 Tagen. Dargestellt
ist Änderung der Polarisation in Abhängigkeit von der Konzentration in nM ... 27
Abbildung 17: Strukturformel von Koffein, Theobromin und Theophyllin ... 36
Abbildung 18: Strukturformel des (+)-Catechin ... 37
VI
III. Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Übersicht der hergestellten Koffeinlösungen ... 16
Tabelle 2: Übersicht über die hergestellten Kalibrierlösungen ... 17
Tabelle 3: Übersicht der Verdünnungsreihe für Theobromin... 19
Tabelle 4: Übersicht der Verdünnungsreihe für Theophyllin ... 19
Tabelle 5: Übersicht der Verdünnungsreihe für (+)-Catechin ... 20
Tabelle 6: Übersicht über die von der Phytolab GmbH & Co. KG zur Verfügung gestellten Teeproben... 21
Tabelle 7: Ergebnisse der Kreuzreaktivität auf Theobromin ... 28
Tabelle 8: Ergebnisse der Kreuzreaktivität mit Theophyllin ... 28
Tabelle 9: Ergebnisse der Kreuzreaktivität mit Catechin ... 28
Tabelle 10: Messergebnisse des Tee Nr. 1 ... 30
Tabelle 11: Messergebnisse des Tee Nr. 2 ... 30
Tabelle 12: Messergebnisse des Tees Nr.3 ... 31
Tabelle 13: Messergebnisse des Tees Nr. 4... 31
Tabelle 14: Messergebnisse des Tees Nr. 5 ... 32
Tabelle 15: Messergebnisse des Tee Nr. 6 ... 32
1
1 Einleitung
Koffein ist ein Xanthinalkaloid, welches natürlich in über 60 verschiedenen Pflanzen vorkommt z.B. in
Kakaobohnen, in Teeblättern und in der Kolanuss. Es wurde erstmals 1820 von Friedlieb Ferdinand Runge
aus Kaffeebohnen gewonnen und 1895 von Emil Fischer synthetisiert [1].
Koffein hat eine anregende Wirkung und zählt daher zu den Stimulantien. Es kommt nicht nur natürlich
vor, sondern wird außerdem pharmazeutisch in Form von Tabletten und Pulver verwendet z.B. bei der
Beseitigung von Ermüdungserscheinungen und zur Behandlung von Migräneanfällen. Auf Grund der
stimulierenden Wirkung wird Koffein auch in Getränken (z.B. in Energy Drinks) zugesetzt.
Die Wirkung des Koffeins ist abhängig von der Dosis. In geringen Mengen (ca. 50 -150 mg) kommt es zu
einer anregenden Wirkung. Der Blutdruck und der Herzschlag werden erhöht, dadurch werden
Ermüdungserscheinungen beseitig und die Konzentration und die Aufmerksamkeit erhöht. In höheren
Dosen (ab 150 mg) kommt es zu einer erregenden Wirkung auf die Atmung und des Kreislaufes. Es kann
zu unangenehmen Nebenwirkungen wie Händezittern und Druck in der Herzgegend kommen. Die letale
Dosis beim Menschen liegt zwischen 5 und 30 g [1].
Koffein kann mit Hilfe verschiedener chromatographischer Verfahren nachgewiesen werden. Bevorzugt
werden die High Performance Liquid Chromatography und die Gaschromatographie, sowie Kopplungen
dieser Verfahren mit der Massenspektrometrie. Mittlerweile stehen auch Immunoassays zur Verfügung,
deren Grundlage die Antikörper-Antigen-Reaktion bilden.
In dieser Arbeit wurde ein, zu den antikörperbasierenden Screening Verfahren zählender, kinetischer
Immunoassays verwendet, welcher zur Detektion die Fluoreszenz-Polarisation nutzt. Dieses Verfahren
wurde von der delta AG entwickelt um Mykotoxine in Getreide nachzuweisen. Das Biotechnologie
Unternehmen hat sich auf den Nachweis von Mykotoxinen mittels eines Fluoreszenz-Polarisations-
Immunoassay spezialisiert und ist auf dem Campus-Buch in Berlin ansässig.
Ziel dieser Arbeit ist es, in Kooperation mit der Phytolab GmbH & Co. KG, ein Assay zu entwickeln, welches
für den Nachweis von Koffein in Tee und Tee-Extrakten geeignet ist. Die Phytolab GmbH & Co. KG stellt Tee
und Tee-Extrakte her und führt die Bestimmung des Koffeingehaltes mittels Ultra High Performance Liquid
Chromatography (UHPLC) für die Qualitätskontrolle durch [2]. Ein Nachteil dieser Methode ist allerdings,
dass sie sehr zeit- und kostenintensiv ist. Immunoassays, wie das Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays
(FPIA), benötigen keine Reinigungsschritte oder aufwendige Probenvorbereitungen und ermöglichen
Analysen innerhalb weniger Minuten und können somit Zeit und Kosten sparen [3].
2
2 Theoretische Grundlagen
2
2.1 Grundlagen zur Fluoreszenzpolarisationsspektroskopie
Fluoreszenz ist die spontane Emission von Photonen. Stoffe, die fluoreszieren können, werden als
Fluorophore bezeichnet. Werden Fluorophore mit Licht angeregt, werden die Elektronen durch die
Absorption der Strahlung auf ein höheres Energieniveau (S
1
oder S
2
) gehoben. Da dieser Zustand nicht
stabil ist, fallen die Elektronen wieder zurück in den Grundzustand (S
0
). Bei der Fluoreszenz erfolgt
zunächst ein strahlungsloser Übergang (z.B. Wärme) vom S
2
- Niveau zum S
1
- Niveau. Danach erfolgt, durch
Emission eines Photons, der Übergang vom S
1
- Niveau zum S
0
- Niveau [4]. Bei diesen Vorgängen ist die
Energie des emittierenden Photons geringer als die des absorbierten Photons. Daraus ergibt sich, dass die
Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes größer ist als die des Anregungslichtes ist. Dieser Unterscheid
zwischen den Wellenlängen wird als Stokes-Shift bezeichnet [5]. Die Elektronenübergänge sind graphisch
im Jablonski-Diagramm in Abb. 1 dargestellt.
Neben der Anregungs- und Emissionswellenlänge sind auch die Quantenausbeute und die
Fluoreszenzlebensdauer wichtige Eigenschaften des Fluorophors. Die Fluoreszenzlebensdauer beschreibt
die durchschnittliche Zeit, in der ein angeregtes Molekül im angeregten Zustand verbleibt bevor es wieder
in den Grundzustand zurückfällt. Die Fluoreszenzlebensdauer liegt durchschnittlich bei
s. Die
Quantenausbeute beschreibt das Verhältnis der emittierten Photonen zur Anzahl der absorbierten
Photonen. Je größer die Quantenausbeute ist, desto heller ist die Fluoreszenzemission [5].
Bei der Fluoreszenz ist linear polarisiertes Licht ein wichtiger Faktor, da durch linear polarisiertes Licht die
Fluoreszenz ausgelöst wird. Die Schwingungsrichtung von natürlichem Licht ist in der Regel unpolarisiert.
Eine Methode zur Polarisation ist die Doppelbrechung in bestimmten Kristallen (z.B. Kalkspat). Das
Abbildung 1: vereinfachtes Jablonski Diagramm[6]
3
einfallende unpolarisierte Licht, wird durch diese Kristalle in zwei Strahlen aufgeteilt, in einen
unpolarisierten Strahl und einen polarisierten Strahl. Eine andere Methode ist die Verwendung von
Polarisationsfilter. Diese lassen Licht nur in einer Schwingungsrichtung passieren [5].
Lichtquellen wie z.B. Glühlampen geben polychromatisches Licht ab. Für die Selektion definierter
Wellenlänge werden Interferenzfilter verwendet, welche im Idealfall alle Wellenlängen, außer der
gewünschten, auslöschen [5].
Für die Bestimmung der Polarisation wird das Fluoreszenzlicht in zwei unterschiedlichen
Schwingungsebenen gemessen. Einmal in der Schwingungsebene in der die Anregung erfolgt und einmal
in einem Winkel um 90° verdrehten Ebene. Die Messung der Fluoreszenz erfolgt in einem Winkel von 90°
zur Anregungsquelle um sicherzustellen, dass keine transmittierte Strahlung auf den Detektor trifft. Die
Anregung erfolgt dabei vertikal zur Ebene, auf der sich die Komponenten befinden. Die Detektion erfolgt
vertikal (V) und horizontal (H) zur Ebene. Für die Berechnung der Polarisation wird folgende Formel
angewendet:
(Gleichung 1)
Die Polarisation ist eine dimensionslose Größe, welches das Verhältnis von den Lichtintensitäten
wiedergibt. Bei den Intensitäten (I) steht der erste Index für die Schwingungsebene des Anregungslichtes
und der zweite Index für die Schwingungsebene des Fluoreszenzlichtes. I
VV
ist die Intensität bei vertikaler
Anregung und vertikaler Detektion, I
VH
ist die Intensität bei vertikaler Anregung und horizontaler
Detektion. Die Polarisation bekommt die Scheineinheit ,,P" und wird häufig in mP angegeben [5].
Des Weiteren ist die Polarisation abhängig von der Temperatur (T), der Viskosität () der Lösung und der
Größe des Fluorophors (A). Kleine Fluorophore haben eine Polarisation von 20 35 mP, je nach Lösemittel
und Temperatur. Große Proteinkomplexe haben eine Polarisation von ca. 400 mP bis 500 mP. Je viskoser
das Lösungsmittel desto größer ist die Polarisation. Bei steigender Temperatur oder
Fluoreszenzlebensdauer nimmt die Polarisation ab. Von Bedeutung ist auch die Lebensdauer des
angeregten Zustandes (). Mit der allgemeinen Gaskonstante (R) ergibt sich nach Perrin folgende
Gleichung [5].
(Gleichung 2)
Werden zwei Detektoren verwendet, wie bei der T-Anordnung wo die beiden Signale (VH und VV)
gleichzeitig bestimmt werden, können bei der Messung Abweichungen auftreten. Im Idealfall sollten die
4
Detektoren die gleichen Werte liefern. Um nicht-ideales Verhalten auszugleichen wird ein Faktor (G-Wert)
bestimmt. Er wird mithilfe des horizontalen Anregungspolarisators bestimmt. Der G-Wert wird nach
folgender Gleichung bestimmt.
(Gleichung 3)
Der G-Wert ist vom Gerät abhängig und muss vor jeder Messung separat ermittelt werden. Im Idealfall
sollte der
sein.
2
2.2 Grundlagen eines Immunoassays
2.2.1 Aufbau von Antikörpern
Antikörper sind lösliche Immunglobuline (Ig), die in Wirbeltieren als Reaktion von bestimmten Stoffen
(Antigenen) gebildet werden. Alle Antikörper bestehen aus zwei identischen schweren und zwei
identischen leichten Ketten, die jeweils variable und konstante Abschnitte besitzen. Die Ketten sind so
angeordnet, dass sich ein Y-förmiges Molekül ergibt. Die leichten Ketten können in zwei Isotype unterteilt
werden, dem Typ kappa () und lambda (). Bei den schweren Ketten gibt es fünf Isotypen, die als , , ,
und bezeichnet werden. Daraus ergeben sich die fünf Hauptklassen der Immunglobuline, die als IgA,
IgM, IgD, IgE und IgG bezeichnet werden. Der am häufigsten vorkommende Antikörper ist der IgG, dessen
Aufbau in Abb. 2 dargestellt ist.
Abbildung 2: Schematischer Aufbau des IgG [8]
Der IgG besteht aus zwei identischen schweren und zwei identischen leichten Ketten, die über
Disulfidbrücken miteinander verbunden sind. Jede Kette besteht aus einer Reihe von ähnlichen Sequenzen
aus ca. 110 Aminosäuren. Diese Abschnitte werden als Proteindomänen bezeichnet. Die leichten Ketten
bestehen aus je zwei Domänen und die schwere Kette aus vier Domänen. Die variablen Domänen der
schweren (V
H
) und der leichten (V
L
) Ketten bilden die variable Region und die konstanten Domänen der
schweren Kette (C
H1
-C
H3
) und der leichten (C
L
) Kette bilden die konstante Region. Die variable Region des
Excerpt out of 47 pages
- Quote paper
- Michael Neumann (Author), 2017, Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassay für die Detektion von Koffein in Tee und Tee-Extrakten, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/383479
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