Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade ist ein wichtiger Signaltransduktionsweg für die Regulation von Zellproliferation, Hypertrophie und Apoptose. Proliferation und Hypertrophie werden durch aktiviertes, dimeres ERK1/2, dessen Translokation in den Zellkern und Phosphorylierung von nukleären Zielproteinen vermittelt, wohingegen anti-apoptotische Effekte durch monomeres ERK1/2 im Zytoplasma ausgelöst werden. Für die Kinaseaktivität ist eine zweifache Phosphorylierung des TEY-Aminosäuremotivs von ERK1/2 durch MEK1/2 vonnöten. Lorenz et al. entdeckten eine Autophosphorylierung am Aminosäurerest Threonin 188 von ERK1/2, die durch Dimerisierung und anschließende Bindung der βγ-Untereinheiten von G-Proteinen ausgelöst wird und für die nukleäre Translokation des Dimers wichtig ist. Sie konnten außerdem zeigen, dass Interferenz mit dieser Autophosphorylierungsstelle die Hypertrophie von Mäuseherzen unterbinden kann. Ruppert et al. fanden heraus, dass diese Interferenz nur die pathologische Herzhypertrophie verhindert, während die physiologische Hypertrophie des Herzens sowie die anti-apoptotischen Effekte von monomerem, zytosolischem ERK1/2 dabei nicht beeinträchtigt wurden. Die hier beschriebenen Versuche zeigen, dass die Strategie, die Dimerisierung von ERK1/2 zu unterbinden, ebenso in der Proliferationshemmung von humanen Colon-Adenokarzinomzellen Anwendung finden kann. Die Zellen wurden mit einem Adenovirus transduziert, das ein Plasmid enthält, auf dem das Gen für ein Peptid liegt, welches an ERK1/2 binden kann. Die Proliferation dieser Zellen war signifikant geringer als die von lacZ-transduzierten Kontrollzellen. Die Proliferationsrate der Zellen wurde mit einem Tritium-Thymidin-Inkorporations-Assay bestimmt. Mithilfe von Western Blot Versuchen konnte nachgewiesen werden, dass die Transduktion mit Peptidoder Kontrollvirus die Phosphorylierung und Aktivierung von ERK1/2 durch MEK1/2 am TEY-Motiv, verglichen mit untransduzierten Zellen, nicht signifikant beeinflusst. Die Substanz PD98059 wurde als Positivkontrolle verwendet, um die ERK1/2-Phosphorylierung durch MEK-Inhibition zu verhindern. Die Ergebnisse dieses Versuchs bestätigen, dass das myc-ERK2309-357-Peptid die zytosolische Kinaseaktivität von ERK1/2 nicht hemmt. In einem präliminären Experiment wurde die Apoptoserate der Virus-transduzierten Zellen bestimmt. Dafür wurde ein lumineszenz-basierter Caspase-Nachweis-Assay durchgeführt.
Inhaltsverzeichnis
1 Abstract
2 Zusammenfassung
3 Einführung
3.1 Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade
3.2 Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade in der Krebsentstehung und -therapie
3.3 Fragestellung
4 Material und Methoden
4.1 Verbrauchsmaterialien
4.2 Zellen und Zellkultur
4.3 Western Blot
4.4 [³H]-Thymidin-Inkorporations-Assay
4.5 Caspase-Aktivitätsmessung
4.6 Statistik
5 Ergebnisse
5.1 Das myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷-Peptid kann die Proliferation der Colon-Karzinomzellen inhibieren
5.2 Das myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷-Peptid beeinflusst die Aktivität von ERK1/2 nicht
5.3 Vorversuche zeigen, dass das myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷-Peptid die anti-apoptotischen Effekte von ERK1/2 in Colo320 nicht beeinflusst
6 Diskussion
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht, ob die Störung der Dimerisierung der MAP-Kinasen ERK1/2 durch ein spezifisches Peptid (myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷) eine wirksame therapeutische Strategie zur Hemmung des proliferativen Wachstums von Colon-Karzinomzellen darstellen könnte, ohne dabei essentielle anti-apoptotische Funktionen zu beeinträchtigen.
- Mechanismen der Raf-MEK1/2-ERK1/2-Signalkaskade und deren Rolle in der Onkogenese.
- Einfluss des myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷-Peptids auf die Proliferation verschiedener Colon-Karzinom-Zelllinien.
- Analyse der ERK1/2-Phosphorylierung mittels Western Blot zur Bestimmung der Kinaseaktivität unter Peptid-Einfluss.
- Untersuchung von Apoptoseprozessen mittels Caspase-Assays zur Validierung der therapeutischen Selektivität.
Auszug aus dem Buch
3.1 Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade
Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade ist eine von mehreren ähnlich ablaufenden MAPK-(Mitogen-aktivierten Proteinkinase)-Kaskaden (YOON AND SEGER, 2006). Sie dient der Signalweiterleitung von Wachstumsfaktoren oder Hormonen von zellmembranständigen Rezeptoren zu den jeweiligen Effektorproteinen. Die Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade vermittelt auf diese Weise zelluläre Vorgänge wie beispielsweise Proliferation, Hypertrophie, Differenzierung, Überleben oder Apoptose (ZEHORAI et al., 2010).
In dieser Arbeit soll im Besonderen der Mechanismus der Dimerisierung und nukleären Translokation der extrazellulär regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) im Zusammenhang mit Zellproliferation genauer betrachtet und experimentell manipuliert werden. Bereits bekannt ist, dass sich ERK1/2 in ruhenden Zellen vor allem im Zytoplasma befindet (MURPHY AND BLENIS, 2006). Dort liegt es gebunden an zytoplasmatische Ankerproteine, wie zum Beispiel an die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen 1 und 2 (MEK1/2) (FUKUDA et al., 1997) oder an Scaffold-Proteine wie Sef1, Metalloprotease 1 (MP1) und Tubulin vor (TANOUE et al., 2000). MEK1/2 sind Proteinkinasen mit dualer Spezifität, die ERK1/2 an den Aminosäureresten Threonin (Thr) und Tyrosin (Tyr) (Reste 183 und 185 bei ERK2 von Mäusen) im TEY-Motiv in der Aktivierungsschleife phosphorylieren und dadurch aktivieren können (SEGER AND KREBS, 1995). Daraufhin vollzieht ERK1/2 eine starke Konformationsänderung und löst sich von seinen Ankerproteinen (WOLF et al., 2001). Durch anschließende Dimerisierung von ERK1/2 und Bindung der von Gq-abdissoziierten βγ-Untereinheiten sowie Autophosphorylierung von ERK2 an Thr188 (LORENZ et al., 2009a) translozieren etwa 60-70% der ERK-Moleküle in den Nukleus (CHEN et al., 1992). Die phosphorylierte Aktivierungsschleife von ERK1/2 kann Importin7 (Imp7) binden, welches dann ERK1/2 durch die Nukleoporine (NUPs) in den Zellkern eskortiert (ZEHORAI et al., 2010).
Zusammenfassung der Kapitel
1 Abstract: Bietet einen Überblick über die Rolle der Raf-MEK1/2-Kaskade und fasst die Ergebnisse der Arbeit zur Hemmung der Proliferation von Colon-Karzinomzellen durch das myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷-Peptid zusammen.
2 Zusammenfassung: Deutsche Zusammenfassung der theoretischen Grundlagen sowie der experimentellen Ergebnisse bezüglich des Einflusses des Peptids auf Proliferation, Kinaseaktivität und Apoptose.
3 Einführung: Erläutert die molekularen Grundlagen der Raf-MEK1/2-ERK1/2-Signalwege sowie die therapeutische Relevanz bei Krebserkrankungen und definiert die wissenschaftliche Fragestellung.
4 Material und Methoden: Beschreibt detailliert die verwendeten Zelllinien, Kultivierungsbedingungen, die Western Blot Analyse, den Thymidin-Inkorporations-Assay und die Caspase-Aktivitätsmessung sowie statistische Auswertungsverfahren.
5 Ergebnisse: Präsentiert die experimentellen Daten, die zeigen, dass das Peptid die Proliferation hemmt, jedoch die zytosolische ERK1/2-Aktivität und anti-apoptotische Effekte unbeeinflusst lässt.
6 Diskussion: Interpretiert die Ergebnisse im Kontext aktueller Forschung zur Krebsbekämpfung und diskutiert das Potenzial des Peptids als künftiges Therapeutikum sowie den Bedarf für weitere in vivo Studien.
Schlüsselwörter
Colon-Karzinom, Raf-MEK1/2-ERK1/2-Kaskade, myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷-Peptid, Zellproliferation, Dimerisierung, nukleäre Translokation, Apoptose, Western Blot, Thymidin-Inkorporations-Assay, Kinaseaktivität, Krebstherapie, Signaltransduktion, Signalkaskade, MAP-Kinasen, Tumorentwicklung.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser wissenschaftlichen Arbeit grundlegend?
Die Arbeit untersucht alternative Strategien zur Hemmung der Raf-MEK1/2-ERK1/2-Signalkaskade, um das unkontrollierte Zellwachstum bei Colon-Karzinomen zu unterdrücken.
Welche zentralen Themenfelder werden abgedeckt?
Die zentralen Felder umfassen die molekulare Signaltransduktion in Krebszellen, die Rolle der Dimerisierung von ERK1/2 sowie experimentelle Ansätze zur pharmakologischen Manipulation dieser Prozesse.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Das primäre Ziel ist es zu belegen, dass die Hemmung der ERK1/2-Dimerisierung durch ein spezifisches Peptid die Proliferation von Colon-Karzinomzellen reduziert, ohne dabei schützende anti-apoptotische Funktionen der Kinasen im Zytoplasma zu beeinträchtigen.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Es werden zellbiologische Methoden wie Zellkultur, Western Blot Analysen, radioaktive Inkorporations-Assays (Tritium-Thymidin) zur Proliferationsmessung sowie lumineszenzbasierte Caspase-Assays zur Apoptose-Bestimmung verwendet.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine fundierte theoretische Einführung, eine detaillierte Auflistung der verwendeten Materialien und methodischen Vorgehensweisen sowie die Auswertung und Präsentation der experimentellen Daten.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Untersuchung?
Wichtige Begriffe sind Colon-Karzinom, ERK1/2-Kaskade, Proliferationshemmung, Dimerisierung, nukleäre Translokation und therapeutische Targets.
Welche Bedeutung hat das myc-ERK2³⁰⁹⁻³⁵⁷-Peptid in den Versuchen?
Dieses Peptid dient als experimentelles Werkzeug, das durch die Bindung an ERK2 dessen Dimerisierung stören und damit gezielt die nukleäre Translokation verhindern soll.
Warum wird in der Arbeit auch die Apoptose-Aktivität gemessen?
Die Messung dient dazu sicherzustellen, dass die therapeutische Intervention nicht die überlebenswichtigen anti-apoptotischen Funktionen von zytosolischem ERK1/2 stört, was ein unerwünschter Nebeneffekt sein könnte.
- Arbeit zitieren
- Caroline Kohnle (Autor:in), 2015, Der Mechanismus der Dimerisierung und nukleären Translokation der extrazellulär regulierten Kinasen im Zusammenhang mit Zellproliferation, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/418171
