In diesem ersten Praktikumsteil soll das Prinzip der konditional gezielten Mutagenese in eukaryotischen Zellen vorgestellt werden. Unter einer Mutagenese versteht man die induzierte Mutationsauslösung. Eine Analyse von Mutanten ermöglicht wichtige Einblicke in den Bau und die Funktion von Genen. Das übliche Vorgehen ist die Beschreibung der Auswirkungen von Mutationen auf Reaktionen der betroffenen Zellen oder des betroffenen Organismus. Daraus folgt dann die Isolierung des Gens mit der Bestimmung seiner Struktur durch Nucleotid-Sequenzierung.
In diesem Versuchsteil wird die Methode des Conditional Gene Targeting benutzt, mit der es möglich ist, in der Maus gezielt zeit- und gewebespezifisch Gene auszuschalten. So eine Inaktivierung bildet sozusagen einen Funktionstest für das entsprechende Gen.
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung:
- Modellorganismus Maus (Mus musculus):
- Versuch zur konditionalen gezielten Mutagenese:
- Zielsetzung und Methode:
- Vorbereitung der Fibroblasten: 1.Tag) Trypsinieren und Aussäen von Fibroblasten (siehe Anhang):
- Erwartungen:
- Ergebnisse:.....
- Durchführung der Transfektion und Transduktion am 2. Tag:
- Durchführung der Transfektion (siehe Anhang):
- Durchführung der Transduktion (siehe Anhang):
- Mediumwechsel, Fixierung und X-Gal-Färbung am 3. bzw. 5.Versuchstag (siehe Anhang):
- Mediumwechsel:
- Fixierung und X-Gal-Färbung der Zellen:
- Ergebnisse:
- Transfektion:
- Transduktion:
- Auswertung:
- Literaturverzeichnis:.......
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Der Versuch zielt darauf ab, das Prinzip der konditional gezielten Mutagenese in eukaryontischen Zellen zu demonstrieren. Hierbei wird die Methode des Conditional Gene Targeting genutzt, um die Funktion von Genen durch gezieltes Ausschalten zu untersuchen. Der Fokus liegt auf der Anwendung dieser Methode am Beispiel der Maus, wobei zeit- und gewebespezifische Geninaktivierung im Vordergrund steht. Der Versuch bietet einen Einblick in die Methodik der Generierung gezielt mutagener Mausstämme und die Bedeutung des Modellorganismus Maus für die Forschung.
- Konditionale gezielte Mutagenese in eukaryontischen Zellen
- Methode des Conditional Gene Targeting
- Modellorganismus Maus (Mus musculus)
- Gezielte Geninaktivierung (Knockout-Maus)
- Konditionale Geninaktivierung (Cre-LoxP)
Zusammenfassung der Kapitel
- Einleitung: Dieses Kapitel führt in das Konzept der konditionalen gezielten Mutagenese und die Bedeutung der Mutationsanalyse für das Verständnis von Genen ein. Dabei wird die Methode des Conditional Gene Targeting vorgestellt, die es erlaubt, Gene zeit- und gewebespezifisch in der Maus auszuschalten. Die Bedeutung der Maus als Modellorganismus wird hervorgehoben, da über 90% der Gene von Maus und Mensch ähnliche Strukturen und Funktionen aufweisen.
- Versuch zur konditionalen gezielten Mutagenese: Dieses Kapitel beschreibt den Versuch mit einer Fibroblasten-Zelllinie aus Nierenzellen der grünen Meerkatze. Die Zellen wurden mit einem lacZ-Gen aus E. coli und einem neo-Gen genetisch verändert, welches die Resistenz gegen das Antibiotikum G418 verleiht. Die loxP-Stellen aus dem Bakteriophagen P1 flankieren das Resistenzgen, und die cre Rekombinase kann diese Stellen aus dem DNA-Doppelstrang ausschneiden. Das Ziel des Versuches ist es, durch das Einschleusen der cre Rekombinase in die Zellen das neo-Gen auszuschneiden und so eine lacZ-Expression zu ermöglichen. Dieser Prozess wird mit der Färbemethode anhand des lacZ-Genprodukts, der B-Galaktosidase, nachgewiesen.
Schlüsselwörter
Konditionale gezielte Mutagenese, Conditional Gene Targeting, Modellorganismus Maus, Geninaktivierung, Knockout-Maus, Cre-LoxP, lacZ Gen, neo-Gen, loxP-Stellen, cre Rekombinase, Transfektion, Transduktion.
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- Alexa Saße (Autor), 2004, Konditionale gezielte Mutagenese in eukaryontischen Zellen, Múnich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/74718
