Steroidhormone werden als Reaktion auf eine Vielzahl neuro-endokriner Aktivitäten synthetisiert. Sie üben beim Menschen einen wesentlichen Einfluß auf das Wachstum, die Entwicklung der Gewebe und auf die Homöostase aus (Lewin, 1991). Die Nebennieren sezernieren über 30 Steroide, die alle vom Cholesterin abgeleitet sind (s. Abbildung 1). Sie lassen sich in fünf Hauptklassen einteilen: Gestagene, Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Androgene und Estrogene (früher als Östrogene bezeichnet). Progesteron, ein Gestagen, bereitet den Uterus für die Aufnahme des befruchteten Eies vor, es ist außerdem für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft verantwortlich. Androgene, wie Testosteron, bewirken die Ausprägung der sekundären männlichen, Estrogene die der sekundären weiblichen Geschlechtsmerkmale. Estrogene wirken außerdem am Eireifungszyklus und dem Wachstum der Brust mit. Glucocorticoide (wie Cortisol) fördern die Gluconeogenese und die Glucogenbildung, und erhöhen darüber hinaus den Fett- und Proteinabbau. Mineralcorticoide (Aldosteron) sind für die erhöhte Reabsorption von Na+, Cl- und HCO3- in der Niere verantwortlich, was in der Erhöhung des Blutvolumens und des Blutdrucks zum Ausdruck kommt. Diese Hormone werden hauptsächlich in den folgenden Organen synthetisiert: Gestagene im Corpus luteum, Estrogene in den Ovarien, Androgene in den Testes, Glucocorticoide und Mineralocorticoide in der Nebennierenrinde (Stryer, 1983). Der Wirkmechanismus der Steroide basiert auf einer hochspezifischen Bindung an die entsprechenden intrazellulären Rezeptoren. Diese üben einen direkten Einfluß auf die Genexpression und damit auf die Proteinsynthese aus.
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1.1 Steroidhormone
1.1.1 Estrogene
1.1.1.1 Estrogenabhängige Tumore
1.1.1.2 Antiestrogene
1.2 Apoptose
1.2.1 Signaltransduktion apoptotischer Prozesse
1.2.1.1 Tumor-Nekrosis-Faktor α (TNFα)
1.2.1.2 TNF-Rezeptoren
1.3 Zielsetzung
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Zellkultur
2.1.1 Zellinien
2.1.2 Kulturbedingungen
2.1.3 Passagieren der Zellen
2.1.4 Hormonbehandlung
2.2 RNA-Präparation
2.2.1 RNA-Präparation mittels Trizol®
2.2.2 Quantifizierung von Nukleinsäuren
2.2.3 DNase-Verdau
2.3 Semiquantitative PCR (Diel et al. 1996; Murphy et al., 1990)
2.3.1 Ableiten der Primer
2.3.2 cDNA-Synthese
2.3.3 PCR (Mullis et al., 1987)
2.3.4 Gelelektrophorese der PCR-Fragmente (Sambrock et al., 1989)
2.3.5 Dokumentation der Gele
2.4 Proteinisolierung aus MCF-7 Zellen
2.4.1 Proteinisolierung
2.4.2 Konzentrationsbestimmung
2.5 Western-Blot
2.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Laemmli, 1970)
2.5.2 Coomassie-Brilliant-Blue Färbung (Frazekas et al., 1963)
2.5.3 Semi-dry Blotting (Towbin et al., 1979)
2.5.4 Antikörperinkubation
2.5.5 Proteinnachweis durch das Lumi-LightPlus System
2.6 Material
2.6.1 Laborgeräte
2.6.2 Chemika lien
2.6.3 PCR Primer
2.6.4 Enzyme, Kits und weitere Materialien
2.6.5 Antikörper
3 ERGEBNISSE
3.1 Proteinisolierung aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen
3.1.1 Konzentrationsbestimmung der löslichen Proteinfraktionen
3.1.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der Proteinproben
3.2 Western-Blot Analyse der Regulation des TNF-Rezeptors 2
3.3 Quantitative Analyse der mRNA-Expression mittels RT-PCR
3.3.1 Visuelle Qualitätskontrolle der isolierten RNA
3.3.2 RNA Präparation aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen
3.4 Semiquantitative PCR
4 DISKUSSION
4.1 MCF-7 Zellen als Modellsystem
4.2 Regulation des TNF-Rezeptors 2 nach Faslodex-Applikation
4.2.1 Western-Blot-Analyse
4.2.2 Semiquantitative PCR
4.2.3 Mechanismus der Regulation des TNF-Rezeptors 2
4.3 Funktion von TNF-R2 im Rahmen der Apoptoseinduktion
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK
Zielsetzung & Themen
Diese Arbeit untersucht den Einfluss des Antiestrogens Faslodex auf die Expression des TNF-Rezeptors 2 in humanen Brustkrebszellen der Linie MCF-7. Das Ziel ist es, durch molekularbiologische Methoden wie Western-Blot-Analyse und semiquantitative RT-PCR zu klären, wie Faslodex die Regulation dieses Rezeptors beeinflusst, um den Mechanismus der Apoptoseinduktion besser zu verstehen.
- Charakterisierung und Quantifizierung der TNF-Rezeptor 2 Expression
- Etablierung der Western-Blot-Analyse für das untersuchte Modellsystem
- Analyse der mRNA-Regulation mittels semiquantitativer PCR
- Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Faslodex-Behandlung und apoptotischen Signalwegen
Auszug aus dem Buch
1.2 Apoptose
Der Begriff Apoptose bezeichnet eine Reihe gesteuerter, biochemischer Reaktionsmuster mit morphologisch sichtbaren Veränderungen, die zum programmierten Zelltod führen. Es ist ein Prozeß, dem eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Fortbestand eines Organismus zukommt. Unerwünschte und überflüssige körpereigene Zellen werden entfernt. Dies spielt neben der Differenzierung von Immunzellen und der Embryonalentwicklung auch in der Beseitigung von Tumorzellen eine wichtige Rolle. Apoptose findet unter physiologischen Bedingungen statt; ist ein aktiver, energiekonsumierender, nicht reversibler Prozeß, bei dem die Veränderungen vom Zellkern ausgehen. Sie betrifft in der Regel Einzelzellen. Am Ende ist der Vorgang von einer Nekrose nicht zu unterscheiden, aber, da auf Einzelzellen beschränkt, tritt meist keine lokale Entzündung auf. Während die Apoptose Kennzeichen des vom Körper gewünschten physiologischen Zelltods ist, ist die Nekrose pathologisch, durch Zellschädigung, induziert.
Typische Kennzeichen der Apoptose sind Kondensation und Fragmentierung des Chromatins, Abschnürungen der Plasmamembran und Verkleinerung des Zellvolumens sowie schließlich der vollständige Zerfall der Zelle in apoptotische Vesikel, die innerhalb kurzer Zeit phagozytiert werden. Der makromolekulare Abbau geschieht hierbei durch Proteasen und Endonukleasen. Die letztgenannten Enzyme bauen die DNA der Zelle schrittweise zu Fragmenten zwischen 50 und 200 bp Länge ab, die sich elektrophoretisch als sog. DNA-Leiter nachweisen lassen.
Zusammenfassung der Kapitel
1 EINLEITUNG: Grundlagen zu Steroidhormonen, der Rolle von Estrogenen bei Tumoren sowie eine Einführung in die Apoptose und die TNF-Rezeptor-Signalwege.
2 MATERIAL UND METHODEN: Detaillierte Beschreibung der Zellkultur, RNA-Präparation, semiquantitativen PCR und Western-Blot-Protokolle zur Untersuchung von MCF-7 Zellen.
3 ERGEBNISSE: Präsentation der experimentellen Daten zur Proteinisolierung und Analyse der TNF-R2 Expression nach Faslodex-Behandlung mittels Western-Blot und RT-PCR.
4 DISKUSSION: Interpretation der Befunde, insbesondere zur Regulation des TNF-Rezeptors 2 und dessen funktioneller Rolle bei der Apoptoseinduktion in Tumorzellen.
5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK: Zusammenfassende Bewertung der Ergebnisse und Vorschläge für zukünftige Forschungsansätze zur Resistenzbildung.
Schlüsselwörter
Faslodex, MCF-7, Brustkrebszellen, TNF-Rezeptor 2, Apoptose, Western-Blot, semiquantitative PCR, mRNA-Expression, Antiestrogene, Signaltransduktion, NF-κB, Tumortherapie, Rezeptorregulation.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in der Arbeit grundlegend?
Die Arbeit untersucht den molekularen Einfluss des Antiestrogens Faslodex auf die Regulation und Expression des TNF-Rezeptors 2 in der Brustkrebszelllinie MCF-7.
Welche Themenfelder werden zentral behandelt?
Die zentralen Themen sind endokrine Tumortherapie, Mechanismen des programmierten Zelltods (Apoptose), sowie molekularbiologische Analysemethoden von Proteinen und mRNAs.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das primäre Ziel ist die Charakterisierung und Quantifizierung der Proteinexpression des TNF-Rezeptors 2 unter dem Einfluss von Faslodex, um mögliche Regulationsmechanismen aufzudecken.
Welche wissenschaftlichen Methoden werden verwendet?
Es kommen insbesondere die Western-Blot-Analyse zur Bestimmung der Proteinkonzentration und -identität sowie die semiquantitative RT-PCR zur mRNA-Analyse zum Einsatz.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in eine detaillierte methodische Beschreibung der durchgeführten Laboranalysen sowie die anschließende Auswertung der Ergebnisse hinsichtlich der TNF-R2 Regulation.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Zu den wichtigsten Begriffen zählen Faslodex, MCF-7, TNF-Rezeptor 2, Apoptose, Western-Blot und Signaltransduktion.
Welche Bedeutung hat das Faslodex-induzierte 80 kDa Protein?
Es wird vermutet, dass dieses Protein der TNF-Rezeptor 2 ist, da es durch Faslodex stark induziert wird und in seinem Molekulargewicht mit Literaturangaben für diesen Rezeptor übereinstimmt.
Warum konnte die Regulation auf mRNA-Ebene nicht eindeutig verifiziert werden?
Die Ergebnisse der RT-PCR waren nicht eindeutig, was auf nicht optimale Amplifikationsbedingungen oder die Notwendigkeit einer Optimierung der Primer-Konzentrationen hindeutet.
- Quote paper
- Marco Lennartz (Author), 2000, Molekulare Analyse der Expression des TNF-Rezeptors 2 in der humanen Brustkrebszellinie MCF-7 nach Applikation von Antiestrogenen, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/8517
