Beziehungen zwischen somatischen Mutationen im Tumorgewebe und bekannter Keimbahnmutation der Gene BRCA1 und BRCA2 beim hereditären Mammakarzinom

Inhaltsverzeichnis

1. Einführung in die Problematik
1.1. Erblicher und sporadischer Brustkrebs
1.2. Ablauf der Karzinogenese
1.3. An der Auslösung von Brustkrebs beteiligte Gene
1.3.1. BRCA1 - breast cancer susceptibility gene 1
1.3.2. BRCA2 - breast cancer susceptibility gene 2
1.3.3. Weitere Brustkrebs-beeinflussende Gene und BRCAX
1.4. Charakteristika erblichen Brustkrebses
1.5. Diagnose und Prävention bei familiärem Brustkrebs
1.6. Zielstellung

2. Material und Methoden
2.1. Auswahl der Patientinnen
2.2. Angewandte Methoden
2.2.1. Entparaffinieren und Separation der Tumorzellen
2.2.2. Isolierung genomischer DNA
2.2.2.1. Phenolreinigung
2.2.2.2. Invisorb Kit
2.2.2.3. Qiagen Kit
2.2.2.4. Chelex Spurenisolierung
2.2.3. Reinigung genomischer DNA
2.2.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung
2.2.5. Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.2.6. Gelelektrophorese
2.2.7. Sequenzierung
2.2.7.1. Probenvorbereitung
2.2.7.1.1. Reinigung der PCR-Produkte
2.2.7.1.2. Sequenzierreaktion
2.2.7.1.3. Fällung
2.2.7.2. Sequenzieren
2.2.7.2.1. Reinigung der Platten
2.2.7.2.2. Zusammensetzen der Gelkammer und Gießen des Gels
2.2.7.2.3. Sequenzervorbereitung und Probenauftrag
2.2.8. Untersuchung des Methylierungsstatus
2.2.8.1. Deaminierung
2.2.8.2. Reinigung
2.2.8.3. Methylierungsspezifische PCR
2.3. Übersicht über verwendete Reagenzien
2.4. Übersicht über genutzte Geräte

3. Ergebnisse
3.1. Tumormaterial der Patientinnen
3.2. DNA-Isolierung, PCR und Gelelektrophorese
3.3. Reinigung genomischer DNA und photometrische Konzentrationsbestimmung
3.4. Mutationsprofil des Tumorgewebes
3.5. Loss of heterozygosity als second hit
3.6. Hypermethylierung als second hit

4. Diskussion
4.1. Methodendiskussion
4.1.1. Tumormaterial der Patientinnen
4.1.2. Isolierung genomischer DNA
4.1.3. Reinigung genomischer DNA
4.1.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung
4.1.5. PCR
4.1.6. Gelelektrophorese
4.1.7. DNA-Sequenzierung
4.1.8. Hypermethylierung
4.2. Ergebnisdiskussion
4.2.1. Mutationsprofil im Tumorgewebe
4.2.2. Loss of heterozygosity beim Mammakarzinom
4.2.3. Hypermethylierung
4.2.4. Weitere Ereignisse, die zum vollständigen Verlust der Expression führen könn(t)en
4.2.5. Ansatzpunkte für weitergehende Untersuchungen

Anhang:

I. Zusammenfassung

II. Abbildungsverzeichnis

III. Tabellenverzeichnis

IV. Literaturverzeichnis

V. Patientenmaterial und kooperierendes Institut XIX

VI. BRCA1-Primer - Herstellung der Endkonzentrationen von 10 µM aus den Stammlösungen XX

Danksagung

Abkürzungsverzeichnis

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1. Einführung in die Problematik

Krebserkrankungen stellen nach Erkenntnis der Weltgesundheitsorganisation (WHO) mit 12,5%, nach Herz-Kreislauferkrankungen (29,2%) und Infektionen¹(26,2%), die dritthäufigste Todesursache weltweit dar²[WHO Jahresbericht, 2003(1)]. In der Bundesrepublik Deutschland und in anderen industrialisierten Staaten sind Krebserkrankungen die zweithäufigste Todesursache [Statistisches Bundesamt, 2003; WHO Jahresbericht, 2003(2)]. Entsprechend verständlich ist das Interesse von Wissenschaft und Gesellschaft, die Ursachen der Krebsentstehung zu erkennen und Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln.

Voraussetzung für die Entwicklung eines Tumors sind genetische Veränderungen in einzelnen oder mehreren Zellen, die bereits in der Keimbahn vorhanden sein können oder somatisch entstehen. Keimbahnmutationen manifestieren sich in allen Zellen des betroffenen Individuums vor und können an Nachkommen weitergegeben werden. Somatische Veränderungen entstehen dagegen spontan und bleiben i.d.R. auf wenige Zellen beschränkt. Für die Krebsentstehung sind immer mehrere Veränderungen notwendig. Von einem Tumor wird deshalb erst dann gesprochen, wenn durch eine progressive Abfolge von Veränderungen die Stadien der Immortalisierung³ und Transformation⁴durchschritten wurden. Durch weitere genetische Veränderungen kann der Tumor „bösartiger“ werden und aggressiv Metastasen⁵bilden. In der Regel sind sechs bis sieben Mutationen für die Entstehung eines Tumors notwendig. Bei Vorliegen einer Keimbahnmutation kann dagegen schon eine weitere somatische Mutation für die Ausbildung eines Tumors ausreichend sein. Im Fall einer vorhandenen Keimbahnmutation wird deshalb von einer genetischen Prädisposition gesprochen [Lewin, 1998 (S. 911 - 14); Alberts et al, 1995 (S. 1489 - 1509)].

Im Rahmen der Diplomarbeit wurden Gewebeproben von Patientinnen und Patienten⁶, die an einem Mammakarzinom (Brustkrebs) erkrankt waren, untersucht. In der Arbeit wird in einer „Einführung“ auf bisherige Erkenntnisse der Brustkrebsentstehung eingegangen. In diesem Zusammenhang werden die Charakteristiken und die Entstehung von familiärem und sporadischem Brustkrebs und wichtige involvierte Gene und Auswirkungen auf betroffene Patientinnen erläutert. In den folgenden Kapiteln, „Material und Methoden“, „Ergebnisse“, „Diskussion“, werden Auswirkungen sporadischer Veränderungen auf die Brustkrebsentwicklung an einer Patientinnengruppe (n=16) mit erblichen Gendefekten in den Genen BRCA1 und BRCA2 (breast cancer susceptibility genes 1 und 2)⁷nachvollzogen.

1.1. Erblicher und sporadischer Brustkrebs

Jährlich erkranken nach Angaben des Robert-Koch-Instituts 46.000 Frauen in der Bundesrepublik Deutschland an einem Mammakarzinom. 18.000 Frauen sterben jährlich an den Folgen dieser Erkrankung. Zwischen dem 35. und 55. Lebensjahr stellt Brustkrebs bei Frauen die häufigste Todesursache dar. Die Wahrscheinlichkeit einer Frau im Laufe ihres Lebens an Brustkrebs zu erkranken, liegt bei ca. 10%. [Deutsche Krebshilfe, 2002].

Die Ursachen des Mammakarzinoms sind multifaktoriell (Tabelle 1.1.1). Erst eine Vielzahl von genetischen und nichtgenetischen Veränderungen führen zum Ausbruch der Krebserkrankung. Nur ein Anteil von etwa 5 bis 20% aller Mammakarzinomerkrankungen kann mit angeborenen genetischen Prädispositionen in Verbindung gebracht werden [Kuschel et al, 2000; Wooster et al, 2003].

Tabelle 1.1.1: Brustkrebs beeinflussende Faktoren; [Wawrzyn et al, 1999].

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Neben Veränderungen in den Genen p53 (Tumorprotein 53), ATM (ataxia teleangiectatica mutated) und PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten) sind vor allem Mutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 für die Entwicklung eines Mammakarzinoms entscheidend. Geht ihre Funktion verloren, steigt das Risiko für Brust- und Eierstockkrebs erheblich. Fünf bis zehn Prozent der erblichen Pankreas-[Arnold et al, 2001] und Prostatakrebserkrankungen [Cerhan et al, 1999; Gayther et al, 2000] sind ebenfalls auf Keimbahnmutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 zurückzuführen (Tabelle 1.1.2).

Tabelle 1.1.2: Krebserkrankungsrisiko bei Mutationsträgern in den Genen BRCA1 und BRCA2; [Easton et al, 1997; Ford et al, 1998; Kuschel et al, 2000; Kiechle et al, 2003].

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1.2. Ablauf der Karzinogenese

Molekularbiologisch sind die Aktivierung von Onkogenen und die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen an der Krebsentstehung beteiligt. Onkogene sind Gene, deren Genprodukte Zellen transformieren können, so dass diese wie Krebszellen wachsen. Sie greifen in Signaltransduktionswege, Transportprozesse oder die Wachstumsregulation ein. Produkte von Onkogenen sind Wachstumsfaktoren, Kinasen, membrangebundene G- Proteine, Transkriptions-faktoren und Regulatoren des Zellzyklus. Proto-Onkogene codieren für wachstumsfördernde Faktoren. Bei einer mutationsbedingten Änderung eines Proteins, einer Überexpression, einer Expression in „falschen“ Zelltypen und/oder dem Nichtabschalten der Expression können sie in ein Onkogen übergehen. Tumor- suppressorgene codieren Genprodukte, die eine Kontrolle auf den Zellzyklus und das Zellwachstum ausüben. Sie wirken bei der Zelladhäsion, der Signaltransduktion, der Kontrolle der Transkription, der DNA-Reparatur, kontrollieren den Zellzyklus oder induzieren Apoptose. Der Wegfall dieser Kontrolle führt zu einer vermehrten und unregulierten Zellteilung und damit zur Tumorbildung. BRCA1 und BRCA2 sind Beispiele für Tumorsuppressorgene. Sie wirken bei der Kontrolle der Transkription, des Zellzyklus und der DNA-Reparatur.

Nach der „second hit-Hypothese“ von Knudson erfolgt die Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen in zwei Schritten. Zunächst wird eines der beiden Allele inaktiviert. Ursache ist eine Keimbahn- oder eine sporadische Mutation. Im zweiten Schritt folgt der Funktionsverlust der zweiten Genkopie. Das kann durch einen kompletten oder teilweisen Verlust des Gens durch einen sog. Loss of heterozygosity (LOH), durch eine verminderte Promotorfunktion durch Hypermethylierung oder durch eine weitere somatische Mutation geschehen (Abb. 1).

Abb. 1: second hit-Modell von Knudson, 1971; eigene Darstellung.

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Folge ist eine Inaktivierung des Gens. Aufgaben des Genprodukts im Organismus können nicht mehr wahrgenommen werden. Dadurch bedingt kommt es mit größerer Wahrscheinlichkeit zu weiteren Veränderungen, die die betroffenen Zellen einer Zellwachstums- und Zellzykluskontrolle entziehen und eine zunehmend pathologische Entwicklung bewirken (Abb. 2) [Beckmann et al, 1997].

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Abb. 2: Modell der Mehrschritt-Karzinogenese nach Beckmann [Beckmann et al, 1997; Aba-Kircin, 2001].

1.3. An der Auslösung von Brustkrebs beteiligte Gene

Für die Auslösung von Brustkrebs ist der Funktionsverlust von Genen und ihren Genprodukten erforderlich, die in lebenswichtige Prozesse proliferierender Zellen des Brustdrüsengewebes involviert sind. Als entscheidend für die Entwicklung eines Mammakarzinoms haben sich die Gene BRCA1 und BRCA2 herausgestellt. In Abbildung

3 sind sie im Zentrum von Prozessen dargestellt, an denen sie beteiligt sind.

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Abb. 3: Schematischer Überblick über Prozesse mit Beteiligung von BRCA1 und BRCA2; Dargestellt sind Beteiligungen an der Zellzykluskontrolle, an der DNA-Reparatur und am Wachstumsstopp [Hedenfalk et al, 2002].

1.3.1. BRCA1 - breast cancer susceptibility gene 1

BRCA1 und BRCA2 werden überdurchschnittlich in sich teilenden Zellen exprimiert. Das Genprodukt konnte in verschiedenen Geweben, wie der Brust, dem Ovar, dem Thymus und den Testes, nachgewiesen werden [Miki et al, 1994]. BRCA1 und BRCA2 werden in der frühen Embryogenese benötigt und werden während der Pubertät und Schwangerschaft im Brustdrüsengewebe verstärkt exprimiert [Rajan et al, 1997].

Das BRCA1-Gen ist auf dem langen Arm des Chromosoms 17 (17q21) lokalisiert und erstreckt sich über 81 kb genomischer DNA. Es untergliedert sich in 22 codierende Exons [Miki et al, 1994; Smith et al, 1996; Bertwistle et al, 1999]. Bemerkenswert ist das ungewöhnlich große Exon 11 mit mehr als 60% der codierenden Region und die große Dichte an ALU-Elementen⁸. ALU-Elemente machen 42% des gesamten Gens aus. Alle repetitiven Sequenzen zusammen bilden 47% des Gens [Smith et al, 1996; Welcsh et al, 2001]. BRCA1 besitzt keine TATA-Box, sondern stattdessen eine 36 bp große positiv regulierende Region, die die Promotoraktivität steuert [Thakur et al, 1999]. Das mRNA Transkript des BRCA1-Gens umfasst 7,8 kb und codiert für ein 1863 Aminosäuren großes Genprodukt mit einem Molekulargewicht von 220 kDa [Miki et al, 1994; Chen et al, 1996]. Das BRCA1-Protein zeigt keine Homologie zu anderen bekannten Proteinen, dennoch konnten einige konservierte Regionen identifiziert werden. BRCA1 besitzt N-terminal ein spezialisiertes Zinkfinger-RING-Motiv, das die Protein- DNA- und Protein-Protein-Interaktionen beeinflussen kann. Außerdem ist BRCA1 durch eine Kernlokalisierungs-Domäne (NLS, nuclear localization sequence), die sich im Bereich des Exons 11 befindet, eine Transaktivierungs-Domäne und zwei BRCT-Domänen (BRCA1 C- terminal domain) gekennzeichnet (Abb. 4).

Abb. 4: Schematische Darstellung des BRCA1-Proteins; mit den strukturellen Besonderheiten RING-Domäne, NLS (nuclear localization sequence), Transaktivierungsdomäne und zwei BRCTDomänen (BRCA1 C-Terminal domain). Weiterhin Interaktionen anderer Proteine mit dem BRCA1-Protein [Hedenfalk et al, 2002; Somasundaram, 2003].

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Die funktionellen Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der transkriptionsgekoppelten Regulation. Direkt oder indirekt interagiert BRCA1 an ihnen mit Tumorsuppressoren, Onkogenen, Reparaturproteinen, Regulatoren des Zellzyklus und Aktivatoren und Inhibitoren der Transkription. N-terminal können BARD1 (BRCA1-associated RING domain protein 1), BAP-1 (BRCA1-associated protein 1) und E2F-1 (amyloid beta (A4) precursor protein- binding, family A, member 2 binding protein) binden. An die NLS binden RAD50, RAD51 (eucaryotic recombination and DNA repair protein 50 bzw. 51), p53, RB (retinoblastoma protein) und c-Myc (v-myc myelocytomatosis viral oncogene homolog). Der C-Terminus interagiert u.a. mit RNA Polymerase II, p300/CBP (E1A binding protein p300 /CREB binding protein -Komplex), BRCA2, RNA-Helikase und CtIP (retinoblastoma binding protein 8) [Hedenfalk et al, 2002; Somasundaram, 2003].

BRCA1 mRNA und Protein wird in hohen Konzentrationen in sich teilenden Geweben exprimiert und ist in die Zellzykluskontrolle eingebunden. Die höchsten Expressionsraten von BRCA1 werden in der späten G1-Phase und der S-Phase, während der DNA-Replikation, im Zellzyklus erreicht. Höhere Konzentrationen konnten auch während der Mitose und in meiotischen Keimzellen nachgewiesen werden. [Chen et al, 1996]. Die Rolle von BRCA1 im Zellzyklus ist mittlerweile gut dokumentiert. Nachdem es zunächst dephosphoryliert vorliegt, wird BRCA1 in der späten G1-Phase und in der S-Phase des Zellzyklus durch CDK2-Zykline (CDK, cyclindependent kinase) phosphoryliert. In der M-Phase liegt es wieder dephosphoryliert vor [Ruffner et al, 1997 und 1999; Maclachlan et al, 2000; Somasundaram, 2003].

BRCA1 spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Genom-Integrität. Im Zusammenhang von Reparaturmechanismen interagiert BRCA1 neben Gadd45 (growth arrest and DNA- damage-inducible, alpha) und p53 mit den Proteinen Rad51, BRCA2, Rad50- MRE11-NBS1 (MRE11, meiotic recombination 11 homolog A ; NBS1, Nijmegen breakage syndrome 1) und mit dem großen Proteinkomplex BASC (BRCA1-associated genome surveillance complex). p53 nimmt bei der Zellzykluskontrolle eine wichtige Funktion ein und entfaltet dabei Wirkung u.a. auf p21 (cyclin-dependent kinase inhibitor, Stopp des Zellzyklus) und Gadd45 (Reparaturprotein für durch Strahlung entstandene Schäden) oder kann Apoptose initiieren. BASC ist ein Multienzymkomplex, der sich aus zahlreichen an der DNA-Reparatur beteiligten Proteinen zusammensetzt. Dazu zählen beispielsweise MSH2, MSH6 (mut S homolog 2 bzw. 6) und MLH1 (mut L homolog 1) [Somasundaram, 2003]. BRCA1 ist zudem in transkriptionsgekoppelte Reparaturen eingebunden, die durch ionisierende Strahlung und oxidative Substanzen entstandene Schäden ausgleichen [Scully et al, 2000; Abbott et al, 1999]. Die für transkriptionsgekoppelte Reparaturen benötigte RNA Polymerase II bindet dabei an die BRCT-Domäne des BRCA1-Proteins. Schließlich lagern sich weitere für den Reparaturprozess benötigte Komponenten an [Hedenfalk et al, 2002]. Weiterhin ist BRCA1 an Mechanismen zur rekombinationsvermittelten Reparatur von Doppelstrangbrüchen beteiligt. Dabei wirkt es sowohl an der non-homologous end joining repair (NHEJ, Reparatur durch nicht homologen Bruchstückaustausch), als auch an der homologous recombinational repair (HRR, Reparatur durch homologe Rekombination) mit. Als Antwort auf ionisierende Strahlung wird NBS1 durch ATM phosphoryliert und der Komplex RAD50-MRE11-NBS1 gebildet, welcher für NHEJ und HRR gleichermaßen notwendig ist. Bei der homologous recombinational repair bindet BRCA1 direkt an die DNA und hemmt die Nuklease-Aktivität des RAD50-MRE11-NBS1-Komplexes [Paull et al, 2001]. Damit verbindet BRCA1 vermutlich die Wirkung der Prozessierung der Bruchstückenden durch den RAD50-MRE11- NBS1-Komplexes mit der Wirkung von RAD51, das den Strangaustausch bei der homologen Rekombination durchführt [Moynahan et al, 1999 ; Scully et al, 2000; Hedenfalk et al, 2002].

Im BRCA1-Gen sind mehr als 500 Mutationen, Polymorphismen und Varianten beschrieben [HGMD (Human Gene Mutation Database)]. Dabei konnte eine Korrelation von vorhandener BRCA1-Mutation in der Keimbahn und Brustkrebserkrankung nachgewiesen werden. Hinweise auf Mutationen des BRCA1-Gens beim sporadischen Mammakarzinom sind derweil spärlich. Wenn überhaupt, wird eine wesentlich geringere Bedeutung als beim erblichen Mammakarzinom angenommen [Khoo et al, 1999; Li et al, 2002; Yang et al, 2002 (1); Rosen et al, 2003; Wooster et al, 2003]. Bei sporadischem Brust- und Eierstockkrebs scheint die Suppression der Transkription des BRCA1-Promotors bspw. durch Hypermethylierung bedeutsamer zu sein [McCoy et al, 2003].

Häufige Mutationen im BRCA1-Gen sind Substitutionen und kleine Deletionen. Auch größere Keimbahnmutationen, die durch homologe Rekombination der ALU-Sequenzen entstehen können, treten auf [Vehmanen, 2001]. Die Mehrheit der Mutationen sind frameshift- oder nonsense-Mutationen, die einen vorzeitigen Abbruch der Translation bewirken. Der Verlust beider Allele des BRCA1-Gens in der Keimbahn wirkt im Mäuseversuch letal [Ludwig et al, 1997]. Populationsabhängig sind die einzelnen Mutationen mit stark divergierenden Häufigkeiten vertreten. In der deutschen Bevölkerung sind die Mutationen 5382insC und 300T→G des BRCA1-Gens besonders weit verbreitet [German Consortium for Hereditary Breast and Ovarian Cancer, 2002].

1.3.2. BRCA2 - breast cancer susceptibility gene 2

BRCA2 liegt auf Chromosom 13 (13q12.3) und codiert mit 27 Exons für ein Protein aus 3418 Aminosäuren (Molekulargewicht 384 kDa) [Wooster et al, 1995; Bertwistle et al, 1999; Hunt, 2001 (1) and (2)]. Die Gensequenz von BRCA2 beinhaltete wie BRCA1 ebenfalls 47% repetitive DNA. ALU-Elemente haben daran einen Anteil von 20% [Welcsh et al, 2001]. Wie BRCA1 ist das BRCA2-Protein durch eine Kernlokalisierungs-Domäne gekennzeichnet, die sich bei BRCA2 C-terminal befindet. Weitere Sequenzmerkmale sind BRCs (acht Motive mit einer großen Sequenzhomologie, codiert im Bereich des Exons 11) und eine N-terminale Transaktivierungsdomäne. NLS, BRCs und N-terminale Transaktivierungsdomäne stellen wichtige Anknüpfungspunkte interagierender Proteine dar (Abb. 5).

Abb. 5: Schematische Darstellung des BRCA2-Proteins; mit den strukturellen Besonderheiten NLS (nuclear localization sequence), Transaktivierungsdomäne und BRC-Domänen (acht Motive mit einer großen Sequenzhomologie, codiert im Bereich des Exons 11) und Interaktionen anderer Proteine mit dem BRCA2-Protein [Hedenfalk et al, 2002].

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Die Funktion von BRCA2 ist im Vergleich zu BRCA1 wenig untersucht. Es gilt jedoch als sicher, dass es ebenfalls tumorsuppressive Wirkungen zeigt. Es interagiert mit Rad51 [Wong et al, 1997; Kowalczykowski, 2002; Pellegrini et al, 2002], p53 [Marmorstein et al, 1998] und BRAF35 (BRCA2-Associated Factor 35) [Marmorstein et al, 2001], die an DNA-Reparaturmechanismen beteiligt sind. Als regulatorische Komponente ist BRCA2 an der homologous recombinational repair beteiligt. Bei der HRR wird mit Hilfe der Sequenz des homologen DNA-Stranges ein Doppelstrangbruch (DSB) repariert. Nicht oder falsch reparierte DSB wirken letal oder mutagen. Im Gegensatz zu BRCA1, dem die Beteiligung an der transkriptionsgekoppelten Reparatur, der HRR und der NHEJ nachgewiesen werden konnte, bleibt die BRCA2-Aktivität auf die HRR beschränkt [Xia et al, 2001]. Zusammen mit Rad51 ist BRCA2 an einem Multienzymkomplex beteiligt, dem auch BRCA1 und BARD angehören. BRCA2 hemmt die ATP-Hydrolyse-Aktivität von Rad51 und seine Fähigkeit DNA zu binden. Entscheidend scheinen bei der Interaktion die BRC-Motive zu sein. Sechs der acht BRC-Motive zeigen Affinität zu Rad51 [Arnold et al, 2001; Xia et al, 2001; Pellegrini et al, 2002]. Mutationen im BRCA2-Gen führen zu einer Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Substanzen und zu Chromosomen-Instabilität [Xia et al, 2001; Donoho et al, 2003]. Abbildung 6 fasst Interaktionen in der HRR, an denen BRCA1 und BRCA2 beteiligt sind, und Auswirkungen von Mutationen zusammen (Abb. 6).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 6: Die Rolle von BRCA1 und BRCA2 in der HRR (homologous recombinational repair): (a) Das Modell setzt einen Protein-Komplex aus den Komponenten BRCA1, BRCA2, BARD1 und Rad51 voraus. Einleitender Schritt bei der Komplexbildung ist die Phosphorylierung (P = Phosphatgruppe) von BRCA1 durch die Kinase ATM. In Reaktion auf einen festgestellten Doppelstrangbruch (durch p53) bindet der Proteinkomplex an die DNA (Erkennung über PCNA (proliferating cell nuclear antigen)) und repariert sie. (b) Ein Verlust der Funktion von BRCA1 oder BRCA2 verhindert eine Reparatur. Ist das Zellzyklus- kontrollierende Genprodukt p53 von einem Funktionsverlust betroffen, können Wachstums- stopp (p21) und Reparaturmechanismen nicht eingeleitet werden [Arnold et al, 2001].

Ebenso erscheint eine Rolle des BRCA2-BRAF35-Komplexes in Reparatur- und/oder Rekombinationsmechanismen denkbar. Seine Aufgabe besteht im Auflösen und Neupacken von aufgefaserten Chromatin-Fäden oder in der Aufrechterhaltung der Chromosomenintegrität, während der Auftrennung in der Mitose [Marmorstein et al, 2001].

Für BRCA2 sind in der HGMD mehr als 300 Mutationen, Polymorphismen und Varianten beschrieben [HGMD]. Häufig sind dies kleine Deletionen und Insertionen, sowie missense⁹- und nonsense¹⁰-Substitutionen. Keimbahnmutationen im BRCA2-Gen sind Risikofaktoren für eine Erkrankung an Brustkrebs. Für sporadische Mammakarzinome konnte eine große LOH- Frequenz festgestellt werden. Mutationen scheinen dem gegenüber, genau wie bei BRCA1, selten zu sein. Dennoch konnten auch BRCA2-Mutationen in sporadischen Tumoren gefunden werden. Der Einfluss von Keimbahnmutationen im BRCA2-Gen bei Brustkrebs männlicher Patienten ist besonders zu erwähnen [Kwiatkowska et al, 2002; Ottini et al, 2003].

1.3.3. Weitere Brustkrebs -beeinflussende Gene und BRCAX

Es kann angenommen werden, dass für alle Gene, deren Produkte an Signalwegen der Genprodukte BRCA1 und BRCA2 beteiligt sind, die Möglichkeit besteht, bei einem Funktionsverlust Brustkrebs zu induzieren. Je höher sie in der Signalkaskade stehen, desto wahrscheinlicher ist ein Einfluss auf die Tumorentwicklung. Im Verdacht stehen besonders ATM (ataxia telangiectasia mutated, Chromosom 11q22-q23), ATR (ATM-Rad3-related, 3q22-q24), CHK2 (checkpoint kinase 2, 22q12.1), CDK2 (cyclin-dependent kinase 2, 12q13), und BARD1 (BRCA1-associated RING domain, 2q34-q35), weil ihre Genprodukte regulierend oder prozessierend auf das BRCA1-Protein wirken (Abb. 3).

Eine homozygote Mutation des ATM-Gens führt zu der genetisch bedingten Erkrankung Ataxia telangiectasia. Heterozygot kommt es bei etwa 1% der Bevölkerung vor. Der Einfluss des ATM-Gens auf die Entstehung eines Mammakarzinoms ist umstritten. Nach einer Studie von Broeks (2000) haben Patientinnen mit einer heterozygoten Keimbahnmutation im ATM- Gen ein neunfach erhöhtes Risiko, an Brustkrebs zu erkranken. Fitzgerald (1997) beschreibt dagegen für Trägerinnen einer Keimbahnmutation im Bereich des ATM-Gens keine gesteigerte Wahrscheinlichkeit an Brustkrebs zu erkranken [Athma et al, 1996; Fitzgerald et al, 1997; Broeks et al, 2000 ; Nathanson et al, 2001]. Mutationen, die die Expression oder Aktivität von ATR beeinträchtigen, könnten die Wahrscheinlichkeit einer Brustkrebserkrankung erhöhen, da ATR, wie ATM, eine wichtige Rolle bei der Phosphorylierung von BRCA1 und im Zellzyklus einnimmt [Abraham, 2001].

Mutationen im CHK2-Gen konnten bereits in Familien mit dem Li-Fraumeni-Syndrom nachgewiesen werden. CHK2 ist eine Kinase, die als Folge von DNA-Schäden aktiviert wird und an Signalwegen des Zellzyklus und von p53 beteiligt ist. Bei Brustkrebspatientinnen konnten in einer geringen Anzahl sporadische (7/141) und erbliche (1/139 bzw. 5/141) CHK2-Mutationen nachgewiesen werden [Ingvarsson et al, 2002; Sullivan et al, 2002;

Meijers-Heijboer et al, 2002].

Die Zyklin-abhängigen Kinasen (CDK) beeinflussen den Zellzyklus von Säugern durch die Phosphorylierung einer ganzen Reihe von Schlüsselsubstraten. Bei einer Inaktivierung der CDKs kann der Zellzyklus nicht durchlaufen werden und resultiert in Apoptose. Über Beziehungen von Mammakarzinomerkrankungen und Mutationen in CDK-Genen liegen derzeit noch keine Erkenntnisse vor. TGF-ß (Transforming growth factor ß) inhibiert CDKs und bewirkt damit einen Wachstumsstopp der Zelle in der G1-Phase des Zellzyklus. Ein Verlust der inhibitorischen Funktion von TGF-ß führt schnell zur Transformation von Zellen des Brustdrüsengewebes und kann in Brustkrebs münden [Donovan et al, 2000]. Ähnliche Auswirkungen erscheinen bei einer mutationsbedingten Überexpression der CDK-Gene möglich.

Seit bekannt ist, dass BRCA1 mit BARD1 Heterodimere bildet, die an Reparaturmechanismen beteiligt sind, wird über eine Brustkrebs induzierende Wirkung von Mutationen im BARD1-Gen spekuliert. In diesem Zusammenhang wurden Patientinnen mit Brust-oder Eierstockkrebserkrankung mit familiärem Hintergrund aber ohne Keimbahnmutationen in den Genen BRCA1 und BRCA2 untersucht. Dabei konnten neben einigen Polymorphismen fünf vermeintliche Keimbahnmutation nachgewiesen werden [Thai et al, 1998; Ghimenti et al, 2002; Ishitobi et al, 2003].

p53 (Tumorprotein 53, 17p13.1) nimmt eine wichtige Rolle im Zellzyklus ein. In normalen Zellen wird p53 nur in sehr geringen Mengen exprimiert. Kommt es zu einer Schädigung der DNA, steigt der p53-Gehalt der Zelle stark an. Befindet sich die betroffene Zelle im G1- Stadium, veranlasst p53 einen Wachstumsstopp. Dieser wird durch die Induktion von p21 eingeleitet und so lange aufrecht erhalten, bis die DNA repariert ist. Hat die Zelle schon die G2-Phase erreicht, leitet p53 die Apoptose (programmierter Selbstmord der Zelle) ein. Verstärkte und verminderte p53-Expression wurde schon in vielen Tumorarten nachgewiesen. Für Brustkrebs gilt die Überexpression von p53 als nutzbarer klinischer Indikator [Davidoff et al, 1991]. Ebenfalls konnte eine Häufung von Mutationen des p53-Gens im erblichen Mammakarzinom nachgewiesen werden. Träger einer Keimbahnmutation in den Genen BRCA1 oder BRCA2 weisen in 16 bis 84% der Fälle eine somatische Mutation im Gen p53 auf [Runnebaum et al, 1991; Greenblatt et al, 2001; Sensi et al, 2003]. Auch bei Patientinnen ohne Mutation in den Genen BRCA1 und BRCA2 sind somatische Mutationen im Gen p53 mit 17 bis 35% häufig [Greenblatt et al, 2001].

Weiterhin wird ein Einfluss auf sporadischen und erblichen Brustkrebs für die Gene FHIT (fragile histidine triad gene, Chromosom 3p14.2) [Ahmadian et al, 1997; Yang et al, 2002 (2)], IL-6 (Interleukin-6, 7p21) [Saha et al, 2003], PTEN-Gens ((phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, 10q23.3) [Chen et al, 1999], MSH2 (mut S homolog 2, 2p22-p21) und MLH1 (mut L homolog 1, 3p21.3) [Murata et al, 2002; Adem et al, 2003] diskutiert. Eine Rolle bei der genetischen Prädisposition für Brustkrebs könnten die Genorte 13q21 [Kainu et al, 2000; Thompson et al, 2002], ZBRK1 (zinc finger protein 350, 19q13.41) und BACH1 (basic leucine zipper transcription factor 1, 21q22.11) [Liu et al, 2002; Rutter et al, 2003] spielen. Eine angenommene Prädisposition von CDH1-Keimbahnmutationen

(cadherin 1, 16q22.1) für eine Brustkrebserkrankung konnte nicht bestätigt werden. Bei der Entwicklung sporadischer Mammakarzinome scheint die Inaktivierung von CDH1 durch Mutationen und LOH dagegen eine wichtige Rolle zu spielen [Berx et al, 2001; Salahshor et al, 2001].

In zahlreichen Hochrisikofamilien mit wiederholt aufgetretenen Brust- und Eierstockkrebsfällen konnte keine BRCA1- oder BRCA2-Keimbahnmutation festgestellt werden. Es gibt daher wahrscheinlich weitere Gene, in denen Keimbahnmutationen eine Brustkrebserkrankung befördern. Diese Gene werden als BRCAX zusammengefasst [Easton, 1999; Hedenfalk et al, 2003]. Dabei kann BRCAX eine Vielzahl von Genen darstellen, die jeweils für einen kleinen Anteil an erblichen Brustkrebserkrankungen prädisponieren oder es können wenige Gene sein, die jeweils für eine größere Anzahl an Brustkrebserkrankungen verantwortlich sind.

1.4. Charakteristika erblichen Brustkrebses

Häufiges familiäres Auftreten von Mamma- und Ovarialkarzinomen oder eine bereits vorangegangene Mammakarzinomerkrankung weisen auf erbliche Faktoren hin und kennzeichnen Risikogruppen von Brustkrebs. Die Gene BRCA1 und BRCA2 sind in 40 bis 50% der erblichen Fälle von Mutationen betroffen [Wooster et al, 2003]. Die Vererbung der Prädisposition folgt einem autosomal dominanten Erbgang. Homozygote Trägerinnen einer Keimbahnmutation sind nicht lebensfähig [Ludwig et al, 1997]. Die Deutsche Krebshilfe hat für ihr Schwerpunktprogramm „Familiärer Brust- und Eierstockkrebs“ Kriterien für Risikogruppen aufgestellt. Trifft eines der Kriterien zu, sind erbliche Faktoren für das Auftreten von Brustkrebs wahrscheinlich und es wird eine genetische Diagnostik der Gene BRCA1 und BRCA2 angeraten:

- Mindestens zwei Frauen der Familie (Mutter, Schwester, Tochter oder selbst erkrankt) mit Brust- und/oder Eierstockkrebs, wobei mindestens eine Frau zum Zeitpunkt der Erkrankung unter 50 Jahre alt gewesen ist.
- Eine Frau der Familie (Mutter, Schwester, Tochter oder selbst erkrankt) mit einseitigem Brustkrebs, wobei die Erkrankung im Alter von 30 Jahren oder früher aufgetreten ist.
- Eine Frau der Familie (Mutter, Schwester, Tochter oder selbst erkrankt) mit beidseitigem Brustkrebs, wobei die Erkrankung im Alter von 40 Jahren oder früher aufgetreten ist.
- Eine Frau der Familie (Mutter, Schwester, Tochter oder selbst erkrankt) mit Eierstockkrebs, wobei die Erkrankung im Alter von 40 Jahren oder früher aufgetreten ist.
- Eine Frau der Familie (Mutter, Schwester, Tochter oder selbst erkrankt), bei der Brust- und Eierstockkrebs aufgetreten sind.
- Ein männlicher Verwandter mit Brustkrebs.

Im Rahmen dieses Schwerpunktprogramms liegen bereits erste Ergebnisse vor, die die Bedeutung der Gene BRCA1 und BRCA2 unterstreichen. Ebenso weisen sie darauf hin, dass BRCA1 und BRCA2 nicht die einzigen prädisponierenden Gene sein können:

- Familien mit mindestens zwei an Mammakarzinom erkrankten Frauen, wobei eine der Frauen bei Auftreten der Erkrankung unter 50 Jahre war, weisen in 37 Prozent der Fälle Mutationen in den Genen BRCA1 (24%) und BRCA2 (13%) auf.
- Von Familien mit einem oder mehreren Fällen von Brustkrebs und wenigstens einem Fall von Eierstockkrebs haben 52% Mutationen in den Genen BRCA1 (42%) und BRCA2 (10%).
- Familien mit mindestens einer männlichen erkrankten Person weisen in 25% der Fälle Mutationen in den Genen BRCA1 (2%) und BRCA2 (23%) auf.

[German Consortium for Hereditary Breast and Ovarian Cancer, 2002]

Das Vorliegen prädisponierender Genmutationen bedingt eine erhöhte Erkrankungswahr- scheinlichkeit. Die Tumorsuppressorfunktion kann allerdings durch das zweite Allel übernommen werden. Erst der Verlust beider Allele führt zum Funktionsverlust des Gens mit Auswirkungen auf das Genprodukt und seine Interaktionen in Stoffwechsel- und Signalwegen. Diese Vorstellungen sind in Knudsons „second hit-Modell“ beschrieben (Abb. 1), das auf Tumorsuppressorgene Anwendung findet.

Für die Gene BRCA1 und BRCA2 werden Mutationen, LOH und Hypermethylierung als mögliche second hits diskutiert.

1.5. Diagnose und Prävention bei familiärem Brustkrebs

Ein sich abzeichnendes Grundverständnis der Entstehung des Mammakarzinoms hat zu verstärkten Anstrengungen in der Früherkennung und Behandlung von Brustkrebs geführt. Frauen werden heute durch Haus- und Frauenärzte auf das Gefahrenpotenzial hingewiesen und zur Selbstuntersuchung durch Abtasten der Brust angehalten. Darüber hinausgehend, werden Mammographie-Früherkennungsuntersuchungen¹¹empfohlen. Durch solche Untersuchungen können auch Tumore mit einer Größe unter 10 mm erkannt werden, die durch Abtastung nicht diagnostizierbar sind. Eine tatsächliche Effizienz für die Erhöhung der Lebenserwartung bei Brustkrebsdiagnose ist umstritten und von der Durchführung und Befundung abhängig [Ringash, 2001; Höldke, 2002].

Die Durchführung einer genetischen Diagnostik setzt die Beratung von gesunden oder erkrankten Personen mit vermuteter genetischer Prädisposition und ihrer Angehörigen voraus [Bundesärztekammer, 1998]. Ausgehend von allgemeinen wissenschaftlichen Erkenntnissen werden Rückschlüsse auf die Erkrankungswahrscheinlichkeit der Person oder der Angehörigen gezogen und ggf. präventive Maßnahmen ergriffen. Um häufig auftretende psychische Belastungen zu vermeiden, muss in einem beratenden Gespräch zwischen Arzt und Ratsuchender im Vorfeld der Diagnostik zwischen möglichem Nutzen und denkbaren Nachteilen abgewogen werden [Bundesärztekammer, 1998; Brandt-Rauf, 2000]. Bestandteil der genetischen Diagnostik beim Mammakarzinom ist die molekulargenetische Analyse der Gene BRCA1 und BRCA2. Dabei kann eine Komplettsequenzierung der Gene oder einzelner Exons¹²erfolgen.

Kann eine familiär vorhandene Mutation für ein Familienmitglied ausgeschlossen werden, ist für diese Person von keinem erhöhten Risiko auszugehen. Es gelten die allgemeinen Empfehlungen der Krebsfrüherkennung.

Ist ein Nachweis einer familiären Mutation in den Genen BRCA1 und BRCA2 nicht möglich, obwohl in der Familie bereits mehrere Fälle von Brust- und Eierstockkrebs aufgetreten sind, muss dennoch von einem erhöhten Risiko ausgegangen werden. In diesem Fall ist eine Mutation in einem noch nicht identifizierten Brustkrebsgen wahrscheinlich [Easton, 1999; Hedenfalk et al, 2003]. Aus der Kenntnis eines erhöhten Risikos lassen sich Präventionsstrategien ableiten, die das Risiko einer Erkrankung vermindern können oder eine Früherkennung ermöglichen.

Die primäre Prävention hat das Ziel, eine Erkrankung zu verhindern. Dazu können chemopräventive und operative Maßnahmen ergriffen werden. Zur Verhinderung der Erkrankung an einem Mammakarzinom wird die Gabe von Tamoxifen diskutiert, das allerdings im Verdacht steht, die Gesamtmortalität der einnehmenden Frauen zu erhöhen [Fisher et al, 1998; Kuschel et al, 2000; Powles et al, 2002]. Mit Erfolg werden dagegen Anti-Östrogene eingesetzt. Bei Frauen mit Keimbahnmutationen in den Genen BRCA1- und BRCA2 ist kein Erfolg nachweisbar [Kiechle et al, 2002]. Die Einnahme hormoneller Kontrazeptiva (umgangssprachlich Pille) vermindert die Wahrscheinlichkeit an einem Ovarialkarzinom zu sterben um mehr als 50%, erhöht aber die Brustkrebsinzidenz [Beral et al, 1999]. Effektive und dokumentierte Wirksamkeiten scheinen operative Eingriffe zu bieten. Bei der Mastektomie wird die Brustdrüse einschließlich des Lobus axillaris, der Brustwarze und der Pektoralisfaszie entfernt. Mit einem zusätzlichen Entfernen eines Teils der Haut kann das Brustdrüsengewebe und damit das Risiko der Erkrankung an einem Mammakarzinom um bis zu 99% reduziert werden [Kiechle et al, 2002].

Ziel der sekundären Prävention ist eine frühzeitige Erkennung eines Tumors, um die Mortalität zu senken. Ein engmaschiges Früherkennungsprogramm zum Mammakarzinom beinhaltet eine im Alter von 18 bis 21 Jahren beginnende monatliche Selbstinspektion der Brust, eine regelmäßige jährliche Untersuchung der Brust durch den Gynäkologen ab einem Alter von 25 Jahren und eine jährliche Mammographie i.d.R. ab dem 30. Lebensjahr. Aufgrund einer sehr hohen Gewebedichte lassen sich Mammakarzinome vor dem 40. Lebensjahr durch Mammographie nur schwer nachweisen. Da erblich bedingt häufig ein junges Erkrankungsalter vorliegt, werden ergänzend der Ultraschall ab dem 25. Lebensjahr und die Magnetresonanztomographie ab dem 30. Lebensjahr empfohlen.

Tertiäre Prävention wird bei Frauen angewendet, die bereits an einem Mamma- oder Ovarialkarzinom erkrankt sind, um Nachsorge zu treffen und einem Zweitkarzinom vorzubeugen. Es werden die Möglichkeiten der primären und sekundären Prävention genutzt.

1.6. Zielstellung

Ziel der Arbeit war es, einen Beitrag zur Erforschung der Karzinogenese bei erblichem Brustkrebs zu leisten. Bisher ist bekannt, dass eine heterozygote Keimbahnmutation eine funktionsfähige Genkopie hinterlässt, die die Aufgaben des Gens im Organismus vollständig übernehmen kann. Erst ein zweites Ereignis, ein second hit, führt zu einem vollständigen Ausfall der Genfunktion. Als second hits sind bei erblichem Brustkrebs verschiedene Ereignisse in der Diskussion. Mit dieser Arbeit sollten second hit- Ereignisse untersucht werden und die Ergebnisse in die Diskussion eingebracht werden. Zu diesem Zweck wurde Tumorgewebe von Patientinnen mit bereits nachgewiesener Keimbahnmutation in den Genen BRCA1 und BRCA2 untersucht. In dieser Arbeit beschränkte ich mich auf LOH und Hypermethylierung als mögliche second hit- Ereignisse. Sowohl LOH als auch Hypermethylierung sind in der Literatur bereits als mögliche second hit- Ereignisse beschrieben, allerdings noch nicht genügend qualitativ und quantitativ unterlegt. Eine zusätzliche Untersuchung kleiner somatischer Mutationen und deren Bedeutung als second hit wäre für eine Diplomarbeit zu umfangreich gewesen.

Die Etablierung von Methoden zum Nachweis von LOH und Hypermethylierung am Institut für Humangenetik der Universität Leipzig war wesentlicher Bestandteil der Arbeit. So wurden methodische Ansätze zur DNA-Isolierung aus, in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten, Gewebeproben entwickelt. Für die Untersuchung von LOH-Ereignissen standen bereits Verfahrensweisen zur Verfügung, wogegen zur Untersuchung des Methylierungsstatus Verfahren und Reaktionsbedingungen etabliert werden mussten.

2. Material und Methoden

2.1. Auswahl der Patientinnen

Für die Experimente wurden 16 Patientinnen ausgewählt, die am Institut für Humangenetik der Universität Leipzig betreut wurden. Alle Patientinnen stammen aus Hochrisikofamilien¹³, waren zu Untersuchungsbeginn (April 2003) an Brustkrebs erkrankt und hatten sich einer Operation unterzogen. Für alle Patientinnen mit Ausnahme von 635/99 und 249/02 waren Daten einer Komplettsequenzierung der Gene BRCA1 und BRCA2 vorhanden. Bei 635/99 lag eine Sequenzierung von BRCA1, Exon 5, bei 249/02 eine Sequenzierung von BRCA1, Exon 11 vor (siehe Tabelle 2.1.1). 15 Patientinnen waren weiblich, ein Patient war männlich (147/02). Das Alter der Patientinnen bei erster Diagnose einer Mammakarzinomerkrankung liegt zwischen 27 und 72 Jahren. Das Durchschnittsalter beträgt 48 Jahre.

Tabelle 2.1.1: Mutationsprofil der ausgewählten Patientinnen; Sequenzierung aus Vollblut. Abkürzungen: Labor-ID = Identifikationsnummer am Institut für Humangenetik der Universität Leipzig; Alter = Lebensalter der Patientinnen bei Stellung der Diagnose einer Mammakarzinomerkrankung; NT = Nukleotid; AS = Aminosäure; M = Mutation; MS = missense; NS = nonsense; FS = frameshift; P = Polymorphismus; UV = unklassifizierte Variante.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

[...]

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¹“Infectious and parasitic diseases and Respiratory infections”

²Angaben für das Jahr 2002

³Immortalisierung beschreibt den Zustand einer Zelle, unbegrenzt zu wachsen, ohne dass sich der Phänotyp (das äußere Erscheinungsbild) ändert.

⁴Durch die Transformation ist die Zelle nicht mehr in der Lage, normale Wachstumsbeschränkungen einzuhalten. Sie wird von Faktoren unabhängig, die sie normalerweise für das Zellwachstum benötigt.

⁵Die Metastasierung beschreibt das Stadium, in der die Zelle die Möglichkeit erlangt, in normales Gewebe einzudringen. Sie kann das ursprüngliche Gewebe verlassen und im Körper „Kolonien“ bilden.

⁶Es wurden 15 Frauen und 1 Mann untersucht. Die im Folgenden verwendeten weiblichen Bezeichnungen schließen alle Probanden ein und tragen der Bedeutung von Brustkrebs insbesondere für Frauen Rechnung.

⁷Im Folgenden werden Gene kursiv hervorgehoben, bspw. BRCA1. Die Genprodukte werden als unformatierter Fließtext dargestellt, bspw. BRCA1.

⁸ALU-Sequenzen gehören zur Familie der SINES (short interspersed sequences) der Retroposons. Sie bewegen sich über einen RNA-vermittelten Prozess, der den Einsatz einer reversen Transkriptase erfordert. Bei der Insertion entstehen Zielstellen-Duplikationen. ALU-Sequenzen sind etwa 300 Nucleotide lang und werden vom Restriktionsenzym AluI geschnitten. Im haploiden Genom kommen ALU-Sequenzen mit 500000 Kopien vor [Lewin, 1998 (S. 496 - 97); Alberts et al, 1995 (S. 464 - 65)].

⁹Missense-Mutationen beschreiben Punktmutationen in der DNA-Sequenz, in deren Folge die Aminosäurenabfolge des codierten Proteins geändert wird. Häufig ist das codierte Protein dennoch funktionsfähig.

¹⁰Bei einer nonsense-Mutation kommt es durch eine Punktmutation in der DNA-Sequenz zum Einfügen eines irregulären Stoppcodons. Durch das Stoppcodon wird die Transkription vorzeitig abgebrochen.

¹¹Mammographie = Röntgenuntersuchung der Brust

¹²Exons sind Abschnitte der DNA-Sequenz des Gens, die für ein Genprodukt codieren. Zwischen den Exons befinden sich Introns, die keine codierende Funktion wahrnehmen.

¹³Gemäß der Klassifikation der Deutschen Krebshilfe, siehe unter 2.4. dieser Arbeit.