En la presente memoria de máster, se realiza un estudio de optimización y puesta a punto de diferentes técnicas inmunoquímicas para la detección y colocalización del péptido regulador neurotensina (NT) y su receptor (NTR) en células secretoras de la adenohipófisis de rata. Se estudia la expresión de NT y NTR en ratas macho y hembra a lo largo del desarrollo posnatal y en hembras adultas en, diferentes fases del ciclo estral, ovariectomizadas y ovariectomizadas con terapia hormonal de reemplazo. Se optimiza además, el protocolo experimental para el estudio de la coexistencia o colocalización de NT y NTR en los distintos tipos de células productoras de hormonas de la adenohipófisis. Por otra parte, se pone a punto la técnica de hibridación in situ no radiactiva para la detección del mARN del gen de la neurotensina/neuromedina N, y se discuten las particularidades, así como ventajas e inconvenientes de este tipo de técnicas en estudios de regulación neuroendocrina.
In the present master's thesis, an optimization study of different immunochemical techniques for the detection and colocalization of the neurotensin regulatory peptide (NT) and its receptor (NTR) in rat adenohypophysis is carried out. The expression of NT and NTR in male and female rats is studied throughout the postnatal development and in adult females rats in, different stages of the estrous cycle, ovariectomized and ovariectomized with hormone replacement therapy. The experimental protocol for the study of the colocalization of NT and NTR in the different hormone-producing cells of the adenohypophysis is also optimized. On the other hand, the technique of non-radioactive in situ hybridization for the detection of the mRNA of the neurotensin / neuromedin N gene is being developed, and the particularities, as well as advantages and disadvantages of this type of techniques are discussed in neuroendocrine regulatory studies.
Índice de contenidos
1. INTRODUCCIÓN
2.JUSTIFICACIÓN y OBJETIVOS
3. METODOLOGÍA
3.1. Inmunolocalización de células NT-ir, células FSH-ir y células TSH-ir en secciones de tejido.
3.1.1. Protocolo para la detección inmunoquímica de células NT-ir.
3.1.2 Protocolo de elución-retratamiento para la detección inmunoquímica de células FSH-ir/TSH-ir.
3.1.3. Protocolo de doble marcaje para la detección inmunoquímica simultánea de células NT-ir y FSH-ir.
3.1.4. Protocolo de doble marcaje para la detección inmunoquímica simultánea de células NTR-ir y FSH-ir.
3.1.5. Controles de especificidad de la reacción inmunohistoquímica.
3.1.6. Disoluciones para inmunohistoquímica.
4. Detección del mARN específico del gen de la neurotensina/neuromedina N en adenohipófisis de rata mediante hibridación in situ no radiactiva.
4.1. Protocolo para el marcaje de la sonda con Dig 11-dUTP.
4.2. Procesado de las secciones para hibridación in situ.
4.3. Controles de especificidad de la reacción de hibridación in situ
4.4. Disoluciones para hibridación in situ no radiactiva
5. RESULTADOS
5.1. Detección de células NT-ir en la adenohipófisis de rata durante el desarrollo posnatal.
5.2. Detección de células NT-ir en la adenohipófisis de rata adulta.
5.3. Detección de células NTR-ir en la adenohipófisis de rata adulta.
5.4. Detección del mARN del gen de la neurotensina/neuromedina N en la adenohipófisis de rata adulta.
6. DISCUSIÓN
7. CONCLUSIONES
8. BIBLIOGRAFÍA
Objetivos de la investigación y temas principales
El objetivo principal de este trabajo es la optimización y puesta a punto de técnicas inmunohistoquímicas y de hibridación in situ no radiactiva para detectar y localizar el péptido neurotensina (NT) y su receptor (NTR) en la adenohipófisis de rata, analizando su expresión bajo diversas condiciones experimentales.
- Optimización de protocolos de marcaje inmunohistoquímico simple y doble.
- Desarrollo de la técnica de hibridación in situ no radiactiva para mARN.
- Estudio del dimorfismo sexual y patrones de expresión de NT y NTR.
- Análisis de la colocación de NT con hormonas adenohipofisarias como TSH y FSH.
Auszug aus dem Buch
1.- INTRODUCCIÓN
La inmunohistoquímica es una técnica que permite localizar moléculas en los tejidos mediante utilizando para ello anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). La técnica, por la gran especificidad y alta afinidad que tiene los anticuerpos para reconocer moléculas y unirse a ellas, permite detectar cantidades ínfimas de moléculas presentes en el tejido. La inmensa mayoría de técnicas inmunohistoquímicas pueden aplicarse a tejido fijado e incluido en parafina o a criosecciones con buenos resultados, siempre que la fijación tisular, su procesado e inclusión se realicen se realicen de forma adecuada, ya que la utilización de métodos y reactivos inapropiados, puede producir pérdida total o parcial antigenecidad que limitarán e impedirán la obtención de resultados fiables.
Igualmente, para el procesado de secciones de tejido con técnicas de hibridación in situ, para la detección de moléculas específicas de ácido ribonucleico mensajero (mARN) mediante el uso de sondas, son aplicables los mismos fundamentos además del empleo de reactivos y material estéril, dada la labilidad de las moléculas de ácido ribonucleico (ARN).
Resumen de los capítulos
1. INTRODUCCIÓN: Presenta los fundamentos biológicos y técnicos de las técnicas inmunohistoquímicas y de hibridación in situ utilizadas para la detección molecular en tejidos.
2. JUSTIFICACIÓN y OBJETIVOS: Define la importancia de optimizar los métodos de detección génica y establece las metas experimentales del estudio.
3. METODOLOGÍA: Detalla exhaustivamente los protocolos experimentales, incluyendo la inmunolocalización, el uso de anticuerpos y la preparación de reactivos específicos.
4. Detección del mARN específico del gen de la neurotensina/neuromedina N en adenohipófisis de rata mediante hibridación in situ no radiactiva: Explica el procedimiento técnico para marcar sondas y detectar el mARN mediante hibridación sin radioactividad.
5. RESULTADOS: Expone los hallazgos experimentales sobre la distribución y presencia de células NT-ir y NTR-ir en la hipófisis de rata en distintas etapas.
6. DISCUSIÓN: Analiza la eficacia de las técnicas empleadas y su relevancia para el estudio de la regulación neuroendocrina.
7. CONCLUSIONES: Sintetiza los hallazgos principales y la utilidad de las metodologías desarrolladas.
Palabras clave
Inmunohistoquímica, hibridación in situ, neurotensina, adenohipófisis, rata, mARN, receptor NTR, FSH, TSH, regulación neuroendocrina, anticuerpos, péptidos, biología celular, marcaje, técnica experimental.
Preguntas frecuentes
¿Cuál es el propósito principal de esta investigación?
El estudio busca optimizar técnicas de inmunohistoquímica y hibridación in situ para detectar la presencia y distribución del péptido neurotensina y su receptor en la adenohipófisis de rata.
¿Qué campos temáticos abarca el trabajo?
Se centra en la biología neuroendocrina, específicamente en el estudio de péptidos reguladores y su expresión génica dentro de los tejidos de la glándula hipofisaria.
¿Cuál es la pregunta de investigación central?
Se intenta determinar cómo se expresan y co-localizan la neurotensina y su receptor con hormonas adenohipofisarias, y cómo varían estos patrones en diferentes condiciones fisiológicas.
¿Qué metodología científica se emplea?
Se utilizan técnicas de inmunoperoxidasa indirecta, sistemas de amplificación biotina-estreptavidina, técnicas de elución-retratamiento y hibridación in situ no radiactiva.
¿Qué se analiza en el cuerpo principal del texto?
Se describen detalladamente los protocolos experimentales, el procesamiento de tejido, la preparación de soluciones y los resultados de las observaciones microscópicas en ratas.
¿Qué palabras clave definen mejor este trabajo?
Inmunohistoquímica, neurotensina, adenohipófisis, mARN y hibridación in situ son términos esenciales para caracterizar la investigación.
¿Cómo se garantiza la especificidad de los resultados?
Mediante el uso de controles negativos, como la incubación sin anticuerpo o con sondas marcadas en exceso, descritos en los apartados 3.1.5 y 4.3.
¿Qué importancia tiene la elución-retratamiento?
Es fundamental para eliminar la primera reacción inmunohistoquímica y poder detectar dos o más moléculas diferentes en la misma célula de forma secuencial.
¿Cómo afecta el ciclo estral a la expresión de neurotensina?
El estudio observa variaciones drásticas en la cantidad de células NT-ir a lo largo de las distintas fases del ciclo estral en ratas hembras adultas.
¿Qué valor aporta el uso de hibridación no radiactiva?
Ofrece una alternativa altamente sensible y segura, permitiendo el estudio de la expresión de mARN a nivel tisular sin los riesgos asociados al uso de radioisótopos.
- Citar trabajo
- Doctor en Ciencias Biológicas y Doctor en Farmacia Ricardo Reyes Rodríguez (Autor), 1997, Optimización de técnicas inmunohistoquímicas y de hibridación in situ no radiactiva para la detección y colocalización del péptido neurotensina y su receptor en adenohipófisis de rata, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/427065
