Molekulare Mechanismen des Lymphozytenhomings bei Typ 1 Diabetes: b-Zell spezifische Noxen führen zu einer funktionell relevanten Expression von Adhäsionsmolekülen im endokrinen Pankreas

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung

2. Einführung
2.1. Typ 1 Diabetes
2.2. Adhäsionsmoleküle und Typ 1 Diabetes
2.3. Umweltfaktoren und Typ 1 Diabetes
2.4. Ziele der Arbeit

3. Material und Methoden
3.1. Erstellung des Blutzuckertagesprofils
3.2. Durchflußzytometrie
3.3.1. Induktion von Diabetes
3.2.2. Lymphozytenisolation
3.2.3. Färbung der Lymphozyten auf VLA-4 und LFA-1
3.2.4. Analyse und Auswertung
3.2.5. Statistik
3.3. Histologie
3.3.1. Versuchsgruppen
3.3.2. Entnahme und Verarbeitung der Pankreata
3.3.3. H&E Färbung
3.3.4. Immunhistochemie
3.3.5. Auswertung der gefärbten Schnitte
3.3.6. Statistik
3.4. In-vivo Mikroskopie
3.4.1. Induktion von Diabetes und Lymphozytenisolation aus Spendertieren
3.4.2. STZ Vorbehandlung der Empfängertiere
3.4.3. Operation der Empfängertiere
3.4.4. Transfer und Versuch
3.4.5. Auswertung
3.4.6. Aufbau der optischen Geräte
3.4.7. Statistik

4. Ergebnisse
4.1. Festlegung eines Blutzuckergrenzwertes anhand des Blutzuckertagesprofils
4.2. Einfluß verschiedener Narkotika auf den Blutzucker
4.3. Expression von VLA-4 und LFA-1 auf Lymphozyten gesunder und diabetischer Mäuse
4.4. Expression von VCAM-1 und ICAM-1 in Pankreata STZ vorbehandelter Mäuse
4.5. Lymphozytenadhäsion in verschiedenen Geweben
4.6. Lymphozytenadhäsion im endokrinen Gewebe

5. Diskussion
5.1. Methodik
5.1.1 Verwendung des STZ Modells
5.2. Ergebnisse: Ein Modell der Pathogenese des IDDM
5.2.1. Genetische Prädisposition
5.2.2. Triggerung durch Umweltfaktoren
5.2.3. Rolle der antigenpräsentierenden Zellen
5.2.4. Effektorzellen: CD4+ und CD8+ Lymphozyten
5.2.5. Rolle weiterer Zellen
5.2.6. Zelltod der b-Zelle

6. Literaturverzeichnis

1. Zusammenfassung

Typ 1 Diabetes (IDDM) zählt zu den Autoimmunerkrankungen. Neben genetischer Prädisposition beeinflussen Umweltfaktoren die Manifestation des IDDM. Eine 30-50%ige Konkordanz von IDDM bei eineiingen Zwillingen unterstreicht die Bedeutung der Umweltfaktoren an der Pathogenese des IDDM. Zu den Umweltfaktoren, die an der Pathogenese des IDDM beteiligt sind, zählen u.a. Kuhmilchproteine, Viren und bestimmte Toxine. Bisherige Publikationen zu diesem Thema konnten einen direkten Zusammenhang zwischen Umweltfaktoren und IDDM Entstehung nicht nachweisen. Diese These stützt sich im wesentlichen auf epidemiologische Daten. Es konnte ferner gezeigt werden, daß bestimmte Stoffe und/oder Viren eine Homologie zu b-Zell-Antigenen aufweisen, und einige dieser Stoffe T-Zellen diabetischer Patienten oder diabetischer Mäuse zur Proliferation anregen.

In einer früheren Arbeit mit Mikrozirkulationsversuchen konnte gezeigt werden, daß die Adhärenz transferierter Lymphozyten in den Langerhans´schen Inseln nur dann erhöht ist, wenn die Spendertiere diabetisch waren, und das Empfängertier mit einer subdiabetogenen Dosis von Streptozotozin (STZ) vorbehandelt war. Es sollte mit dieser Arbeit untersucht werden, ob die subdiabetogene Dosis von STZ zu einer Immunantwort der Insel führt. Eine Immunantwort drückt sich u.a. in veränderter Expression von Adhäsionsmolekülen auf dem Endothel aus. Hierzu wurde die Expression von vascular-cell-adhesion-molecule-1 (VCAM-1) und intercellular-cell-adhesion-molecule-1 (ICAM-1) in Pankreata mit 5mg/kg STZ und unbehandelten Mäusen gemessen. Die Funktionalität der veränderten Expression von VCAM-1 und ICAM-1 ist mittels der in-vivo Mikroskopie des Pankreas überprüft worden. Ferner wurde das lymphozytäre Verhalten in der Magenschleimhaut mit der des exokrinen Pankreas verglichen, um beurteilen zu können, ob das exokrine Pankreas ein geeignetes Vergleichsgewebe des endokrinen Pankreas darstellt. Mittels Durchflußzytometrie (FACS-Analyse; fluorescent activated cell sorter) wurde die Expression von Integrinen (very-late-antigen-4; VLA-4 und leucocyte-functional-antigen-1; LFA-1) auf Lymphozyten diabetischer und gesunder Mäuse eruiertet.

Innerhalb von 24 Stunden nach Applikation von 5mg/kg STZ ist die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 in den Langerhans’schen Inseln im Vergleich mit unbehandelten Tieren erhöht. Die vermehrte Expression von VCAM-1 und ICAM-1 ist funktionell relevant, da die Behandlung mit entsprechenden blockierenden monoklonalen Antikörpern die lymphozytäre Adhärenz in den Mikrozirkulationsversuchen signifikant senkte. Die Expression von Integrinen auf Lymphozyten diabetischer Mäuse ist identisch mit der gesunder Kontrolltiere. Ferner ist das exokrine Gewebe ein geeignetes Vergleichsgewebe des Endokrinums, da das lymphozytäre Verhalten im exokrinem Gewebe identisch mit dem der Magenschleimhaut war.

Mit dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß eine b-zell-spezifische Noxe eine Immunreaktion des insulären Endothels verursacht. Die erhöhte Expression von VCAM-1 und ICAM-1 in den Inseln führt zu einer gesteigerten Adhärenz transferierter diabetischer Lymphozyten. Demzufolge können b-zell-spezifische Noxen die Adhäsivität des insulären Endothels steigern. Da Makrophagen und andere antigenpräsentierende Zellen die ersten nachweisbaren Zellen im Infiltrat der Inseln sind, schien es wahrscheinlich, daß antigenpräsentierende Zellen (APC) bzw. deren sekretorischen Produkte (vor allem Zytokine) Einfluß auf die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 haben. Dieser molekulare Mechanismus wurde in einer Folgearbeit weiter charakterisiert.

Mit dem erstmaligen direkten Nachweis, daß eine b-zell-spezifische Noxe zur Pathogenese des IDDM beitragen kann, stellte sich die Pathogenese des IDDM wie folgt dar: Bei genetisch prädisponierten Menschen kommt es durch eine Noxe zur Auslösung einer Immunreaktion gegen die b-Zellen. An der Entstehung der Immunantwort sind im wesentlichen APC beteiligt. Neben der reinen Antigenpräsentation sorgen APC zytokinvermittelt am Endothel der Inseln für eine vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen. Effektorzellen, die letztendlich zum Zelltod der b-Zelle führen, sind vor allem CD4+- und CD8+-Lymphozyten.

2. Einführung

2.1. Typ 1 Diabetes

Viele Befunde weisen daraauf hin, daß der Typ 1 Diabetes eine Autoimmunerkrankung ist (1-6). Die Inzidenz des Typ 1 Diabetes (IDDM) ist in den letzten Jahren ständig gestiegen. Verschiedene epidemiologische Studien weisen auf eine jährliche Steigerung der Neuerkrankungen um 2% hin (7-12). Die steigende Inzidenz an IDDM wurde zu etwa demselben Zeitpunkt in verschiedenen Ländern wie Bulgarien (7), Finnland (8), Österreich (9), Japan (11) und Libyen (12) registriert. Insgesamt sind in Europa und den USA etwa 0,3%-0,5% der Bevölkerung an IDDM erkrankt (13;14).

Das klinische Bild ist durch Glukosurie und einen erhöhten Blutzuckerspiegel gekennzeichnet (14). Die klinischen Symptome variieren abhängig vom Grad des Insulinmangels und der daraus resultierenden Stoffwechselentgleisung. Bei bis zu 25% der Patienten mit IDDM wird die Erkrankung durch ein ketoazidotisches Koma festgestellt (15); bei den restlichen Patienten werden Symptome wie Polyurie, Polydipsie, Gewichtsabnahme und Nachlassen der Leistungsfähigkeit beobachtet (14).

Histologisch findet sich ein Infiltrat der Langerhans´schen Inseln des Pankreas (16;17). Sowohl bei humanem IDDM (2;18;19), als auch in verschiedenen Tiermodellen (20-23)konnte gezeigt werden, daß T-Lymphozyten eine entscheidende Effektorrolle in der Zerstörung der Inseln zukommt.

2.2. Adhäsionsmoleküle und Typ 1 Diabetes

Um aus dem strömenden Medium zu den Zielgeweben zu gelangen, müssen Lymphozyten die Blutbahn verlassen (24-26). Die Kräfte, die auf einen Lymphozyten in einem Blutgefäß einwirken, sind so groß (27), daß eine Extravasion nur mit Hilfe von auf Endothel und Lymphozyten exprimierten Adhäsionsmolekülen möglich ist (28-33). Adhäsionsmoleküle sind u.a. auf Endothel und Lymphozyten nachweisbare Oberflächenantigene, die nach gegenseitiger Bindung zur Extravasion von Lymphozyten und anderen mononukleären Zellen beitragen (34). Innerhalb der Adhäsionsmoleküle werden Selektine, Integrine und die Immunglobulin-Superfamilie voneinander unterschieden. Eine Übersicht gibt Tabelle 2.1..

Tabelle 2.1. Einteilung der Adhäsionsmoleküle nach (34). Abkürzungen: PNAd: peripheral lymph node adressin; PSGL-1: P-selectin ligand 1; GlyCAM: glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1; CLA: cutaneus lymphocyte antigen; MadCAM: mucosal addressin cellular adhesion molecule; Mac-1: CD11b/CD18 ; VLA-4: very-late-antigen 4

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Expression von Adhäsionsmolekülen ermöglicht zum einen die Extravasion von Leukozyten. Eine differente Expression auf den verschiedenen Leukozytenpopulationen und unterschiedlichen Geweben ermöglicht zum anderen auch einen gerichteten „Verkehr“ der Leukozyten.

Prinzipiell sind die Schritte der Extravasion weißer Blutzellen (Homing) identisch (Abbildung 2.1.): 1. Zunächst kommt ein initialer Kontakt zwischen Leukozyt und Endothel zustande. Dieser Vorgang wird als Teathering und Rolling bezeichnet. Es kommt hierbei zu einer dramatischen Verlangsamung der Flußgeschwindigkeit des Leukozyten im Blut; von 4000 mm/s auf 40 mm/s (25). Die an dem Prozeß des Rolling und Teathering beteiligten Moleküle unterscheiden sich je nach Gewebe und beteiligter Leukozytenpopulation (24;35-37). In Tabelle 2.2 sind die am Teathering und Rolling beteiligten Adhäsionsmoleküle zusammengefaßt.

Tabelle 2.2. Übersicht über die am Teathering und Rolling beteiligten Adhäsionsmoleküle nach Butcher und Picker (25). LK: Lymphknoten, PNAd: peripheral lymph node adressin, CLA: cutaneus lymphocyte antigen, VCAM-1: vascular adhesion molecule-1

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2. Das langsame „Entlangrollen“ eines Leukozyten am Gefäßendothel ermöglicht es der Zelle, das Endothel auf eventuell vorhandene passende Adhäsionsmoleküle zu untersuchen. Im Fall, daß das Endothel zu dem Zielgewebe des Leukozyten gehört, erfolgt eine G-Protein gekoppelte Aktivierung des Lymphozyten (47;48). Die Affinität (oder: avidity) der Integrine zu ihren endothelialen Liganten, wie z.B. LFA-1 (49), kann innerhalb von 1-3 Sekunden dramatisch gesteigert werden (48;50). Es gibt erste Hinweise, daß Chemokine und deren Rezeptoren an dem 2. Schritt des Leukozytenhoming beteiligt sind (50;51). 3. Nach erfolgter Aktivierung der Integrine kommt es zu einem festen Kontakt zwischen Endothel und Leukozyt, was die Extravasion des Lymphozyten ermöglicht (30;32;52). Analog zum Teathering und Rolling sind die beteiligten Adhäsionsmoleküle je nach Zielgewebe und Leukozytenpopulation verschieden (25).

Abbildung 2.1. Allgemeine Darstellung der Interaktionen von Leukozyten im strömenden Medium mit dem Endothel der Blutgefäße. Die im Text geschilderten Vorgänge finden vor allem an postkappilären Venolen statt (53). Das Endothel postkappilärer Venolen sowie an Stellen mit chronischem Entzündungreiz ist kubisch aufgebaut, und dort werden besonders viele Adhäsionsmoleküle exprimiert (54); es wird als HEV (high endothelial venules) bezeichnet. Weitere Erklärungen im Text.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

In der Literatur gibt es viele Hinweise, daß Adhäsionsmoleküle an der Pathogenese des IDDM beteiligt sind. So konnte z.B. gezeigt werden, daß sich im Serum von Patienten mit IDDM und Personen mit hohem Risiko an Typ 1 Diabetes zu erkranken, erhöhte Konzentrationen von ICAM-1, E-, P- und L-Selektin vorhanden sind (55-57). In histologischen Präparaten von Pankreata kürzlich an IDDM verstorbenen Menschen konnte eine erhöhte Expression von ICAM-1 (17;18)und LFA-3 (17) nachgewiesen werden. Andere Adhäsionsmoleküle waren nicht vermehrt in den Präparaten nachweisbar. Das liegt u.a. daran, daß solche Studien nur am Ende der langen Pathogenese des IDDM durchgeführt werden können. Die Bedeutung von Adhäsionsmolekülen in frühen Phasen der IDDM Pathogenese konnte an verschiedenen Tiermodellen demonstriert werden: In den Modellen der NOD Maus (58-60)und des LD-STZ induzierten Diabetes (21;60;61)konnte durch Behandlung mit monoklonalen Antikörpern, die u.a. gegen L-Selektin (62;63), VCAM-1 (64;65), ICAM-1 (66;67), MadCAM-1 (68), b7 Integrine (68), LFA-1 (66;67;69)und/oder VLA-4 (62;65;67;70)gerichtet sind, die Diabetes Entstehung verhindert, vermindert oder verlangsamt werden (71). Ferner konnten viele Adhäsionsmoleküle histologisch in den Inseln nachgewiesen werden (68;71-73).

2.3. Umweltfaktoren und Typ 1 Diabetes

In der Literatur gibt es zahlreiche Hinweise, daß bestimmte Umweltfaktoren die Entstehung von IDDM begünstigen können. Viren (74-76), Kuhmilchproteine (77-79), und auch bestimmte Toxine (80-82)zählen zu potentiellen Kandidaten, die mit großer Wahrscheinlichkeit an der Entstehung von IDDM beteiligt sind. Daneben kommen gehäufte kindliche Infekte, eine niedrige durchschnittliche Jahrestemperatur, feto-maternale Blutgruppeninkompatibilität und psychische Belastungen als weitere Umweltfaktoren in Frage, die zur Pathogenese des IDDM beitragen (83). Zu den Toxinen, die in Verdacht stehen IDDM mit zu verursachen, zählen u.a. Nitrosamine (84-87), STZ (61;81)und Vacor (88). Diese Substanzen vermitteln über die Generation freier Radikaler (86;89), Alkylierung der DNA in b-Zellen und durch Depletion von NAD in b-Zellen (90) den Tod der b-Zelle aus. Dies löst einen manifesten Diabetes aus bzw. begünstigen die Entstehung jenes.

Die Beteiligung von Umweltfaktoren an der Entstehung von IDDM wird auch durch Zwillingsstudien unterstützt. Es konnte in mehreren Arbeiten gezeigt werden, daß die Konkordanz von IDDM bei eineiingen Zwillingen zwischen 30% und 50% beträgt (83;91;92).

2.4. Ziele der Arbeit

Es konnte bisher jedoch kein direkter Zusammenhang zwischen einem Umweltfaktor und Diabetesentstehung hergestellt werden. STZ akkumuliert selektiv in den b-Zellen und schädigt diese dosisabhängig. Unter low dose STZ (LD-STZ) Behandlung (s.u.) kommt es zu einer Insulitis. Aus diesem Grund wurde die Rolle von STZ, als Modell für einen Umweltfaktor bei Insulitis, im LD-STZ induzierten Diabetes (61), untersucht. LD-STZ indizierter Diabetes ist ein Modell für Typ 1 Diabetes, da die Diabetes Entstehung u.a. T-Zell-abhängig ist (21;93-96).

Es sollte untersucht werden, ob eine Behandlung von C57BL/6 Mäusen mit 5mg/kg STZ i.p. zu einer Immunreaktion im Sinne einer vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen in den Langerhans’schen Inseln führt. Analog wurde auf Lymphozyten diabetischer Mäuse (LD-STZ induziert) die Expression lymphozytärer Adhäsionsmoleküle gemessen, um eine Immunreaktion der Lymphozyten nachweisen zu können.

Eine evtl. veränderte Expression von Adhäsionsmolekülen auf dem Endothel der Langerhans´schen Inseln STZ vorbehandelter Tiere oder auf den Lymphozyten diabetischer Tiere sollte im Anschluß auf Funktionalität untersucht werden. Hierfür wurde der Einfluß monoklonaler Antikörper gegen Adhäsionsmoleküle auf das Verhalten der Lymphozyten diabetischer Spendertiere in STZ vorbehandelten Tieren untersucht

Zusätzlich sollte das Modell der in-vivo Mikroskopie von Langerhans’schen Inseln weiter charakterisiert werden: Durch Vergleichen des Lymphozytenverhaltens im Magen mit dem des exokrinen Gewebe sollte untersucht werden, ob das exokrine Gewebe ein geeignetes Vergleichsgewebe zu dem endokrinen Gewebe ist.

Die hierzu verwendeten Methoden waren im wesentlichen Immunhistochemie, Durchflußzytometrie und in-vivo Mikroskopie des murinen Pankreas.

3. Material und Methoden

3.1. Erstellung des Blutzuckertagesprofils

Um exakte Informationen über die tageszeitlichen Schwankungen des Blutzuckerwertes unter den Haltungsbedingungen unserer Tierversuchsanlage zu erhalten, wurde an zwei verschiedenen Tagen von insgesamt 9 unbehandelten Mäusen ein Blutzuckertagesprofil erstellt. Da neben der Glucosurie der Blutzucker als weiterer metabolischer Parameter zur Diabetesbestimmung hinzugezogen werden sollte, sind zusätzlich zwei diabetische Tiere mit in diese Experimente aufgenommen worden.

An den Versuchstagen wurde den Mäusen unter kurzer Äthernarkose aus dem retroorbitalen Gefäßplexus Blut abgenommen. Die Bestimmung der Blutglucose erfolgte nach der Hexokinase Methode mit einen Blutzuckermeßgerät von Beckmann (Clinical System 700 Analyser). Die Messung des Blutzuckers wurde insgesamt zu 7 Uhrzeiten durchgeführt (von 830 bis einschließlich 1730 alle 90 Minuten).

Mit Hilfe der gewonnenen Daten konnte ein Grenzwert für den Blutzuckerwert festgelegt werden. Mit dem one way ANOVA wurde errechnet, ob es innerhalb der gesunden bzw. diabetischen Tiere zu signifikanten Schwankungen des Blutzuckers kam. Mit dem Man-Whitney rank sum Test wurde überprüft, ob signifikante Unterschiede zwischen gesunden und diabetischen Tieren bestehen.

3.2. Durchflußzytometrie

Mit Hilfe der Durchflußzytometrie sollte untersucht werden, ob die Diabetesentwicklung in LD-STZ behandelten Mäusen auf Lymphozyten eine Immunantwort in Form lymphozytärer Aktivierung auslöst. Ein Merkmal lymphozytärer Aktivierung ist die veränderte Expression von Adhäsionmolekülen (34;97;98). Aus diesem Grund wurde die Expression von VLA-4 und LFA-1 auf Lymphozyten von diabetischen Mäusen und gesunden Kontrolltieren gemessen. Folgende, im einzeln näher erläuterte, Arbeitsschritte waren hierzu notwendig:

1. Induktion von Diabetes in C57BL/6 Mäusen
2. Isolierung der Lymphozyten aus der Milz eines Versuchstiers
3. Färbung der Lymphozyten mit den entsprechenden Antikörpern
4. Messung am Durchflußzytometer
5. Auswertung der gewonnenen Daten

Insgesamt wurden 6 Versuchsgruppen untersucht: Die Expression von VLA-4 und LFA-1 wurde gegen eine negative Kontrolle auf Lymphozyten gesunder bzw. diabetischer Versuchstiere gemessen. Jede Versuchsgruppe bestand aus 6 Tieren.

3.2.1. Induktion von Diabetes

Zur Induktion von Diabetes in den C57BL/6 Mäusen (Charles River, Deutschland) wurde das von Like und Rossini beschriebene low dose Streptozotocin Modell verwendet (61). An 5 aufeinanderfolgenden Tagen bekamen männliche C57BL/6 Mäuse jeweils 40 mg/kg STZ i.p. injiziert. STZ (Sigma, Deutschland) wurde in Zitratpuffer (Sigma, Deutschland) aufgelöst. Das Alter der Versuchstiere lag zwischen vier und sechs Wochen. 21 Tage nach der ersten STZ-Injektion wurde in den behandelten Mäusen der Blutzucker (Clinical System 700 Analyser, Beckmann) bestimmt, und der Urin auf Glucosurie (Boehringer Glukostix) überprüft. Ein Tier wurde als diabetisch betrachtet, wenn der Blutzuckerwert gleich oder größer als 12mmol/l war, und der Urinbefund für Glucosurie positiv ausfiel.

3.2.2. Lymphozytenisolation

Die Lymphozyten wurden aus der Milz der Spendertiere gewonnen. Zu diesem Zweck wurden die Mäuse mit 100mg/kg Pentobarbital-Natrium (Nembutal, Sanofi, Hannover) i.p. narkotisiert und anschließend durch zervikale Dislokation getötet. Die Milz wurde von einem longitudinalen Bauchschnitt aus frei präpariert und entnommen. Sofort im Anschluß wurde die Milz durch ein Stahlsieb gepreßt und homogenisiert. Das Milzhomogenisat wurde in 30-40ml zimmerwarmen PBS (Sigma, Deutschland) aufgefangen und auf vier 15ml Zentrifugenröhrchen (Beckton&Dickinson, Deutschland) verteilt.

Nach Zentrifugation (400g für 10 Minuten) wurden die gewonnenen Splenozyten in 6ml PBS resuspensiert und zu gleichen Teilen auf zwei 15ml Zentrifugenröhrchen verteilt, die mit jeweils 3ml Ficoll (Pharmacia, Schweden) gefüllt waren, und für 30 Minuten bei 400g zentrifugiert. Nachdem die lymphozytenhaltige Schicht vorsichtig abpippetiert (Abbildung 3.1.) und in 10ml PBS resuspendiert war, wurden die Lymphozyten dreimal gewaschen (Resuspension in 10ml PBS und Zentrifugation für 10 Minuten bei 300g).

Der Blutzucker der Spendertiere wurde vor und nach Eintreten der Nembuthalnarkose bestimmt.

Abbildung 3.1. Schematische Darstellung der Lymphozytenisolation mit Ficoll. A: Überschichtung der gewonnenen Zellsuspension auf zimmerwarmen Ficoll. B: Schichten nach Zentrifugation

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.2.3. Färbung der Lymphozyten auf VLA-4 und LFA-1

Je 1x106 Lymphozyten wurden in 100ml PBS resuspendiert und für 20 Minuten bei Raumtemperatur mit den Antikörpern (FITC-gekoppelter @VLA-4: rat IgG2b anti mouse, PS/2 ; FITC-gekoppelter @LFA-1: rat IgG2a anti mouse, E21/7; beide Camon, Wiesbaden) inkubiert. Die genauen Verdünnungen sind in Tabelle 3.1. zusammengefaßt.

Vor der Analyse wurden die gefärbten Lymphozyten noch zweimal mit PBS gewaschen (Resuspension mit 5ml PBS, Zentrifugation bei 300g für 5 Minuten).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 3.1. Duchflußzytometrische Be-stimmung der Expression von VLA-4 und LFA-1 auf murinen Lymphozyten. In der Tabelle sind die Versuchsgruppen und jeweiligen Antikörperverdünnungen zusammengefaßt.

3.2.4. Analyse und Auswertung

Die Expression von VLA-4 und LFA-1 auf den gefärbten Lymphozyten wurde an einem FACScan (Beckton&Dickinson) und an einem Hewlett Packard Computer (Beckton&Dickinson), der mit dem Programm Lysis II ausgestattet war, gemessen und analysiert. Bei jeder Auswertung wurden der forward- (FSC-height) und sideward-scatter (SSC-height) gegeneinander aufgetragen, und ein Gate um die Lymphozytenpopulation gelegt (Abbildung 3.2.).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3.2. Beispiel eines mit Lysis II erstellten Diagramms: Auf der x-Achse ist die FSC-height, die die Zellgröße widergibt, aufgetragen. Der sideward-scatter (y-Achse) läßt Rückschlüsse auf die Gra-nularität der Zellen zu. Die Zellen in der umrandeten Zellpopulation (gegated) sind größtenteils Lympho-zyten. Das Diagramm zeigt die Daten eines diabetischen Tieres.

Auf den gegateten Zellen wurde die Fluoreszenzintensität bestimmt, die in diesem Fall die Expression an VLA-4 oder LFA-1 widergibt, indem in einem Histogramm die Fluoreszenz der gegateten Zellen gegen die relative Zellzahl aufgetragen wurde. In einem separaten Rechenschritt wurde der Mittelwert der Fluoreszenzintensität errechnet (Abbildung 3.3.).

3.2.5. Statistik

Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchsgruppen sind mit dem Mann-Whitney rank sum Test bestimmt worden. Verglichen wurde der Median der gemessenen Fluoreszenz.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3.3. Beispiel eines mit Lysis II erstellten Histogramms. Dargestellt ist die Expression von LFA-1 auf den Lymphozyten einer unbehandelten Maus. Die dunkel gefärbte Kurve repräsentiert die Fluoreszenz ungefärbter Zellen. Die helle Kurve gibt die Expression von LFA-1 wider.

3.3. Histologie

Da wir in einer früheren Arbeit zeigen konnten, daß die lymphozytäre Adhäsion an das Endothel der Inseln nur erhöht ist, wenn die Spendertiere diabetisch waren, und die Empfänger mit einer geringen Dosis STZ vorbehandelt waren (99), sollte auch untersucht werden, ob in den Inseln durch diese Vorbehandlung eine Immunantwort ausgelöst wird. Der Bindungspartner zu VLA-4 ist VCAM-1, LFA-1 bindet an ICAM-1 (32;34;100). Aus diesem Grund wurde auch die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 in Pancreata STZ vorbehandelter C57BL/6 Mäuse mit der in unbehandelten Kontrolltieren verglichen.

Um die Morphologie des untersuchten Gewebes genauer beurteilen zu können, wurden zusätzlich H&E gefärbte Schnitte angefertigt. Es wurde alternierend nach H&E, VCAM-1 und ICAM-1 gefärbt.

3.3.1. Versuchsgruppen

Sechs männliche C57BL/6 Mäuse wurden mit 5mg/kg STZ i.p. behandelt. Das Injektionsvolumen betrug für eine 20g schwere Maus 0,1ml. STZ wurde kurz vor der Injektion in Zitratpuffer gelöst. Die Kontrollgruppe bestand aus 6 männlichen C57BL/6 Mäusen, die 0,1ml Zitratpuffer i.p. injiziert bekamen. Das Alter aller verwendeten Versuchstiere lag zwischen 4-6 Wochen bei einem Gewicht von 18-22g.

3.3.2. Entnahme und weitere Verarbeitung der Pankreata

24 Stunden nach STZ- oder Zitratpuffer-Injekion wurden die Mäuse mit 100mg/kg Pentobarbital-Natrium i.p. narkotisiert und anschließend durch zervikale Dislokation getötet. Von einem longitudinalen Bauchschnitt aus wurde das Pankreas dargestellt und vom transversen Kolon mit einem Wattestäbchen stumpf abpräpariert. Mit einer Schere wurde das Pankreas mit duodenalem-C ent-nommen und in eine vorbereitete Schale mit PBS gegeben. Nach Abtrennen des Doudenums und aus-giebigem Waschen in PBS wurden die Pankreata in flüssigen Stickstoff gegeben und dann bei -70°C bis zur weiteren Verarbeitung aufbewahrt.

Spätestens 2 Wochen nach Entnahme wurden mit einem Gefrierschnittautomaten (Bright, England) 7mm dicke Schnitte angefertigt und auf Objektträger aufgebracht. Nach Lufttrocknung für 30-45 Minuten erfolgte die Fixierung in einem 1:1 Gemisch aus Aceton (Brenntag AG, Deutschland) und Methanol (Riedel-de Haën, Dänemark) für 5-10 Minuten. Auf einem Objektträger wurden zwischen einem und drei Schnitten aufgebracht.

3.3.3. H&E Färbung

Beginnend mit dem ersten Objektträger wurde jeder dritte Schnitt eines Präparats mit H&E gefärbt, um die Morphologie des Gewebes und den Grad der Infiltration beurteilen zu können. Die Einzelschritte der Färbung und Inkubationszeiten sind in Tabelle 3.2. aufgelistet.

Im Anschluß an die Färbung wurden die Schnitte mit Glyceringelantine eingedeckt.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 3.2. Schritte der H&E Färbung. Verwendetes H2O war destilliertes Wasser. Alle Inkubationen bei Raumtemper-atur (Hämatoxilin, Eosin und Ethanol: Apotheke des Uni-versitätsklinikum Frankfurt, Deutschland).

3.3.4. Immunhistochemie

Beginnend mit dem zweiten bzw. dritten Objektträger, wurde jeder dritte Schnitt eines Präparats mit Antikörpern gegen VCAM-1 (rat IgG1 @mouse, M/K-2, Biozol, Deutschland) bzw. ICAM-1 (hamster IgG @mouse, 3E2B, Endogen, USA) gefärbt. Die einzelnen Arbeitsschritte sind in Tabelle 3.3 zusammengefaßt.

Nach Abschluß der Färbung wurden die Schnitte mit Glyceringelantine eingedeckt und über Nacht luftgetrocknet. Bis zur Auswertung, die spätestens eine Woche nach erfolgter Färbung erfolgte, waren die Schnitte an einem trockenen und dunklen Ort gelagert.

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