Zur Untersuchung von Substanzen und wässrigen Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial wurde eine biologische Methode unter Verwendung von MCF-7 AR-1 Brustkrebszellen etabliert. Sie ist weitgehend spezifisch und unterliegt nur geringen Einflüssen durch Östrogene, Gestagene und Cortisol. Mit diesem Verfahren wurden die wichtigsten Testosteronmetabolite und verschiedene Substanzen, die bereits in wässrigen Umweltproben gefunden wurden, untersucht. Die Testosteronmetabolite zeigten alle eine gewisse, unterschiedlich ausgeprägte androgene Wirkung. Daneben konnte drei Triphenylmethanderivaten eine antiandrogene Wirkung nachgewiesen werden. Bei den anderen Einzelsubstanzen war keine eindeutige Wirkung feststellbar. Anschließend wurden verschiedene Wasserproben von Flüssen und Kläranlagen untersucht. Sämtliche Proben zeigten mehr oder weniger ausgeprägte androgene oder antiandrogene Effekte oder eine Kombination aus beiden. Eine Systematik war dabei nicht erkennbar.
Daraufhin wurde eine Methode zur chemischen Bestimmung von β-Sitosterol, Testosteron und dessen Metaboliten in obigen Proben entwickelt. Sie beruht auf einer Festphasenextraktion, anschließender Derivatisierung der Steroide zu den Trimethylsilylderivaten und Bestimmung mittels GC/MS. Die Methode eignete sich allerdings nicht zur Untersuchung der stärker verschmutzten Proben. In den auswertbaren Wasserproben konnten die Substanzen Androsteron, 5α-Androstane-3α,17β-diol, 5α-Dihydrotestosteron und β-Sitosterol detektiert werden. Die Konzentrationen der Testosteronmetabolite lagen jeweils bei etwa 300 ng/l (≈ 1⋅10-9 mol/l). Die Nachweisgrenzen in den Umweltproben lagen zwischen 5,9 und 34,6 ng/l (20–119 pmol/l).
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
2 THEORETISCHER TEIL
2.1 Substanzen mit hormonartiger Wirkung
2.1.1 Androgene Substanzen
2.1.2 Antiandrogene Substanzen
2.1.3 Östrogene und Gestagene
2.2 Weitere Substanzen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurden
2.2.1 Triphenylmethanderivate
2.2.2 α-Hexylzimtaldehyd
2.2.3 Tris(2-chlorethyl)-phosphat (TCEP)
2.2.4 Cortisol (Hydrocortison)
2.2.5 β-Sitosterol
2.3 Untersuchung auf (anti-)androgene Substanzen
2.3.1 Probenvorbereitung
2.3.2 Biologisches Screening
2.3.3 Chemische Spurenanalytik
3 EXPERIMENTELLER TEIL
3.1 Aufgabenstellung
3.2 Herstellung der verwendeten Lösungen
3.3 Biologische Analytik
3.3.1 Verschiedene allgemeine Methoden
3.3.2 Übertragung der Methode von Szelei et al. auf die hiesigen Laborbedingungen
3.3.3 Bestimmung der Abweichung innerhalb einer Zellkulturplatte
3.3.4 Übertragung auf 96-Well-Zellkulturplatten
3.3.5 Vergleich von Zellkulturplatten verschiedener Hersteller
3.3.6 Vergleich verschiedener Detektionsmethoden
3.3.7 Optimierung der Zellzahl und des Gehaltes an FBS im Kulturmedium
3.3.8 Vergleich zwischen Transferrin und Holo-Transferrin
3.3.9 Einfluss der Inkubationsdauer
3.3.10 Abweichung der Methode
3.3.11 Einfluss von Lösungsmitteln
3.3.12 Test verschiedener bekannter Antiandrogene
3.3.13 Konzentrations-Wirkungs-Kurve von Bicalutamid
3.3.14 Probenvorbereitung für wässrige Umweltproben
3.3.15 Zusammenfassung der Methode
3.3.16 Untersuchung von Einzelsubstanzen
3.3.17 Untersuchung von Umweltproben
3.4 Chemische Analytik
3.4.1 Entwicklung der GC/MS-Methode
3.4.2 Linearität
3.4.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze
3.4.4 Probenvorbereitung für Umweltproben
3.4.5 Wiederfindung
3.4.6 Zusammenfassung der Methode
3.4.7 Untersuchung von Umweltproben
4 DISKUSSION
5 ANHANG
5.1 Massenspektren und Chromatogramme
5.1.1 5α-Androstane-3α,17β-diol
5.1.2 Androsteron
5.1.3 Etiocholan-3α-ol-17-on
5.1.4 Epiandrosteron
5.1.5 5α-Dihydrotestosteron
5.1.6 Testosteron
5.1.7 4-Androsten-3,17-dion
5.1.8 Methyltestosteron
5.1.9 β-Sitosterol
5.2 Verwendete Materialien
5.2.1 Geräte
5.2.2 Chemikalien
5.2.3 Verbrauchsmaterialien
Zielsetzung & Themen
Ziel der Arbeit ist die Etablierung einer In-vitro-Methode zur Untersuchung wässriger Umweltproben auf ihr androgenes und antiandrogenes Potenzial unter Verwendung der humanen Brustkrebszelllinie MCF-7 AR-1, kombiniert mit einer GC/MS-Analytik zur Quantifizierung natürlicher Androgene.
- Etablierung und Optimierung biologischer Testsysteme für endokrine Wirkungen
- Analyse von Einzelsubstanzen und Umweltproben mittels Zellkulturtest
- Entwicklung einer GC/MS-Methode zur Identifizierung und Quantifizierung von Steroiden
- Evaluierung von Testparametern wie Inkubationsdauer und Zellzahl
- Untersuchung von Wasserproben aus Flüssen und Kläranlagen
Auszug aus dem Buch
2.3.1 Probenvorbereitung
Die Untersuchung von wässrigen Umweltproben auf Steroide erfordert eine Aufkonzentrierung und Reinigung der Proben, für die eine Festphasenextraktion am besten geeignet ist. Bei stark verschmutzten Proben kann man daran vor einer chemischen Analytik noch eine Reinigung mittels Säulenchromatografie anschließen. Es werden in der Literatur zahlreiche Methoden vorgestellt, von denen hier jeweils eine exemplarisch dargestellt wird.
Festphasenextraktion
Zur Festphasenextraktion von phenolischen Substanzen wurde von Bolz et al. [23] eine Methode entwickelt, die folgendermaßen durchgeführt wird:
Ein Liter der wässrigen Probe wird mit 5 ml Methanol versetzt und mit Natriumchlorid auf einen Salzgehalt von etwa 5 g/l eingestellt. Nach dem Einstellen des pH-Wertes mit konzentrierter Schwefelsäure auf etwa 2–3 wird eine Festphasenextraktion durchgeführt, wofür Fertigkartuschen mit 200 mg ENV+ als Sorbens verwendet werden. Um grobe Verschmutzungen zurückzuhalten, wird das Sorbens mit silanisierter Glaswolle abgedeckt. Vor der Extraktion wird jede Säule mit 6 ml Aceton, 10 ml Methanol und 6 ml demineralisiertem Wasser, das zuvor mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt wurde, konditioniert. Die Extraktion erfolgt mit einer Fließgeschwindigkeit von 10–15 ml/min.
Nach der Extraktion wird jede Kartusche mit 6 ml demineralisiertem Wasser (pH = 2) gewaschen, im Stickstoffstrom getrocknet und zweimal mit je 2,5 ml Ethylacetat eluiert.
Zusammenfassung der Kapitel
1 EINLEITUNG: Darstellung der Problematik endokriner Störungen in der Umwelt und Definition des Forschungsziels dieser Diplomarbeit.
2 THEORETISCHER TEIL: Erläuterung der hormonellen Wirkungsmechanismen von Androgenen, Antiandrogenen sowie weiteren Umweltchemikalien und Vorstellung der verwendeten Untersuchungsmethoden.
3 EXPERIMENTELLER TEIL: Detaillierte Dokumentation der Methodenentwicklung für biologische Zelltests und chemische Spurenanalysen, inklusive der Ergebnisse aus Probenuntersuchungen.
4 DISKUSSION: Zusammenfassende Bewertung der entwickelten Methoden sowie Interpretation der gewonnenen Ergebnisse hinsichtlich Umweltrelevanz und zukünftiger Forschungsansätze.
5 ANHANG: Zusammenstellung der Massenspektren, Chromatogramme und der verwendeten Laborgeräte und Chemikalien.
Schlüsselwörter
Androgene, Antiandrogene, Umweltproben, MCF-7 AR-1, GC/MS, Steroide, Hormonwirkung, Zellkulturtest, Festphasenextraktion, Bicalutamid, endokrine Störungen, Wasseranalyse, Probenvorbereitung, Testosteron, β-Sitosterol.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit?
Die Diplomarbeit untersucht das androgene und antiandrogene Potenzial von Substanzen in wässrigen Umweltproben unter Verwendung biologischer und chemischer Analysemethoden.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Im Zentrum stehen hormonwirksame Substanzen, deren Detektion in der Umwelt sowie die Entwicklung verlässlicher Testmethoden zur Identifizierung dieser Stoffe.
Welches ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das Hauptziel ist die Etablierung eines zuverlässigen In-vitro-Screenings mittels MCF-7 AR-1 Zellen sowie einer GC/MS-Methode zur quantitativen Bestimmung von Androgenen und deren Metaboliten.
Welche wissenschaftliche Methode wird verwendet?
Es werden biologische Zellkulturtests für das Screening und Gaschromatografie mit Massenspektrometrie (GC/MS) für die chemische Spezifizierung und Quantifizierung eingesetzt.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil beschreibt die methodische Entwicklung, die Optimierung der Testbedingungen (z.B. Zellzahl, Inkubationsdauer) und die Anwendung dieser Verfahren auf Umweltproben wie Flusswasser und Kläranlagenabläufe.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit lässt sich durch Begriffe wie Endokrine Disruptoren, Steroidanalytik, Zellproliferations-Assay und Umweltmonitoring beschreiben.
Warum wird Bicalutamid in den Versuchen eingesetzt?
Bicalutamid dient als spezifisches Antiandrogen, um bei beobachteter Wachstumshemmung zu überprüfen, ob diese tatsächlich durch androgene Substanzen verursacht wurde (kompetitive Hemmung).
Welche Bedeutung haben die Ergebnisse für Kläranlagen?
Die Untersuchung der Zu- und Abläufe zeigt, dass viele androgene Substanzen zwar im Klärprozess entfernt werden, die Arbeit jedoch die Notwendigkeit unterstreicht, endokrin wirksame Stoffe durch weiterführende Stufen wie Aktivkohlefilter besser zu eliminieren.
- Quote paper
- Stefan Spathelf (Author), 1999, Bestimmung von androgenen und antiandrogenen Substanzen in wässrigen Umweltproben mit biologischen und chemischen Methoden, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/43488
