Einfluss von Ethanol auf die Aufnahme von Cyanidin-3-O-ß-D-Glucosid (Weininhaltstoff) am isoliert perfundierten Rattendünndarm

Table of Contents

1 EINLEITUNG
1.1 Einordnung der Anthocyane
1.2 Vorkommen und tägliche Aufnahme von Flavonoiden
1.3 Strukturen
1.4 Wirkung
1.5 Absorption und Metabolismus von Flavonoiden/ Anthocyanen/ Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid
1.6 Zielsetzung

2 MATERIAL
2.1 Versuchstiere und Haltungsfutter
2.2 Arzneimittel und Geräte für die Perfusionen
2.3 Chemikalien
2.4 Geräte

3 METHODEN
3.1 Die Dünndarmperfusion
3.1.1 Einführung und Technik
3.1.2 Perfusionsmedien
3.1.3 Apparativer Aufbau des Perfusionsmodells
3.1.4 Versuchsdurchführung
3.2 Analytische Methoden
3.2.1 Bestimmung der Viabilitätsparameter
3.2.2 Bestimmung von Cyandin-3-Glucosid mittels RP-HPLC
3.2.3 Enzymatische Umsetzung der Glucuronide und Sulfate
3.2.4 Überprüfung der Methode der Glucuronid- und Sulfatspaltung mittels p-Nitrophenol und dessen Konjugate
3.3 Aufarbeitung der Proben und Gewebe
3.3.1 Aufarbeitung der venösen Perfusionsproben
3.3.2 Aufarbeitung der luminalen Perfusionsproben
3.3.3 Aufreinigung des perfundierten Darmgewebes
3.3.4 Aufreinigung der Mesenterialgefäße
3.4 Vorversuche/ Zusatzversuche
3.4.1 Stabilität von Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid in luminaler Lösung
3.4.2 Stabilität von Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid gegenüber den Enzymen für die Glucuronid- und Sulfatspaltung bei 37 °C
3.4.3 Wiederfindung von Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid aus dem Darm
3.4.4 Überprüfung der Kontrollperfusionen auf Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid-Freiheit
3.5 Berechnungen und Statistik
3.5.1 Berechnung der Fluxe
3.5.2 Berechnung der Substrat-Konzentrationen
3.5.3 Statistische Auswertung

4 Ergebnisse
4.1 Viabilität
4.2 Kontrollperfusionen
4.3 Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid-Perfusionen
4.3.1 Darstellung der einzelnen C3G-Perfusionen
4.3.2 Darstellung der einzelnen C3G-EtOH-Perfusionen
4.4 Gesamtüberblick der Aufnahme an Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid in allen Perfusionen
4.5 Gesamtüberblick der Wiederfindung an Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid in allen Perfusionen
4.6 Gesamtaufnahme [%] aller Perfusionen mit Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid
4.7 Ergebnisüberblick
4.8 Histologische Befunde

5 Diskussion

6 Zusammenfassung

Literaturverzeichnis

Anhang

Tabellen

Tab.1.1: Antioxidative Wirkung von Anthocyanen in Abhängigkeit von der Anzahl der Hydroxylgruppen

Tab.3.1: Zusammensetzung der FC-43â- Emulsion

Tab.3.2: Zusammensetzung der luminalen Lösung in den Perfusionen

Tab.3.3: Zeitpunkte der Probenentnahmen und gemessene Parameter

Tab.3.4: Gradient während der HPLC-Analyse

Tab.3.5: Ergebnisse der Glucuronidspaltung von p-Nitrophenylglucuronid

Tab.3.6: Ergebnisse der Sulfatspaltung von p-Nitrophenylsulfat

Tab.3.7: Stabilität von C3G bei Raumtemperatur

Tab.3.8: Stabilität bei 37°C

Tab.3.9: Stabilität im Kühlschrank

Tab.3.10: Stabilität bei –70°C

Tab.3.11: Stabilität von C3G gegenüber b-Glucuronidase in luminaler und vaskulärer Lösung

Tab.3.12: Stabilität von C3G gegenüber b-Glucuronidase-Sulfatase in luminaler und vaskulärer Lösung

Tab.3.13: Wiederfindung von C3G aus dem Darm

Tab.4.1: Sauerstoff-Fluxe aller Perfusionen

Tab.4.2: Glucose-Fluxe aller Perfusionen

Tab.4.3: Lactat-Fluxe aller Perfusionen

Tab.4.4: Lactat-Pyruvat-Quotienten aller Perfusionen

Tab.4.5: Mittlere Werte für den Organdruck aller Perfusionen

Tab.4.6: Durchschnittliche arterielle pH-Werte aller Perfusionen

Tab.4.7: Durchschnittliche venöse pH-Werte aller Perfusionen

Tab.4.8: Durchschnittliche Rattengewichte

Tab.4.9: Durchschnittliche Darmtrockengewichte

Tab.4.10: C3G und Glucuronide im Lumen [nmol;%] in der 1.C3G-Perfusion

Tab.4.11: Venöse Aufnahme von C3G [nmol;%] in der 1.C3G-Perfusion

Tab.4.12: C3G, Glucuronide und Sulfate im Lumen [nmol;%] in der 2.C3G-Perfusion

Tab.4.13: Venöse Aufnahme von C3G, Glucuroniden und Sulfaten [nmol;%] in der 2.C3G-Perfusion

Tab.4.14: C3G und Glucuronide im Lumen [nmol;%] in der 3.C3G-Perfusion

Tab.4.15: Venöse Aufnahme von C3G und Glucuroniden [nmol;%] in der 3.C3G-Perfusion

Tab.4.16: Gesamtaufnahme [nmol] aller drei C3G-Perfusionen

Tab.4.17: Gesamtaufnahme [%] aller drei C3G-Perfusionen

Tab.4.18: C3G und Glucuronide im Lumen [nmol;%] in der 1.C3G-EtOH-Perfusion

Tab.4.19: Venöse Aufnahme von C3G und Glucuroniden [nmol;%] in der 1.C3G-EtOH-Perfusion

Tab.4.20: C3G im Lumen [nmol; %] in der 2.C3G-EtOH-Perfusion

Tab.4.21: Venöse Aufnahme von C3G und Glucuroniden [nmol;%] in der 2.C3G-EtOH-Perfusion

Tab.4.22: C3G im Lumen [nmol; %] in der 3.C3G-EtOH-Perfusion

Tab.4.23: Venöse Aufnahme von C3G [nmol; %] in der 3.C3G-EtOH-Perfusion

Tab.4.24: Gesamtaufnahme [nmol] aller drei C3G-EtOH-Perfusionen

Tab.4.25: Gesamtaufnahme [%] aller drei C3G-EtOH-Perfusionen

Tab.4.26: Gesamtaufnahme aller Perfusionen mit C3G in [%], n = 6

Tab.4.27: Gehalt an Cy-Konjugaten in Darm und Blutgefäßen

Abbildungen

Abb.1.1: C6-C3-C6-Körper der Flavonoide

Abb.1.2: Anthocyanidin-Struktur

Abb.1.3: Cyanidin

Abb.1.4: Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid

Abb.3.1: Ratte nach erfolgreicher Katheterisierung. Über den blauen Katheter erfolgte die arterielle Versorgung mit Perfusionsmedium, über den grünen der venöse Abfluss.

Abb.3.2: O2-Dissoziationskurve von Vollblut mit einem Hämatokrit von 45% und der FC-43®-Emulsion bei 37 °C (modifiziert nach [38]). Der Pfeil markiert die maximale O2-Freisetzung bei einem Abfall des O2-Partialdrucks von 500 auf 50 mm Hg.

Abb.3.3: Versuchkammer mit Vorratsgefäss mit Perfusionsmedium, Filmoxygenator, Schlauchpumpe, Manometer, Organbad mit Darm, Perfusor mit Glasspritze

Abb.3.4: Dünndarmpräparation im beheizten (37 °C) und feucht gehaltenen Organbad

Abb.3.5: HPLC-Anlage mit Pumpe und Eluentenflaschen, Autosampler, Säule, Messzelle, Detektor und Integrator

Abb.3.6: Standard mit C3G und Nar

Abb.3.7: Standard mit Cy und Nar

Abb.3.8: Eichgerade C3G für luminale Proben

Abb.3.9: Eichgerade C3G für venöse Proben

Abb.3.10: Probe von p-Nitrophenylglucuronid (RT=4,1) vor und nach der Glucuronidspaltung. Der Glucuronidpeak verschwindet, der Peak des p-Nitrophenols (RT=10,4) wird deutlich größer.

Abb.3.11: Das linke Chromatogramm zeigt einen p-Nitrophenol-Standard, das mittlere eine Probe von p-Nitrophenylsulfat vor der Sulfatspaltung, das rechte danach.

Abb.3.12: Stabilität von C3G in luminaler Lösung

Abb.4.1: Luminale Probe einer Kontrollperfusion ohne C3G

Abb.4.2: Venöse Probe einer Kontrollperfusion ohne C3G (rechter Peak ≈ Naringin)

Abb.4.3: C3G-Menge und Glucuronide in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 1.C3G-Perfusion

Abb.4.4: C3G-Menge in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 1.C3G-Perfusion

Abb.4.5: C3G-Menge, Glucuronide und Sulfate in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 2.C3G-Perfusion

Abb.4.6 C3G-Menge, Glucuronid und Sulfate in den venösen Proben im Verhältnis zum lum. Vorlauf in [%] in der 2.C3G-Perfusion

Abb.4.7: C3G-Menge und Glucuronide in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 3.C3G-Perfusion

Abb.4.8: C3G-Menge und Glucuronide in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 3.C3G-Perfusion

Abb.4.9: C3G-Menge und Glucuronide in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 1.C3G-EtOH-Perfusion

Abb.4.10: C3G-Menge und Glucuronide in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 1.C3G-EtOH-Perfusion

Abb.4.11: C3G-Menge in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 2.C3G-EtOH-Perfusion

Abb.4.12: C3G-Menge und Glucuronide in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 2.C3G-EtOH-Perfusion

Abb.4.13: C3G-Menge in den luminalen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 3.C3G-EtOH-Perfusion

Abb.4.14: C3G-Menge in den venösen Proben im Verhältnis zum luminalen Vorlauf in [%] in der 3.C3G-EtOH-Perfusion

Abb.4.15: Übersicht der C3G-Aufnahme für alle Perfusionen

Abb.4.16: Übersicht der C3G-Wiederfindung für alle Perfusionen

Abb.4.17: Venöse Probe einer C3G-Perfusion mit Spuren von Cyanidin (RT=19,639)

Abb.4.18: Darmgewebe nach Umsetzung mit b-Glucuronidase. Der C3G-Peak (RT~11,9) wird kleiner, Cy (RT~19,6) wird zunehmend gebildet.

Abb.4.19: Blutgefässe nach Umsetzung mit b-Glucuronidase und b-Glucuronidase-Sulfatase. C3G (RT~11,9) baut sich ab, der Peak des Cy (RT~19,1) wird größer.

Abb.4.20: Probe der Blutgefässe nach Zudotieren von Cy. Der Peak (RT=20,0) wurde deutlich größer.

Abb.4.21: Histologischer Schnitt der Darmmucosa, 100fache Vergrößerung. Exemplarisch wird hier deren Unversehrtheit gezeigt.

Anhang

Tab.1: Konzentrationen von Glucose, Pyruvat und Lactat der Kontrollperfusionen, n = 4

Tab.2: Konzentrationen von Glucose, Pyruvat und Lactat der C3G-Perfusionen, n = 3

Tab.3: Konzentrationen von Glucose, Pyruvat und Lactat der C3G-EtOH-Perfusionen,

Tab.4: Viabilitätsparameter der Kontrollperfusionen, n = 4

Tab.5: Viabilitätsparameter der C3G-Perfusionen, n = 3

Tab.6: Viabilitätsparameter der C3G-EtOH-Perfusionen, n = 3

Tab.7: Luminale Flussraten der Kontrollperfusionen

Tab.8: Luminale Flussraten der C3G-Perfusionen

Tab.9: Venöse Flussraten der Kontrollperfusionen

Tab.10: Venöse Flussraten der C3G-Perfusionen

Tab.11: Ratten- und Darmtrockengewichte der Kontrollperfusionen

Tab.12: Ratten- und Darmtrockengewichte der C3G-Perfusionen

Tab.13: Signifikanzwerte (T-Test), Vergleich der Kontroll-, C3G- und C3G-EtOH-Perfusionen

1 EINLEITUNG

Was macht Blüten und Früchte so farbenfroh? Wer schon einmal mit Anthocyanen gearbeitet hat, kann dies leicht erkennen, (u. a. an seinen Fingern beim Versuch ein Vorratsgläschen von Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid zu öffnen). Anthocyane sind eine Gruppe von chemisch verwandten, wasserlöslichen, blauen, violetten und roten Farbstoffen, die neben anderen Substanzen (Betalaine, Carotinoide) diese charakteristischen Färbungen hervorrufen [8]. Sie sind im Pflanzenreich weit verbreitet. Ihr Name wurde vom griechischen: anthos = Blüte und kyanos = blau abgeleitet [8].

1.1 Einordnung der Anthocyane

Anthocyane zählen zu den Flavonoiden, also den polyphenolischen Verbindungen [44]. Derzeit sind mehr als 8000 dieser polyphenolischen Verbindungen bekannt [6]. Als eine der wichtigsten Untergruppen werden die Flavonoide angesehen [6]. Sie alle fallen unter den Begriff der sekundären Pflanzenstoffe. Das heißt, sie werden im Sekundärstoffwechsel der Pflanze gebildet im Gegensatz zu den primären Pflanzenstoffen wie Kohlenhydrate, Proteine, Fette und Ballaststoffe, welche Produkte des Primärstoffwechsels der Pflanzen sind [44].

Als wichtige der bisher 13 definierten Untergruppen der über 5000 Flavonoide lassen sich neben den Anthocyanen Flavone, Flavonole, Flavanole, Flavanone, Catechine und Isoflavone nennen [6,22,42].

Natürlicherweise liegen Anthocyane als Glykoside vor. In der Regel sind an die Aglykone Monosaccharide gebunden, die sich mit verdünnten Säuren oder enzymatisch abspalten lassen [8]. Die Verwandtschaft von Glykosid und Aglykon drückt sich zumeist auch in ihren Namen aus (z. B. Cyanidin und Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid).

1.2 Vorkommen und tägliche Aufnahme von Flavonoiden

Reich an Flavonoiden sind Nahrungsmittel wie z. B. Zwiebeln, Grünkohl, Bohnen, Broccoli, Johannisbeeren, Tee, Weintrauben und Wein [6].

Cyanidin-3-Glycosid ist das am weitesten verbreitete Anthocyan im Pflanzenreich [25] und somit in Feldfrüchten, Bohnen, Früchten, Gemüse und Rotwein zu finden [39]. Für einen italienischen Rotwein ermittelte Ghiselli et al einen C3G-Gehalt von 38 mg/ L [12]. In einem kalifornischen Rotwein wurden z.B. 2,8 mg/ L C3G gefunden [4]. Die Gesamtphenolgehalte von Weißweinen beliefen sich auf 199- 242 mg/ L, für Rotweine lagen die Werte um das zehnfache höher (2057- 2567 mg/ L) [4].

Über die tägliche Aufnahme lässt sich nur schwer eine verlässliche Aussage treffen. Die Literaturwerte variieren stark. Die Angaben reichen von 2,6 mg Flavonoiden pro Tag gemessen in Finnland [17] bis zu 1 g/d, was der von Kühnau in den 70er Jahren aufgestellten Schätzung für die Flavonoid-Aufnahme in den USA entspricht [22]. Allerdings ist man sich heute weitgehend einig, dass letzterer Wert zu hoch gegriffen ist und begründet das, mit den unzureichenden Analysenmethoden zur damaligen Zeit [6]. Des Weiteren findet sich bei Hertog et al ein Wert von 23 mg/d. Als Quellen für die Flavonoide werden hierbei vor allem Tee, Zwiebeln und Äpfel angegeben [16].

1.3 Strukturen

Abb.1.1: C6-C3-C6-Körper Abb.1.2: Anthocyanidin-Struktur

der Flavonoide

Abb.1.3: Cyanidin Abb.1.4: Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid

1.4 Wirkung

Im Pflanzenreich spielen Flavonoide eine wichtige Rolle für den Schutz der Pflanze z. B. vor Schäden durch UV-Licht [45]. Möglicherweise schützen sie auch die tierische Zelle vor oxidativem Schaden [43].

Bedingt durch ihre Struktur können Flavonoide und somit auch Anthocyane Wasserstoffatome aus ihren phenolischen Hydroxyl-Gruppen abgeben und damit radikalische Sauerstoffverbindungen abfangen [4,5].

Freie Sauerstoffradikale verursachen Oxidationen von niedermolekularen Substanzen und von LDL [4].

Anthocyane sind wirkungsvolle Fänger von HO·, O2·-, ROO· und NO· [5]. Sie wurden allerdings lange Zeit nicht als physiologische Antioxidantien angesehen, da sie zwar in Säure stabil sind, aber unter neutralen Bedingungen leicht zerfallen [41].

In wässriger Phase ist die antioxidative Wirkung von der Anzahl und der Stellung der Hydroxylgruppen abhängig.

Tab.1.1: Antioxidative Wirkung von Anthocyanen in Abhängigkeit von der Anzahl der Hydroxylgruppen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Eine relativ starke Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale ist mit einer OH-Gruppen in 3`- und/ oder 4`- Position verbunden [5].

Anthocyanen werden außerdem entzündungshemmende und antimikrobielle Wirkungen nachgesagt sowie deren Beteiligung an der Verhinderung bzw. Unterdrückung von Thrombozytenaggregation und Tumorwachstum [23,25]. Somit geht man von einem protektiven Einfluß dieser Stoffe auf koronare Herzkrankheiten und Krebs aus [11,31,44].

Natürlich muß an dieser Stelle das „Französische Paradoxon“ erwähnt werden [4].

In epidemiologischen Untersuchungen konnten in Frankreich weniger Herz-Kreislauf-Erkrankungen und dadurch bedingte Todesfälle festgestellt werden als in anderen industrialisierten Ländern Europas und den USA, obwohl die bekannten Risikofaktoren für koronare Herz-Erkrankungen wie erhöhte Serumcholesterinspiegel, hoher Fettverzehr, Hypertonie, hoher Body-Mass-Index oder Rauchen nicht seltener zu finden sind. Diese paradoxe Beobachtung wird auf den vergleichsweise hohen Weinkonsum der Franzosen zurückgeführt. Wein enthält als wirksame Bestandteile Alkohol und phenolische Verbindungen [4]. Dabei ist nicht klar, welche und wie die Stoffe nun möglicherweise wirksam sind [10]. Ist Alkohol im Wein eine definierte, wenn auch in der Quantität schwankende Komponente, so gibt es doch erhebliche qualitative und quantitative Unterschiede bei den enthaltenen Phenolen bedingt durch Rebsorte, geographische Herkunft, Jahrgang und Gewinnung [4].

In vivo führt der Genuss von Rotwein zu einem Anstieg des antioxidativen Potentials im Blutplasma und zum Schutz von LDL- und Plasmalipide vor oxidativer Schädigung [4]. Allerdings ist hierfür der Wirkungsmechanismus der Weinphenole noch unklar.

In vitro führt der Entzug von Ethanol zu einer erheblichen Abnahme der antioxidativen Aktivität der Rotweine [4].

In Weißweinen finden sich weniger sowie auch andere phenolische Inhaltsstoffe als im Rotwein. Dies führte wiederum in vitro zu einer etwa 8- bis 18-mal geringeren antioxidativen Wirkung von Weißwein [4]. Im Gegensatz zu den nativen Weinen wurden für entalkoholisierte Weißweine überwiegend kleinere IC 50 – Werte (das ist die Menge Phenol, welche die LDL-Oxidation zu 50% hemmt) gefunden, was für den antioxidativ wirksamerer Phenole im Weißwein spricht [4].

Nicht bewiesen ist ein Einfluss auf die Thrombozytenaggregation durch Weinphenole [4]. Hierfür wird eher der Alkohol verantwortlich gemacht [31]. In Studien, die vornehmlich in den USA durchgeführt wurden, sah man einen ähnlichen Effekt von Bier oder Spirituosen auf das Vorkommen von koronaren Herzkrankheiten wie beim Wein. Dagegen spricht aber, dass in Großbritannien bzw. Irland weit mehr Erkrankungen am Herz-Kreislauf-System zu verzeichnen sind, wobei hier nicht der Alkohol- wohl aber der Weinkonsum geringer ist als beispielsweise in Frankreich [31].

So wird zumeist ein Vorteil von Wein vermutet, außerdem verbunden mit der Annahme eines positiven Effekts, wenn dieser wie oftmals der Fall zum Essen genossen wird [37]. Vermutlich kommt es zu einem günstigen Einfluss auf die postprandiale Hyperlipidämie [9] und zu einer Art Schutz, d. h. Minderung des Effekts der Nahrungsfette auf die Thrombozytenaggregation [31].

1.5 Absorption und Metabolismus von Flavonoiden/ Anthocyanen/ Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid

Was ist in unserer täglichen Nahrung an Flavonoiden enthalten? Wie wirken sie? Wie viel brauchen wir davon? Ist es der Alkohol im Wein, die Phenole oder ein Zusammenspiel beider Komponenten, was uns das französische Paradoxon erklären könnte? Vor allem interessiert uns jedoch, wie die Absorption funktioniert und wie viel von dem, was mit der Nahrung aufgenommen wird, tatsächlich biologisch verfügbar ist.

Bisher ist sehr wenig über die Absorption von Polyphenolen im Gastro-Intestinal-Trakt bekannt [6]. Einfache phenolische Strukturen, Flavonoide und Aglykone beispielsweise werden direkt im Dünndarm durch die Mucosa absorbiert [6]. Es gibt die Ansicht, dass die meisten Glykoside erst in den Dickdarm gelangen und dort durch Bakterien zu den Aglykonen hydrolysiert werden [6]. Dies wurde durch einen Versuch an keimfreien Ratten bestätigt, bei denen die Flavonoidglykoside im Faeces unverändert ausgeschieden wurden [6]. Im Colon würden die Aglykone durch das Darmepithel aufgenommen und/ oder in der Leber an Glucuronsäure oder Sulfat konjugiert und methyliert [6]. Konjugationen sind übliche Reaktionen, um Stoffe zu detoxifizieren, außerdem wird die Löslichkeit erhöht, was wichtig für die Exkretion in der Galle ist [45]. Einige Autoren gehen davon aus, dass Glykoside im Dünndarm unverändert absorbiert werden [18,19,25,40, Paganga]. Einige Glykoside (z.B. die des Quercetins) sowie Hydroxyzimtsäuren wie die Chlorogensäure können möglicherweise über Natrium-abhängige Transportsysteme absorbiert werden [45]. Einige Versuche belegen sogar eine bessere Absorption der Glykoside als der Aglykone [19,25,40]. Nach oraler Gabe von C3G an Ratten (0,9 mmol/ kg KGW) findet sich nach 30min ein Maximum im Plasma. Cy kann auch nach 4h nicht detektiert werden. Weiterhin wird nach 60 min eine 8-mal höhere Konzentration an Protocatechusäure (PC) festgestellt, welche eventuell durch den Abbau von Cy entsteht. Nach der Inkubation mit b-Glucuronidase und Sulfatase steigt der Gehalt an C3G, Cy und PC nicht, also wird davon ausgegangen, dass keine Glucuronide und Sulfate gebildet werden [40]. Auch in einer weiteren Studie steigt die Plasmakonzentration von C3G nach oraler Verabreichung. Und das sowohl bei Ratten als auch bei Menschen. Auch hier werden kein Cy wie auch keine Glucuronide und Sulfate gefunden [25].

1.6 Zielsetzung

Am nahezu physiologischen Modell des isoliert perfundierten Rattendünndarms soll die Absorption von C3G, einem phenolischen Weininhaltsstoff, untersucht werden. In einer ersten Versuchsreihe wird C3G in einer wässrigen Lösung luminal verabreicht. Danach wird in einer zweiten Versuchsreihe die Aufnahme von C3G bei Anwesenheit von Ethanol bestimmt.

Es sollen folgende Fragen geklärt werden:

- Wie viel C3G wird aufgenommen?
- Wird diese Aufnahme von Ethanol beeinflusst?
- Welche Metaboliten entstehen?

2 MATERIAL

2.1 Versuchstiere und Haltungsfutter

Sprague-Dawley Albinoratten, männlich, Alter am Perfusionstag: 45-50 Tage

Charles River Wiga GmbH, Sulzfeld, D

Altromin Kontrolldiät C 1000, sojaarm, enthält Casein, Maisstärke, Saccharose, Zellulose, Sonnenblumenöl; Nährstoffzusammensetzung im Anhang

Altromin GmbH & Co KG, Lage, D

2.2 Arzneimittel und Geräte für die Perfusionen

Xylazin 2% (Xylazinhydrochlorid, 20 mg Xylazin)

Medistar Arzneimittelvertrieb GmbH, Holzwickede, D

Narketan 10% (Ketaminhydrochlorid, 100 mg Ketamin/mL)

Chassot AG, Ravensburg, D

Heparin (10 000 I. E./ mL)

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D

Isofluran-Baxter

Baxter Deutschland GmbH, Unterschleissheim, D

Narkose-Ether

Riedel-de-Haën, Seelze, D

Dreiwegehähne DiscofixÒ-3

Perfusor Secura

B. Braun Melsungen AG, Melsungen, D

Mullbinden Pur-Zellin

Paul Hartmann AG, Heidenheim, D

Silikonschlauch (2,0 x 4,0) mm

Schlauch Laboflex, violett/weiß ID 2,79 mm

Mikropumpenschlauch, grün/grün ID 1,86 mm

Kronlab Chromatographie und Labortechnik GmbH, Sinsheim, D

Seide sterilisiert, schwarz 4/0 USP 1,5 metric

Tierärztebedarf J. Lehnecke, Schortens, D

Terumo NeolusÒ Kanülen 0,65 x 32 mm (violett), 0,40 x 20 mm (grau)

Surflo Katheter 1,3/G16 x 51 mm grau, 0,95/G18 x 51 mm grün, 0,85/G22 x 32 mm blau

Einmalspritzen, PlastipakÒ 1 ml, 5 mL

Operationsbesteck mit Scheren und Pinzetten

EHS Medizintechnik, Stuttgart, D

Rollenpumpe Minipuls 2

Gilson, Villiers le bel, F

Blutdruckmeßgerät Minimus 2 (Manometer)

Rudolf Riester, Jungingen, D

Organbad aus Polycarbonat

Werkstatt der Technischen Zentrale der Universität Hohenheim, D

pH- und Blutgasanalysator ABL 30 (Acid-Base-Analyzer)

Radiometer, Kopenhagen, DK

Haake-Thermostat

Haake-Meßtechnik GmbH & Co, Karlsruhe, D

Carbogen-Gas (95% O2 + 5% CO2)

Sauerstoffwerk Friedrichshafen GmbH, Friedrichshafen, D

Versuchskammer mit Ventilator, Thermostat und Thermofühler Pt-100

Firma Kästner, Hohenheim, D

Graduierte Reagenzgläser

Ganzglasspritze FortunaÒ, 50 mL

Merck Eurolab, Bruchsal, D

Kontroll-Messkolben mit Skala am Halsteil (50 ± 0,06 mL)

Hirschmann EM Ò Techcolor Germany

Kaskadenoxigenator aus Glas

Zinsstag, Stuttgart (Möhringen), D

Magnetrührer ICA Combimag RCO

2.3 Chemikalien

Alle verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel hatten, wenn nicht anders bezeichnet, analytische Reinheit (pro analysi) bzw. HPLC-Reinheit.

Zum Herstellen von Lösungen und Verdünnungen wurde ultrapures Wasser (16-18,2 MW) aus der Wasseraufbereitungsanlage verwendet.

Flavonoide/phenolische Säuren und andere phenolische Verbindungen :

Cyanidin-3-O-β-D-Glucosid Chlorid (= Kuromaninchlorid)

Cyanidin chlorid

Extrasynthèse, Genay, F

4-Nitrophenol

4-Nitrophenyl-b-D-glucuronid

4-Nitrophenylsulfat

Naringin (= Naringenin-7-rhamnoglucosid)

Fluka, Buchs, CH

weitere Chemikalien:

Helium 99,996 Vol.%

Sauerstoffwerk Friedrichshafen GmbH, Friedrichshafen, D

Dexamethason

Ethanol, denaturiert für die HPLC

Sigma, Steinheim, D

L-(+)-Ascorbinsäure >99,5%

Essigsäure Rotipuron® 100%

Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D

Acetonitril, LiChrosolv® gradient grade >99,9%

Methanol, LiChrosolv® >99,8%

Ameisensäure 98-100%

Calciumchlorid-Dihydrat

di-Natriumhydrogenphosphat

di-Kaliumhydrogenphosphat

Kaliumchlorid

Kaliumdihydrogenphosphat

L-Glutamin, > 99%

Magnesiumchlorid-Hexahydrat

Natriumacetat

Natriumchlorid

Natriumhydrogenphosphat

Natriumhydroxid Plätzchen

Perchlorsäure, 70%

Salzsäure rauchend 37%ig

E. Merck, Darmstadt, D

Perchlorsäure, 0,33 M

Boehringer Mannheim, Mannheim, D

Hydroxyethylstärke Mittelmolekular 200/0,5

Fresenius, Bad Homburg, D

Natriumhydrogencarbonat

D(+)-Glucose, > 99% (HPLC)

Fluka, Buchs, CH

Perfluorotri-n-butylamin (FC-43®, techn.)

ABCR GmbH & Co, Karlsruhe, D

Pluronic F-68®

BASF, Ludwigshafen, D

Die Universität Ulm übernahm freundlicherweise die Herstellung der 20%igen Perfluorotributylaminlösung mit 2,56% des Emulgators Pluronic F 68.

Enzyme und Enzymtestkits:

Lactat MPR 1

Fluorid/ EDTA

Pyruvat MPR 1

Glucose/ GOD-Perid®, Test-Kombination MPR 3

Roche Diagnostics, Mannheim, D

b-Glucuronidase (Escherichia coli) 1 400 000 Units/ g

b-Glucuronidase (Helix pomatia), 97 200 Units/ mL

Histologie:

Einbettmedium Tissue TekÒ O.C.T Ô Compound (mit Polyvinylchlorid und Carbowachs)

Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, NL

Mayers Hämalaunlösung

Eosin G

E. Merck, Darmstadt, D

Ethanol, vergällt

Alkoholvertrieb Süd GmbH, Horb-Betra, D

2.4 Geräte

Uvikon 930-Spektrophotometer

Kontron Instruments, Zürich, CH

Vortex-Genie

Merck Eurolab, Bruchsal, D

Elektronische Analysenwaage, Sartorius 3716 MP

Präzisionswaage 1712 MP8

Sartorius, Göttingen, D

Feinwaage Cahn C-3 Mikrobalance

Cahn Instruments, Cettitos, USA

Ultaschallbad Sonorex RK 255 H

Bandelin Electronic GmbH & Co KG, Berlin, D

Virtis Sentry Gefriertrockner

Virtis Company Inc., New York, USA

KontronÒ-Zentrifuge Hermle ZK 364 (max. 4000 rpm, 2800 x g)

Kontron Instruments, Zürich, CH

Tischzentrifuge Sigma 112 (14 300 rpm, 10 000 x g)

Sigma, Steinheim, D

Heizblock Techne Dri-Block® DB 2 P

Thermo-Dux GmbH, Wertheim, D

Wasseraufbereitungsanlage Elgastat Maxima, bestehend aus Umkehrosmose-, Aktivkohle- und Mischbettionenaustauscherkartusche sowie UV-Lampe

Elga Ltd., Lane End, GB

sonstige Hilfsmittel:

Halbmikroküvetten, 1,5 ml, PlastibrandÒ PMMA

Eppendorf-Reaktionsgefäße, 1,5 ml und 2 ml

Merck Eurolab, Bruchsal, D

Eppendorf-Pipetten

Eppendorf, Hamburg, D

Gilson-Pipette pipetman

Abimed, Langersfelden, D

Stoppuhr

Junghans, Schramberg, D

Autosampler-Vial N11, Braunglas und Weissglas

Aluminium-Verschlußkappe N11

Bischoff-Chromatography, Leonberg, D

Filter 4,5 µm ACROÔ LC13

Pall Gelman Sciences, Rossdorf, D

Pasteurpipetten

Zentrifugengläschen

Bechergläser und Erlenmayerkolben

HPLC-System:

Sykam S 2000 HPLC-Controller

Sykam S 1100 Pumpensystem

Sykam S 8110 Niederdruckgradientenmodul

Sykam GmbH, Gilching, D

Autoinjektor Marathon Basic +

Spark, Emmen, NL

Rheodyne Injection Valve 7010 mit 100 µl-Dosierschleife

Rheodyne, Cotati, USA

ESA Coulochem Model 5100 A, elektrochemischer Detektor mit

- Analytische Messzelle ESA Model 5110/ 5011 und

- Guard Cell ESA Model 5020

Max Stevenson Scientific Laborgeräte, Berlin, D

Spektroflow 757 UV/VIS Detektor

Kratos GmbH, Karlsruhe, D

Integratoren Chromatopac C-R5A

Shimadzu Corporation, Kyoto, J

RP-HPLC Trennsäulen:

Gromsil ODS-4 HE, 5 µm, (125 x 4) mm

Grom Analytik & HPLC GmbH, Herrenberg, D

Histologie:

Leica Frigocut 2800 E Mikrotom

Leica, Nussloch, D

Zeiss Axioplan Mikroskop

Kamera Zeiss 4560 70

Zeiss, Oberkochen, D

3 METHODEN

3.1 Die Dünndarmperfusion

3.1.1 Einführung und Technik

Der Begriff „Perfusion“ kommt aus dem Lateinischen und bedeutet „Durchströmung, z.B des Körpers oder einzelner Organe mit Flüssigkeit“ [30].

Für die Versuche dieser Arbeit wurde der Dünndarm von männlichen Sprague-Dawley-Ratten für die Perfusion präpariert. Die Tiere wurden nach Lieferung bis zum Versuchstag ca. 7 Tage mit Wasser und sojaarmen pelletiertem Futter ad libitum gehalten. Sojaarmes Futter deshalb, weil es weniger Störsignale bei der Analyse liefert als Altromin-Standard-Futter. Es enthält kaum Flavonoide und kein C3G, wie in unserem Labor nachgewiesen werden konnte.

Bei Versuchsbeginn waren die Ratten seit ca. 15-17 Stunden auf Nahrungsentzug und wogen dann zwischen 207-235 g.

Die Haltung der Tiere und die Durchführung der Versuche erfolgte gemäß den Richtlinien des geltende Tierschutzgesetzes vom 25.05.1998. Das Versuchsvorhaben wurde durch das Regierungspräsidium Stuttgart (A 171/ 99 BC) genehmigt.

Zum Narkotisieren der Tiere wurde nach einer leichten Ether- bzw. Isofluran-Betäubung eine Kombination aus Analgetikum/ Muskelrelaxans und Narkotikum intraperitoneal gesetzt. Dabei handelte es sich um Xylazin 2% (0,08 mL/ 100 g KGW) und Narketan (0,1mL/ 100 g KGW). Sobald die Narkosewirkung einsetzte, wurde die Ratte in Rückenlage auf einer Korkunterlage fixiert. Nach Freilegung der venae femoralis am linken Oberschenkel wurde die Blutgerinnung durch eine Heparininjektion (0,1 mL/100 g KGW; 1 mL=1000 I.E.) gehemmt.

Es folgte das Öffnen des Abdomens mit sagittalem Längs- und Querschnitt.

Um die Arteria mesenterica superior und die Pfortader katheterisieren zu können, wurden diese mit Fäden unterlegt, anschließend die Katheter eingeführt und mit den Fäden in den Gefäßen fixiert. Die Versorgung mit vaskulärem Perfusionsmedium mit einer Flußrate von 5mL/ min erfolgte über den Anschluß an der Arteria mesenterica superior, der venöse Abfluss über die Pfortader. Um den Dünndarm (mit Ausnahme der proximalen Hälfte des Duodenums) unabhängig vom Blutfluss des Tieres zu versorgen, wurden mehrere Ligaturen gelegt und der Enddarm, das Duodenum (nicht von der mesenterica versorgter Teil) und das Caecum abgetrennt. Zum Herauslösen des Dünndarms aus der Bauchhöhle war es erforderlich, weitere Schnitte kurz unterhalb des Magens (10 cm) und am Übergang zum Colon zu setzen und an der Mesenterialwurzel abzubinden, ohne dass dabei ein Leck entstand.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.3.1: Ratte nach erfolgreicher Katheterisierung. Über den blauen Katheter erfolgte die arterielle Versorgung mit Perfusionsmedium, über den grünen der venöse Abfluss.

Der freipräparierte Darm wurde nach Katheterisierung des Lumens mit 40 mL angewärmter physiologischer Kochsalzlösung und 20 mL Luft von Chymusresten befreit. Anschließend erfolgte die Überführung des isolierten Rattendünndarms in das beheizte, mit Kochsalzlösung befeuchtete Organbad. Dieses wurde mit Aluminiumfolie abgedeckt, um Flüssigkeitsverluste in der Kammer zu verhindern.

Nun wurde der Darm mit luminalem Perfusionsmedium gefüllt. Die Flussrate betrug 0,5mL/min. Über 60 Minuten erfolgten zu definierten Zeiten Entnahmen luminaler, venöser und arterieller Proben in graduierte Reagenzgläser bzw. Kölbchen.

Der gesamte Versuch wurde in einer geschlossenen Versuchskammer bei 37°C durchgeführt [14,15,20,36].

Um zu prüfen, ob die Darmmucosa unversehrt war und sich keine Zellen abgelöst haben, wurden histologische Schnitte angefertigt.

3.1.2 Perfusionsmedien

Das von uns verwendete Perfusionsmodell wurde von Hartmann et al. [14,15] übernommen. Er etablierte dieses Modell nach Kavin et al. und Windmueller et al. [14,15]. Neu war aber, dass nun statt künstlichem Plasma mit heparinisiertem oder defibrinisiertem Rattenblut ein künstlicher Sauerstoffträger verwendet wurde.

Vaskuläres Perfusionsmedium

Als vaskuläres Perfusionsmedium diente eine gepufferte Salzlösung (Krebs-Ringer-Bicarbonat) mit 20% Perfluorotributylamin als künstlichem Sauerstoffträger (FC-43â) und einem Polyoxypropylen-Copolymer (Pluronic F-68®) als Emulgator (Tab.3.1) [38].

Tab.3.1: Zusammensetzung der FC-43â- Emulsion

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

FC-43â kann Sauerstoff gleichmäßig aufnehmen und wieder abgeben. Das zeigt die in der Abbildung 3.2 dargestellte lineare Beziehung zwischen dem Sauerstoffpartialdruck und der gelösten Menge an Sauerstoff. Für Vollblut hingegen ergibt sich eine hyperbole Kurve.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.3.2: O2-Dissoziationskurve von Vollblut mit einem Hämatokrit von 45% und der

FC-43®-Emulsion bei 37 °C (modifiziert nach [38]). Der Pfeil markiert die maximale

O2-Freisetzung bei einem Abfall des O2-Partialdrucks von 500 auf 50 mm Hg.

Die FC-43â-Emulsion zeichnet sich außerdem durch eine kleine Partikelgröße (< 0,6 µm) sowie die chemische Inertheit aus.

Am Versuchstag wurden der Emulsion 0,25mg/L Dexamethason sowie 0,6mmol/L Glutamin zugesetzt. Dexamethason ist ein synthetisches, halogeniertes Glucocorticoid, welches die intestinale Glutamin- und Glucoseaufnahme zu regulieren scheint, in einer Studie die Glucoseaufnahme erhöhte. Neben Glucose ist Glutamin einer der wichtigsten Energielieferanten des Dünndarms [14,15,27,29,30].

Die fertige Lösung wurde auf einen pH-Wert von 7,3 eingestellt.

Luminales Perfusionsmedium

Je nach Art der Perfusion war die luminale Lösung (50 mL) wie folgt zusammengesetzt:

Tab.3.2: Zusammensetzung der luminalen Lösung in den Perfusionen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der pH-Wert dieser Lösung wurde auf 7,2 eingestellt.

3.1.3 Apparativer Aufbau des Perfusionsmodells

Der Perfusionsaufbau ist angelehnt an Schimasseks Methode für die isoliert perfundierte Leber [14,15].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb.3.3: Versuchkammer mit Vorratsgefäss mit Perfusionsmedium, Filmoxygenator, Schlauchpumpe, Manometer, Organbad mit Darm, Perfusor mit Glasspritze

[...]