Bestimmung von androgenen und antiandrogenen Substanzen in wässrigen Umweltproben mit biologischen und chemischen Methoden

Inhaltsverzeichnis

Vorwort

Abkürzungsverzeichnis

Zusammenfassung

1 Einleitung

2 Theoretischer Teil
2.1 Substanzen mit hormonartiger Wirkung
2.1.1 Androgene Substanzen
2.1.2 Antiandrogene Substanzen
2.1.3 Östrogene und Gestagene
2.2 Weitere Substanzen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden
2.2.1 Triphenylmethanderivate
2.2.2 a-Hexylzimtaldehyd
2.2.3 Tris(2-chlorethyl)-phosphat (TCEP)
2.2.4 Cortisol (Hydrocortison)
2.2.5 b-Sitosterol
2.3 Untersuchung auf (anti-)androgene Substanzen
2.3.1 Probenvorbereitung
2.3.2 Biologisches Screening
2.3.3 Chemische Spurenanalytik

3 Experimenteller Teil
3.1 Aufgabenstellung
3.2 Herstellung der verwendeten Lösungen
3.3 Biologische Analytik
3.3.1 Verschiedene allgemeine Methoden
3.3.2 Übertragung der Methode von Szelei et al. auf die hiesigen Laborbedingungen
3.3.3 Bestimmung der Abweichung innerhalb einer Zellkulturplatte
3.3.4 Übertragung auf 96-Well-Zellkulturplatten
3.3.5 Vergleich von Zellkulturplatten verschiedener Hersteller
3.3.6 Vergleich verschiedener Detektionsmethoden
3.3.7 Optimierung der Zellzahl und des Gehaltes an FBS im Kulturmedium
3.3.8 Vergleich zwischen Transferrin und Holo-Transferrin
3.3.9 Einfluss der Inkubationsdauer
3.3.10 Abweichung der Methode
3.3.11 Einfluss von Lösungsmitteln
3.3.12 Test verschiedener bekannter Antiandrogene
3.3.13 Konzentrations-Wirkungs-Kurve von Bicalutamid
3.3.14 Probenvorbereitung für wässrige Umweltproben
3.3.15 Zusammenfassung der Methode
3.3.16 Untersuchung von Einzelsubstanzen
3.3.17 Untersuchung von Umweltproben
3.4 Chemische Analytik
3.4.1 Entwicklung der GC/MS-Methode
3.4.2 Linearität
3.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze
3.4.4 Probenvorbereitung für Umweltproben
3.4.5 Wiederfindung
3.4.6 Zusammenfassung der Methode
3.4.7 Untersuchung von Umweltproben

4 Diskussion

5 Anhang
5.1 Massenspektren und Chromatogramme
5.1.1 5a-Androstane-3a,17b-diol
5.1.2 Androsteron
5.1.3 Etiocholan-3a-ol-17-on
5.1.4 Epiandrosteron
5.1.5 5a-Dihydrotestosteron
5.1.6 Testosteron
5.1.7 4-Androsten-3,17-dion
5.1.8 Methyltestosteron
5.1.9 b-Sitosterol
5.2 Verwendete Materialien
5.2.1 Geräte
5.2.2 Chemikalien
5.2.3 Verbrauchsmaterialien

6 Literaturverzeichnis

7 Lebenslauf

Vorwort

Die vorliegende Diplomarbeit wurde in der Zeit vom 15. März 1999 bis zum 15. September 1999 am Institut für Organische Chemie der Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Arbeitskreis Prof. Hagenmaier, durchgeführt.

Ermöglicht wurde das Anfertigen dieser Arbeit durch Herrn Prof. Hanspaul Hagenmaier, dem mein ganz besonderer Dank gebührt. Er hat mir dieses überaus interessante Thema zur Verfügung gestellt.

Zudem möchte ich mich besonders bei Herrn Dr. Wolfgang Körner für die sehr gute Betreuung der Diplomarbeit, die gute Zusammenarbeit und dafür, dass er sich immer viel Zeit für mich genommen hat, bedanken.

Des Weiteren gebührt ein besonderer Dank Herrn Dr. Kurt Grillenberger, der die Aufgabe des Referenten für die Diplomarbeit übernommen hat. Er brachte viel Interesse für das Themengebiet auf und hat seitens der Fachhochschule für ein unkompliziertes Gelingen der Arbeit gesorgt.

Einen großen Dank hat überdies Herr Dr. Winfried Schuller verdient, der mir immer mit zahlreichen fachlichen Ratschlägen zur Seite stand und stets für aufheiternde Momente sorgte, sowie Ulrike Bolz, die mich bei der chemischen Analytik sehr unterstützt hat.

Allen Mitarbeitern der ersten Etage des Medizinisch-Naturwissenschaftlichen Forschungszentrums möchte ich ebenfalls danken. Sie haben sehr zu einer angenehmen und heiteren Arbeitsatmosphäre und damit auch zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Abschließend danke ich allen Freunden, die mich beim Anfertigen der Diplomarbeit, wahrscheinlich oft ohne es zu wissen, unterstützt haben.

Ich hoffe, dass ich auch weiterhin viel Zeit mit all den netten Leuten verbringen kann, die ich während meiner Zeit in Tübingen kennen gelernt habe.

Hiermit versichere ich, dass diese Diplomarbeit von mir selbstständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe durchgeführt wurde.

Tübingen, den 15. September 1999

Stefan Spathelf

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Zusammenfassung

Zur Untersuchung von Substanzen und wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial wurde eine biologische Methode unter Verwendung von MCF-7 AR-1 Brustkrebszellen etabliert. Sie ist weitgehend spezifisch und unterliegt nur geringen Einflüssen durch Östrogene, Gestagene und Cortisol. Mit diesem Verfahren wurden die wichtigsten Testosteronmetabolite und verschiedene Substanzen, die bereits in wässrigen Umweltproben gefunden wurden, untersucht. Die Testosteronmetabolite zeigten alle eine gewisse, unterschiedlich ausgeprägte androgene Wirkung. Daneben konnte drei Triphenylmethanderivaten eine antiandrogene Wirkung nachgewiesen werden. Bei den anderen Einzelsubstanzen war keine eindeutige Wirkung feststellbar. Anschließend wurden verschiedene Wasserproben von Flüssen und Kläranlagen untersucht. Sämtliche Proben zeigten mehr oder weniger ausgeprägte androgene oder antiandrogene Effekte oder eine Kombination aus beiden. Eine Systematik war dabei nicht erkennbar.

Daraufhin wurde eine Methode zur chemischen Bestimmung von b-Sitosterol, Testosteron und dessen Metaboliten in obigen Proben entwickelt. Sie beruht auf einer Festphasenextraktion, anschließender Derivatisierung der Steroide zu den Trimethylsilylderivaten und Bestimmung mittels GC/MS. Die Methode eignete sich allerdings nicht zur Untersuchung der stärker verschmutzten Proben. In den auswertbaren Wasserproben konnten die Substanzen Androsteron, 5a-Androstane-3a,17b-diol, 5a-Dihydrotestosteron und b-Sitosterol detektiert werden. Die Konzentrationen der Testosteronmetabolite lagen jeweils bei etwa 300 ng/l (» 1×10-9 mol/l). Die Nachweisgrenzen in den Umweltproben lagen zwischen 5,9 und 34,6 ng/l (20–119 pmol/l).

1 Einleitung

In den letzten Jahren häufen sich Berichte über eine Zunahme von endokrinen Störungen bei Mensch und Tier, die unter anderem auf Substanzen natürlichen und synthetischen Ursprungs mit hormoneller Wirkung zurückgeführt werden. Es handelt sich dabei im Wesentlichen um Störungen der Geschlechtsdifferenzierung und Reproduktion bei verschiedenen Tieren. Außerdem wird angenommen, dass in diesen Substanzen eine Ursache für die in den letzten Jahrzehnten beobachtete deutliche Zunahme hormonabhängiger Krebserkrankungen in den Industrieländern liegt. Auch über eine durch diese Substanzen ausgelöste Abnahme der Spermienzahl beim Menschen wird spekuliert.

Die Forschung beschränkt sich derzeit weitgehend auf Substanzen mit östrogener Aktivität. So wurden in der Umwelt zahlreiche Substanzen gefunden, die ein östrogenes Potenzial aufweisen und aus unterschiedlichsten Quellen stammen. Dabei handelt es sich um von Mensch und Tier ausgeschiedene natürliche und synthetische Östrogene, Pflanzeninhaltsstoffe sowie Industriechemikalien.

Es ist zu erwarten, dass in der Umwelt nicht nur Östrogene, sondern auch andere endokrin wirksame Substanzen eine relevante Rolle spielen. So wurden in den letzten Jahren einige nichtsteroidale Umweltchemikalien mit antiandrogener Wirkung entdeckt.

Deshalb wird in der vorliegenden Diplomarbeit eine Methode zur In-vitro-Untersuchung von wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial etabliert. Als Basis für diesen Zellkulturtest dient die humane Brustkrebszelllinie MCF-7 AR-1. Mit Hilfe dieser Methode werden verschiedene Einzelsubstanzen und Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial hin untersucht.

Zur Spezifizierung und Quantifizierung von natürlichen Androgenen und deren wichtigsten Metaboliten in wässrigen Umweltproben wird ein Verfahren mittels GC/MS nach vorheriger Silylierung entwickelt und angewandt. [1, 2]

2 Theoretischer Teil

2.1 Substanzen mit hormonartiger Wirkung

2.1.1 Androgene Substanzen

Die einzige Verbindungsklasse mit androgenartiger Wirkung, die man bisher in der Umwelt nachgewiesen hat, sind die Tributylzinnverbindungen. Vom menschlichen und tierischen Organismus werden zahlreiche Androgene produziert, die über die Exkremente in die Umwelt gelangen. Sie wurden allerdings bisher noch nicht in Umweltproben detektiert. Auf die Wichtigsten wird im Folgenden eingegangen.

2.1.1.1 Tributylzinnverbindungen

Tributylzinnverbindungen werden vor allem als Biozide in Unterwasseranstrichen von Schiffen verwendet. Durch Auslaugen der Anstriche gelangen sie in Gewässer. Es besteht bereits ein Verbot dieser Substanzgruppe für Schiffe mit einer Gesamtlänge unter 25 Metern.

Bei zahlreichen Untersuchungen von Binnengewässern auf Tributylzinnverbindungen wurden diese in nahezu allen Proben gefunden.

Tributylzinn ist die einzige nicht-steroidale Substanz mit nachgewiesenem androgenen Potenzial. Neben zahlreichen toxischen Wirkungen induziert es bei weiblichen Vorderkiemer­schnecken die Ausbildung von männlichen Geschlechtsorganen.

Tributylzinn wirkt allerdings nicht wie andere androgene Verbindungen durch Bindung an den Androgenrezeptor. Es wird vermutet, dass Tributylzinn die Cytochrom-P450-abhängige Aromatase hemmt, die dafür verantwortlich ist, dass sich Testosteron zu 17b-Östradiol umsetzt, wodurch sekundär der Testosteronspiegel erhöht wird. [1]

2.1.1.2 Testosteron und Metabolite

Testosteron wird vor allem in den männlichen Keimdrüsen gebildet und stellt das wichtigste Androgen im menschlichen Körper dar. Männer produzieren etwa 7 mg und Frauen etwa 0,3 mg am Tag. Es bewirkt die Ausbildung der sekundären Geschlechtsmerkmale des Mannes und männlicher Tiere. Es fördert die Entwicklung der Muskulatur, des Knochenbaus, der roten Blutkörperchen und das Wachstum von Körperhaaren, Kehlkopf, Stimmbändern, Penis, Prostata und Samenblase. Testosteron ist unerlässlich für die Funktion der akzessorischen Geschlechtsdrüsen, für die Spermatogenese, für die Aufrechterhaltung von Potenz und Libido und auch der Aktivität, Aggressivität und Leistungsfähigkeit.

Der Abbau erfolgt auf dem folgenden Weg:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Metabolismus von Testosteron im menschlichen Körper

Die eigentlich wirksame Form von Testosteron ist das 5a-Dihydrotestosteron. Es wird in der Prostata durch Reduktion von Testosteron gebildet. Beim Abbau des Testosterons entsteht vor allem Androsteron und 5a-Androstan-3a,17b-diol. Daneben entstehen aber auch die Isomere Etiocholan-3a-ol-17-on und Epiandrosteron. Sämtliche Endprodukte des Testosteronabbaus kommen im menschlichen Urin vor. Des Weiteren konnte Androsteron im Urin von Stieren und trächtigen Kühen und Epiandrosteron im Urin von trächtigen Stuten nachgewiesen werden. [4, 6, 7]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Strukturformel von Etiocholan-3a-ol-17-on

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: Strukturformel von Epiandrosteron

Die androgene Aktivität wird in internationalen Einheiten (IU) angegeben, wobei 1 IU der Aktivität von 100 µg Androsteron entspricht.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Androgene Aktivität verschiedener Steroide [31]

2.1.1.3 Methyltestosteron

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 4: Strukturformel von Methyltestosteron

Methyltestosteron ist ein synthetisches Androgen. Da Testosteron in der Leber rasch metabolisiert wird, ist es bei oraler Gabe nur wenig wirksam. Durch Methylierung in 17a-Stellung wird die Oxidation zum inaktiven Keton vermieden. Somit wird durch diese Methylierung ein oral wirksames Androgen erhalten. [7]

2.1.1.4 Methyltrienolon (R 1881)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 5: Strukturformel von R 1881

Bei R 1881 handelt es ich um ein synthetisches Androgen. Es besitzt gegenüber natürlichen Androgenen den Vorteil, dass es nur schwer in inaktive Metabolite umgewandelt wird. Deshalb ist es für die Dauer von Experimenten stabil und wird oft als Standardsubstanz bei In-vivo- und In-vitro-Studien eingesetzt. [3, 17]

2.1.2 Antiandrogene Substanzen

In der Umwelt wurden bereits mehrere Substanzen gefunden, denen man durch Tierversuche verschiedene antiandrogene Wirkungen nachweisen konnte. Außerdem werden verschiedene Antiandrogene synthetisiert, von denen drei (Bicalutamid, Cyproteronacetat und Flutamid) in der Medizin Verwendung finden.

2.1.2.1 Umweltrelevante Antiandrogene

Linuron

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6: Strukturformel von Linuron

Linuron wird vor allem als selektives systemisches Herbizid gegen Unkräuter im Sojabohnen- und Kartoffelanbau eingesetzt. Es findet sich in vielen Fließgewässern.

Bei einer Gabe von Linuron an Ratten konnte eine Gewichtsreduktion der akzessorischen Geschlechtsorgane beobachtet werden. [1]

Vinclozolin und Metabolite

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Abbau von Vinclozolin

Vinclozolin ist ein selektives Kontaktfungizid. Es wird hauptsächlich zur Bekämpfung von Graufäule im Wein-, Gemüse-, Hopfen-, Erdbeer- und Zierpflanzenanbau eingesetzt.

An männlichen Ratten wurde unter Vinclozolingabe die Geschlechtsentwicklung in antiandrogener Art beeinflusst. Die Metabolite M1 und M2 zeigten unter gleichen Bedingungen eine wesentlich stärkere antiandrogene Wirkung als Vinclozolin. Daher wird vermutet, dass die Wirkung von Vinclozolin eventuell ausschließlich von den Metaboliten verursacht wird.

Vinclozolin konnte bei zahlreichen Gewässeruntersuchungen in nur einer Probe nachgewiesen werden. Über das Vorkommen der Abbauprodukte M1 und M2, die wasserlöslicher und stabiler als Vinclozolin sind, liegen bisher keine Untersuchungen vor. [1]

DDT und Metabolite

Das Insektizid p,p'-DDT wurde früher weltweit in großen Mengen verwendet. Auch heute noch wird es vor allem in tropischen Ländern zur Malariabekämpfung eingesetzt. Es tritt mittlerweile ubiquitär auf.

In mehreren unabhängigen Tierversuchen wurde p,p'-DDE, dem Hauptmetabolit von DDT, eine starke antiandrogene Wirkung nachgewiesen. Eine Rezeptorbindungsstudie zeigte, dass auch o,p'-DDT, p,p'-DDT und p,p'-DDD eine Androgenbindung inhibieren. Die Wirkung ist allerdings um etwa den Faktor 10 schwächer als die von p,p'-DDE. [1, 4]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 8: Strukturformel von p, p'-DDE

2.1.2.2 Klinisch relevante Antiandrogene

Antiandrogene werden in der Medizin beim Mann bei zu früh einsetzender Pubertät (Pubertas praecox), bei Prostatakarzinom und zur Dämpfung des Sexualtriebes sowie bei Androgenisierungserscheinungen der Frau eingesetzt. Sie wirken durch kompetitive Bindung an den Androgenrezeptor.

Der neueste antiandrogene Wirkstoff, der als Medikament zugelassen wurde, ist Bicalutamid (Handelsname: Casodex).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 9: Strukturformel von Bicalutamid

Seine Affinität zum Androgenrezeptor ist etwa viermal höher als von Hydroxyflutamid. Hydroxyflutamid ist der aktive Metabolit des Wirkstoffs Flutamid (Handelsname: Fugerel).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 10: Strukturformel von Flutamid

Eine vergleichende Studie zwischen Bicalutamid und Flutamid an 813 Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakarzinom kam zu dem Ergebnis, dass Bicalutamid wesentlich besser verträglich ist. Die Wirkung der beiden Medikamente war vergleichbar, wobei die Dosis bei täglich 50 mg Bicalutamid beziehungsweise 750 mg Flutamid lag.

Als drittes Medikament befindet sich Cyproteronacetat (Handelsname: Androcur) im Handel. [8, 9]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 11: Strukturformel von Cyproteron

2.1.3 Östrogene und Gestagene

2.1.3.1 17b-Östradiol

17b-Östradiol wird vor allem in den Follikeln des Eierstocks gebildet. Es ist das am stärksten wirksame menschliche Östrogen und steuert im Wesentlichen zusammen mit anderen Hormonen den Menstruationszyklus. [4, 8]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 12: Strukturformel von 17b-Östradiol

2.1.3.2 17a-Ethinylöstradiol

17a-Ethinylöstradiol ist ein oral wirksames, synthetisches Östrogen, das eine wesentlich größere Aktivität als 17b-Östradiol besitzt. Es wird deshalb in der Medizin bei verschiedensten Indikationen eingesetzt. [8]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 13: Strukturformel von 17a-Ethinylöstradiol

2.1.3.3 Progesteron

Progesteron ist das wichtigste Gestagen. Es wird hauptsächlich im Gelbkörper gebildet und beeinflusst zusammen mit den Östrogenen den Menstruationszyklus, wobei es gegenüber den Östrogenen teils antagonistisch, teils synergistisch wirkt. Während der Schwangerschaft findet die Produktion hauptsächlich in der Plazenta statt und dient dann vor allem der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft. [4, 8]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten Abbildung 14: Strukturformel von Progesteron

2.2 Weitere Substanzen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden

2.2.1 Triphenylmethanderivate

Über die Wirkung der Triphenylmethanderivate und deren Vorkommen in der Umwelt ist bisher nur wenig bekannt.

Tris(4-chlorphenyl)methanol (TCPM) / Tris(4-chlorphenyl)methan (TCPME)

TCPM ist wahrscheinlich ein Abbauprodukt von TCPME, das ein Nebenprodukt bei der Herstellung von DDT ist. Beide wurden in verschiedensten marinen Umweltproben in Konzentrationen von bis zu mehreren ppm gefunden. [28]

Triphenylmethanol (TPM)

Triphenylmethanol findet bei zahlreichen chemischen Synthesen Verwendung und ist Grundkörper der Triarylmethan-Farbstoffe. [4]

2.2.2 a-Hexylzimtaldehyd

a-Hexylzimtaldehyd wurde in mehreren süddeutschen Kläranlagenabläufen in Konzentrationen von etwa 10 µg/l (» 1,18 × 10-7 mol/l) nachgewiesen. Über seine Wirkung und sonstige Verbreitung in der Umwelt liegen bisher keine Daten vor. [26]

2.2.3 Tris(2-chlorethyl)-phosphat (TCEP)

Bei TCEP handelt es sich um ein Flammschutzmittel, dass kürzlich in Kläranlagenabläufen identifiziert wurde. Es tritt vermutlich ubiquitär auf, wobei für Deutschland noch keine Untersuchungen vorliegen. Die Produktion in Deutschland liegt bei 4000–5000 Tonnen pro Jahr. Bei Tierversuchen an Ratten konnte TCEP karnzerogene und neurotoxische Wirkung nachgewiesen werden. Für die Wirkung am Menschen liegen noch keine gesicherten Daten vor. Jedoch wurde 1998 ein Antrag zum Verbot auf EU-Ebene in verbrauchsnahen Produkten gestellt. [29]

2.2.4 Cortisol (Hydrocortison)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 15: Strukturformel von Cortisol

Cortisol ist ein kataboles Hormon, welches in der Nebennierenrinde gebildet wird. In der Medizin wird es vor allem bei entzündlichen Erkrankungen, als Antiallergikum und als Antirheumatikum eingesetzt. [8]

2.2.5 b-Sitosterol

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 16: Strukturformel von b-Sitosterol

b-Sitosterol ist das am meisten verbreitete pflanzliche Sterin. Es kommt in zahlreichen Pflanzen vor und ist ein wichtiger Rohstoff zur Herstellung von Steroiden wie Corticoiden, Östrogenen und anderen Sexualhormonen sowie von Kontrazeptiva. Da b-Sitosterol mit Cholester­in einen Komplex bildet, der die Darmwand nicht passieren kann, wird es als Lipidsenker zur Prophylaxe von Arteriosklerose und Hyperlipidämie sowie gegen Prostatabeschwerden eingesetzt. [4]

2.3 Untersuchung auf (anti-)androgene Substanzen

Zum Nachweis, ob eine Substanz beziehungsweise eine Umweltprobe eine androgen- oder antiandrogenartige Wirkung besitzt, bieten sich verschiedene biologische Verfahren an, wobei jeweils die Substanzen an einen Androgenrezeptor binden, welcher eine spezifische Wirkung induziert. Diese wird wiederum gemessen. Hiermit kann allerdings nicht festgestellt werden, welche speziellen Substanzen eines Stoffgemisches die Wirkung verursachen. Um dies herauszufinden und die Substanzen zu quantifizieren, müssen chemische Analysenmethoden eingesetzt werden.

Für die Untersuchung auf endokrine Effekte sind In-vivo-Verfahren prinzipiell am besten geeignet. Die dadurch gewonnenen Ergebnisse lassen sich am ehesten auf andere Lebewesen übertragen, da sie nicht nur von der androgenen Wirkung abhängen, sondern auch die verschiedenen pharmakokinetischen Einflüsse durch Aufnahme, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung beinhalten. Da Tierversuche aus ethischen Gründen minimiert werden sollten und hohen Kosten unterliegen, wird versucht, die Untersuchungen anhand von In-vitro-Tests durchzuführen. Dafür wurden, insbesondere zum Nachweis von östrogener Wirkung, verschiedene Testverfahren entwickelt. In-vitro-Testverfahren erlauben allerdings nur bedingt Aussagen über die Wirkung auf das endokrine System eines Lebewesens, da sie lediglich die Wirkung auf die für den Test verwendeten Zellen zeigen, woraus nur bedingt Rückschlüsse auf den Gesamtorganismus gezogen werden können.

Ein In-vitro-Test zur Untersuchung von Substanzen auf ihr androgenes Potenzial wurde von Szelei et al. [3] entwickelt.

Zum chemischen Nachweis von Steroiden wurden bereits verschiedene Methoden mittels GC/MS publiziert, wobei die Steroide zuvor meist silyliert werden, um ihren Siedepunkt herabzusetzen. Die Detektion mittels Massenspektroskopie bietet eine hohe Selektivität, die auf Grund der Vielfalt ähnlich gebauter Steroide benötigt wird.

Zusätzlich wird eine Methode benötigt, mit der die Steroide aus den wässrigen Umweltproben angereichert und gereinigt werden können. Hierzu bietet sich die Festphasenextraktion an, mittels derer bereits zahlreiche Methoden etabliert wurden.

2.3.1 Probenvorbereitung

Die Untersuchung von wässrigen Umweltproben auf Steroide erfordert eine Aufkonzentrierung und Reinigung der Proben, für die eine Festphasenextraktion am besten geeignet ist. Bei stark verschmutzten Proben kann man daran vor einer chemischen Analytik noch eine Reinigung mittels Säulenchromatografie anschließen. Es werden in der Literatur zahlreiche Methoden vorgestellt, von denen hier jeweils eine exemplarisch dargestellt wird.

Festphasenextraktion

Zur Festphasenextraktion von phenolischen Substanzen wurde von Bolz et al. [23] eine Methode entwickelt, die folgendermaßen durchgeführt wird:

Ein Liter der wässrigen Probe wird mit 5 ml Methanol versetzt und mit Natriumchlorid auf einen Salzgehalt von etwa 5 g/l eingestellt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes mit konzentrierter Schwefelsäure auf etwa 2–3 wird eine Festphasenextraktion durchgeführt, wofür Fertigkartuschen mit 200 mg ENV+ als Sorbens verwendet werden. Um grobe Verschmutzungen zurückzuhalten, wird das Sorbens mit silanisierter Glaswolle abgedeckt. Vor der Extraktion wird jede Säule mit 6 ml Aceton, 10 ml Methanol und 6 ml demineralisiertem Wasser, das zuvor mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wurde, konditioniert. Die Extraktion erfolgt mit einer Fließgeschwindigkeit von 10–15 ml/min.

Nach der Extraktion wird jede Kartusche mit 6 ml demineralisiertem Wasser (pH = 2) gewaschen, im Stickstoffstrom getrocknet und zweimal mit je 2,5 ml Ethylacetat eluiert.

Säulenchromatografie

Ebenfalls von Bolz [30] wurde eine Methode für steroidale Östrogene entwickelt, die eine zusätzliche Reinigung von Proben erlaubt.

Eine Pasteurpipette wird mit silanisierter Glaswolle abgedichtet und mit 1 g desaktiviertem Kieselgel gefüllt. Zur Desaktivierung versetzt man das Kieselgel mit 1,5 % Wasser und erhitzt es eine Stunde im Trockenschrank auf 75 °C. Die Kieselgelsäule wird mit 10 ml einer Mischung aus n-Heptan, Ethylacetat und Methanol im Verhältnis 6:2:2 konditioniert. Nach dem quantitativen Aufgeben der Probe eluiert man mit 5 ml selbiger Mischung.

2.3.2 Biologisches Screening

2.3.2.1 Der A-Screen Assay nach Szelei et al.

Der Test von Szelei et al. [3] beruht darauf, dass das Wachstum der verwendeten Brustkrebszellen MCF-7 AR-1 (siehe Kapitel 2.3.2.3) durch Androgene gehemmt wird. Sie fanden außerdem eine Möglichkeit, durch Verwendung eines serumfreien Mediums den Einfluss anderer Hormone auf das Zellwachstum zu minimieren. Es wird von Progesteron und 17b-Östradiol nicht beeinflusst und eine inhibierende Wirkung von Hydrocortison konnte erst bei hohen Konzentrationen (1×10-7 mol/l) festgestellt werden. Ein Einfluss auf das Wachstum durch die Antiandrogene Bicalutamid und Hydroxyflutamid wurde ebenfalls nicht festgestellt. Somit können gemessene Wirkungen weitgehend spezifisch auf androgene Substanzen zurückgeführt werden.

Die Methode wird folgendermaßen durchgeführt:

Die Zellen werden in 75 cm2 Kulturflaschen in Dulbecco´s MEM (DMEM) mit 5 % FBS kultiviert. Mittels Trypsin werden sie vom Boden der Kulturflaschen abgelöst und 40 000–50 000 Zellen/Well in 12 Well Zellkulturplatten (Costar) gegeben. Als Medium dient dazu wiederum DMEM mit 5 % FBS verwendet. Nach 24 Stunden wird das Medium entfernt, einmal mit phenolrotfreiem DMEM ohne FBS gespült und Experimentalmedium zugegeben. Als Experimentalmedium wird phenolrotfreies DMEM ohne FBS verwendet, das mit Insulin und Transferrin versetzt ist. In dieser Lösung werden zuvor außerdem die zu testenden Substanzen gelöst. Nach weiteren fünf Tagen werden die Zellen trypsiniert und mit einem Zellzähler gezählt. [3]

2.3.2.2 Die MCF-7 Zelllinie

Die MCF-7 Zelllinie wurde ursprünglich von Soule et al. [11] etabliert. Sie stammt von einem metastasierenden Adenokarzinom der Brust einer 69-jährigen hellhäutigen Patientin. Die Zellen wurden im Jahre 1970 entnommen, nachdem die Patientin längere Zeit mit einer Radiotherapie und Hormonen behandelt wurde. Bei der MCF-7 Zelllinie handelt es sich um eine stabile, gut erforschte Zelllinie, die in vielen Labors eingesetzt wird. Sie wächst adhärent und ist allgemein als östrogensensitiv anerkannt. Seit der Entnahme haben sich mehrere Zellstöcke mit verschiedenen Eigenschaften und verschiedener Östrogensensitivität gebildet. Die Zelle enthält etwa 100 pmol/g Protein Östrogenrezeptoren und 40 pmol/g Protein Androgenrezep­toren. [2, 11, 12, 13]

2.3.2.3 Die MCF-7 AR-1 Zelllinie

Zu Herstellung der MCF-7 AR-1 Zelllinie wurde MCF-7 Zellen das Gen des humanen Androgenrezeptors transfiziert. Dadurch wurde erreicht, dass der Androgenrezeptor verstärkt expremiert wird. Die entstandenen Zellen sind stabil und enthalten etwa 92 pmol/g Protein Androgenrezeptoren im Gegensatz zu 40 pmol/g Protein bei den MCF-7 Zellen. Dadurch werden die Zellen empfindlicher gegenüber dem Einfluss von Androgenen, durch die eine Inhibierung des Wachstums bewirkt wird. [3]

2.3.2.4 Der Androgenrezeptor

Sämtliche Steroidhormonrezeptoren besitzen die gleiche Grundstruktur (siehe Abbildung 17).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 17: Allgemeine Struktur eines Steroidhormonrezeptors
a: N-terminales Ende
b: DNA-Bindungsdomäne
c: Ligandenbindungsdomäne.

Der menschliche Androgenrezeptor besteht aus 910 bis 919 Aminosäuren und hat ein Molekulargewicht von 110 bis 114 kDa. Die unterschiedliche Anzahl von Aminosäuren resultiert aus einer unterschiedlichen Menge von L-Glutamin im N-terminalen Ende.

Er ist in der Kernmembran lokalisiert. Bei Aktivierung bindet er mit seiner DNA-Bindungsdomäne an bestimmte DNA-Sequenzen und löst dadurch die Transkription von Genen aus. [27]

2.3.2.5 Transferrin

Transferrin ist in menschlichem und tierischem Serum enthalten. Es handelt sich dabei um ein in seiner Zusammensetzung tierartspezifisches Glykoprotein. Seine biologische Funktion besteht in der Eisenübertragung in die Zelle. Es kann dazu zwei Eisen(III)-Ionen reversibel binden. Eisengesättigtes Transferrin (Holo-Transferrin) wird durch Endozytose in die Zellen aufgenommen und gibt dort das Eisen ab. Dieses eisenfreie Transferrin (Apo-Transferrin) gelangt durch Exozytose wieder in die extrazelluläre Flüssigkeit.

Transferrin wird zum Wachstum von Zellen in serumfreien Medien neben Insulin benötigt. [22, 4]

2.3.2.6 Detektionsmethoden

Um am Ende eines Versuches die Zellzahl zu bestimmen, bestehen verschiedene Möglichkeiten. Die Zellzählung mittels eines Zellzählers, wie er von Szelei et al. [3] verwendet wurde, ist relativ aufwändig und die apparative Einrichtung hierfür ist im hiesigen Labor nicht vorhanden. Als Alternativen existieren verschiedene Farbreaktionen, wobei die Extinktion der dabei erhaltenen Lösungen fotometrisch bestimmt wird. Die verbreitetsten Verfahren sind im Folgenden näher erläutert.

Alamar Blue

Alamar Blue ist ein Redoxindikator, der in die Zellen aufgenommen und dort durch FMNH2, FADH2, NADH, NADPH und die Cytochrome reduziert wird. Dadurch wechselt er seine Farbe von blau nach rot. Außerdem ermöglicht er eine Fluoreszenzdetektion, da die reduzierte Form im Gegensatz zur oxidierten fluoresziert. Der Farbstoff ist weitgehend ungiftig und die Durchführung benötigt etwa 4,5 Stunden. [14]

Elisa mittels 5-Brom-2´-desoxy-uridin (BrdU)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 18: Strukturformel von BrdU

Die Zellen werden mit BrdU versetzt, das sich im Laufe mehrerer Stunden in neu gebildete DNA einlagert. Daraufhin werden die Zellen fixiert und mit einer Nuclease-Lösung versetzt, wodurch die DNA teilweise gespalten und das BrdU wieder freigesetzt wird. Nun gibt man einen peroxidasemarkierten Antikörper zu, der sich an das BrdU bindet. Ein daraufhin zugesetztes Peroxidase-Substrat wird unter Katalyse der Peroxidase zersetzt. Das dabei entstehende grüne Produkt wird fotometrisch bestimmt. Die gesamte Bestimmung dauert etwa 7–8 Stunden. [15]

MTT

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 19: Strukturformel von MTT

Die Funktion des MTT-Assays beruht darauf, dass das gelbe Tetrazoliumsalz 3-(4,5-Di-methyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) nach der Aufnahme in die Zellen durch die mitochondriale Succinat-Dehydrogenase zum blauen und unlöslichen MTT-Formazan reduziert wird. Dieses kann fotometrisch bestimmt werden. Der Zeitaufwand für das Verfahren beträgt etwa 2,5 Stunden. [2, 14]

Sulforhodamin B

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 20: Strukturformel von Sulforhodamin B

Sulforhodamin B geht mit anionischen Resten von Makromolekülen der Zelle elektrostatische Bindungen ein. Der gebundene Farbstoff wird daraufhin mit Trispufferlösung wieder aus der Zelle gelöst und fotometrisch bestimmt. Man benötigt für die gesamte Bestimmung etwa drei Stunden. [20]

2.3.2.7 Statistik

Relative Extinktion

Unter der relativen Extinktion wird die Extinktion einer Probe im Verhältnis zur Extinktion der hormonfreien Kontrolle verstanden. Sie ermöglicht eine Aussage über die Stärke einer Inhibierung oder Stimulation der Zellproliferation durch eine Testsubstanz.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gleichung 1: Berechnung der relativen Extinktion

Relativer antiandrogener Effekt

Um die Stärke einer antiandrogenen Wirkung darzustellen, wird der relative antiandrogene Effekt (RAAE) berechnet. Dieser ergibt sich aus folgender Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gleichung 2: Berechnung des RAAE

Der relative antiandrogene Effekt gibt an, wie viel Prozent einer androgenen Wirkung durch ein Antiandrogen aufgehoben werden.

Berechnung der Standardabweichung

Um eine Aussage über die Abweichung mehrerer Einzelmessungen voneinander zu machen, wird die Standardabweichung berechnet. Sie ist ein Maß dafür, wie stark die Einzelwerte um den Mittelwert streuen. Die Berechnung erfolgt nach folgender Gleichung:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Gleichung 3: Formel zur Berechnung der Standardabweichung

n = Anzahl der Messungen

x = Messwerte

Die Standardabweichung wird in den Abbildungen grafisch dargestellt.

Unter der prozentualen Standardabweichung wird die prozentuale Höhe der Standardabweichung vom Mittelwert verstanden.

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