In diesem ersten Praktikumsteil soll das Prinzip der konditional gezielten Mutagenese in eukaryotischen Zellen vorgestellt werden. Unter einer Mutagenese versteht man die induzierte Mutationsauslösung. Eine Analyse von Mutanten ermöglicht wichtige Einblicke in den Bau und die Funktion von Genen. Das übliche Vorgehen ist die Beschreibung der Auswirkungen von Mutationen auf Reaktionen der betroffenen Zellen oder des betroffenen Organismus. Daraus folgt dann die Isolierung des Gens mit der Bestimmung seiner Struktur durch Nucleotid-Sequenzierung.
In diesem Versuchsteil wird die Methode des Conditional Gene Targeting benutzt, mit der es möglich ist, in der Maus gezielt zeit- und gewebespezifisch Gene auszuschalten. So eine Inaktivierung bildet sozusagen einen Funktionstest für das entsprechende Gen.
Inhaltsverzeichnis
1.) Einleitung:
1.1.) Modellorganismus Maus (Mus musculus):
2.) Versuch zur konditionalen gezielten Mutagenese:
2.1.) Zielsetzung und Methode:
2.2.) Vorbereitung der Fibroblasten: 1.Tag) Trypsinieren und Aussäen von Fibroblasten (siehe Anhang):
2.2.1.) Erwartungen:
2.2.2.) Ergebnisse:
2.3.) Durchführung der Transfektion und Transduktion am 2. Tag:
2.3.1.) Durchführung der Transfektion (siehe Anhang):
2.3.2.) Durchführung der Transduktion (siehe Anhang):
2.4.) Mediumwechsel, Fixierung und X-Gal-Färbung am 3. bzw. 5.Versuchstag (siehe Anhang):
2.4.1.) Mediumwechsel:
2.4.2.) Fixierung und X-Gal-Färbung der Zellen:
3.) Ergebnisse:
3.1.) Transfektion:
3.2.) Transduktion:
4.) Auswertung:
Zielsetzung & Themen
Das primäre Ziel dieser Arbeit ist die Erprobung und Validierung des Prinzips der konditionalen gezielten Mutagenese in eukaryontischen Zellen, um die Funktionsweise von Genen durch deren gezielte Inaktivierung zu untersuchen.
- Methodik des Conditional Gene Targeting in einer Fibroblasten-Zelllinie.
- Einsatz der Cre-Rekombinase zur Entfernung flankierender loxP-Sequenzen.
- Vergleich zweier Strategien zur Proteineinschleusung: Transfektion (DNA-vermittelt) und Transduktion (Protein-vermittelt).
- Nachweis der erfolgreichen Geninaktivierung mittels lacZ-Expression und X-Gal-Färbung.
Auszug aus dem Buch
2.1.) Zielsetzung und Methode:
Die genutzte Zelllinie stammt von Nierenzellen der grünen Meerkatze (Cercopithecus aethiops). Entscheidend für diesen Versuch ist, dass die Zellen genetisch verändert wurden, indem sie mit einem Transgen versehen wurden. Es handelt sich dabei um das lacZ Gen aus E. coli. Man nutzt in diesem Versuchsteil des Praktikum das Expressionsprodukt dieses Gens, die ß-Galaktosidase, als Nachweismethode. Das lacZ Gen ist Bestandteil des lac Operons. Dessen Genprodukte dienen dem Galaktoseabbau. Dieser erfolgt nur dann, wenn das lacZ Gen transkribiert wird. Nachgewiesen wird diese Reaktion über eine weiter Spaltung. Man gibt das farblose Substrat X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-ß-D-Galaktosid) zu den Zellen. Ist in diesen die ß-Galaktosidase enthalten, wird X-Gal von ihr gespalten und es entsteht 5-Brom-4-Chlor-Indigo. Dies wird durch einen Farbumschlag zu Blau angezeigt. So kann mit dieser Färbung die Anwesenheit und Expression des lacZ-Gen nachgewiesen werden.
Auf dem DNA-Strang der eukaryontischen Zellen liegt vor diesem lacZ-Gen das neor –Gen. Dieses verleiht den Zellen die Resistenz gegen das Antibiotikum G418. In diesem Zusammenhang ist von Bedeutung, dass es die Expression des lacZ-Gen verhindert. Weiterhin wurde die DNA der Zellen genetisch verändert, indem ihr zwei sogenannte loxP Stellen aus dem Bakteriophagen P1 eingebaut wurden. Diese loxP-Stellen flankieren das Resistenzgen. Grundlegend für diesen Versuch ist, dass die ebenfalls im Bakteriophagen P1 vorkommende cre Rekombinase die loxP-Stellen aus dem DNA-Doppelstrang ausschneiden kann.
Zusammenfassung der Kapitel
1.) Einleitung: Vorstellung des theoretischen Konzepts der konditionalen Mutagenese sowie Erläuterung des Modellorganismus Maus.
2.) Versuch zur konditionalen gezielten Mutagenese: Detaillierte Beschreibung der experimentellen Vorbereitung der Fibroblasten, der Transfektions- und Transduktionsprozesse sowie der färberischen Nachweismethoden.
3.) Ergebnisse: Präsentation der mikroskopischen Beobachtungen bezüglich der Blaufärbung nach erfolgter Transfektion beziehungsweise Transduktion.
4.) Auswertung: Wissenschaftliche Interpretation der Ergebnisse basierend auf der Aktivität der Cre-Rekombinase und dem reportergestützten Nachweis der Gen-Exzision.
Schlüsselwörter
Konditionale Mutagenese, Cre-Rekombinase, loxP-Stellen, Transfektion, Transduktion, Fibroblasten, lacZ-Gen, ß-Galaktosidase, X-Gal, Geninaktivierung, Conditional Gene Targeting, Reporter-System, Zellbiologie, Gentechnik.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit?
Die Arbeit beschäftigt sich mit der praktischen Anwendung und Überprüfung der konditionalen gezielten Mutagenese in eukaryontischen Zellkulturen.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themen sind die Genmanipulation mittels Cre-LoxP-System, die Methoden der Transfektion und Transduktion sowie der reportergestützte Nachweis von Genveränderungen.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Ziel ist es, das neor-Gen durch Cre-Rekombinase gezielt aus der DNA auszuschneiden, um dadurch die Expression des reporter-Gens lacZ zu ermöglichen.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?
Es werden Techniken wie Zellkultivierung, Trypsinierung, Transfektion (mit Lipiden), Protein-Transduktion sowie eine enzymatische X-Gal-Färbung zur visuellen Auswertung genutzt.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil beschreibt den gesamten Versuchsablauf von der Zellvorbereitung am ersten Tag über die Genübertragung bis hin zur abschließenden Fixierung und Färbung am fünften Versuchstag.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit wird maßgeblich durch Begriffe wie Cre-Rekombinase, Konditionale Mutagenese, loxP-System und lacZ-Reporter-Gen charakterisiert.
Warum wird eine grüne Meerkatze als Zellquelle verwendet?
Die CV1-5B-Zelllinie wurde als transgenes Modell gewählt, um exemplarisch die genomische Exzision unter kontrollierten Bedingungen zu demonstrieren, ohne auf lebende Mäuse zurückgreifen zu müssen.
Warum zeigt die Transduktion eine intensivere Färbung als die Transfektion?
Es wird vermutet, dass das direkt eingebrachte Cre-Protein in der Transduktion effizienter arbeitet, in höherer Konzentration vorliegt oder das Spaltprodukt des X-Gals konzentrierter vorhanden ist.
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- Alexa Saße (Author), 2004, Konditionale gezielte Mutagenese in eukaryontischen Zellen, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/74718
