Molekulare Analyse der Expression des TNF-Rezeptors 2 in der humanen Brustkrebszellinie MCF-7 nach Applikation von Antiestrogenen

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungen

1 Einleitung
1.1 Steroidhormone
1.1.1 Estrogene
1.1.1.1 Estrogenabhängige Tumore
1.1.1.2 Antiestrogene
1.2 Apoptose
1.2.1 Signaltransduktion apoptotischer Prozesse
1.2.1.1 Tumor-Nekrosis-Faktor a (TNFa)
1.2.1.2 TNF-Rezeptoren
1.3 Zielsetzung

2 Material und Methoden
2.1 Zellkultur
2.1.1 Zellinien
2.1.2 Kulturbedingungen
2.1.3 Passagieren der Zellen
2.1.4 Hormonbehandlung
2.2 RNA-Präparation
2.2.1 RNA-Präparation mittels Trizol®
2.2.2 Quantifizierung von Nukleinsäuren
2.2.3 DNase-Verdau
2.3 Semiquantitative PCR (Diel et al. 1996; Murphy et al., 1990)
2.3.1 Ableiten der Primer
2.3.2 cDNA-Synthese
2.3.3 PCR (Mullis et al., 1987)
2.3.4 Gelelektrophorese der PCR-Fragmente (Sambrock et al., 1989)
2.3.5 Dokumentation der Gele
2.4 Proteinisolierung aus MCF-7 Zellen
2.4.1 Proteinisolierung
2.4.2 Konzentrationsbestimmung
2.5 Western-Blot
2.5.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (Laemmli, 1970)
2.5.2 Coomassie-Brilliant-Blue Färbung (Frazekas et al., 1963)
2.5.3 Semi-dry Blotting (Towbin et al., 1979)
2.5.4 Antikörperinkubation
2.5.5 Proteinnachweis durch das Lumi-LightPlus System
2.6 Material
2.6.1 Laborgeräte
2.6.2 Chemikalien
2.6.3 PCR Primer
2.6.4 Enzyme, Kits und weitere Materialien
2.6.5 Antikörper

3 Ergebnisse
3.1 Proteinisolierung aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen
3.1.1 Konzentrationsbestimmung der löslichen Proteinfraktionen
3.1.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese der Proteinproben
3.2 Western-Blot Analyse der Regulation des TNF-Rezeptors 2
3.3 Quantitative Analyse der mRNA-Expression mittels RT-PCR
3.3.1 Visuelle Qualitätskontrolle der isolierten RNA
3.3.2 RNA Präparation aus Faslodex behandelten MCF-7 Zellen
3.4 Semiquantitative PCR

4 Diskussion
4.1 MCF-7 Zellen als Modellsystem
4.2 Regulation des TNF-Rezeptors 2 nach Faslodex -Applikation
4.2.1 Western-Blot -Analyse
4.2.2 Semiquantitative PCR
4.2.3 Mechanismus der Regulation des TNF-Rezeptors 2
4.3 Funktion von TNF-R2 im Rahmen der Apoptoseinduktion

5 Zusammenfassung und Ausblick

Literaturverzeichnis

Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1 Einleitung

1.1 Steroidhormone

Steroidhormone werden als Reaktion auf eine Vielzahl neuro-endokriner Aktivitäten synthetisiert. Sie üben beim Menschen einen wesentlichen Einfluß auf das Wachstum, die Entwicklung der Gewebe und auf die Homöostase aus (Lewin , 1991). Die Nebennieren sezernieren über 30 Steroide, die alle vom Cholesterin abgeleitet sind (s. Abbildung 1). Sie lassen sich in fünf Hauptklassen einteilen: Gestagene, Glucocorticoide, Mineralocorticoide, Androgene und Estrogene (früher als Östrogene bezeichnet). Progesteron, ein Gestagen, bereitet den Uterus für die Aufnahme des befruchteten Eies vor, es ist außerdem für die Aufrecht­erhaltung der Schwangerschaft verantwortlich. Androgene, wie Testo­steron, bewirken die Ausprägung der sekundären männlichen, Estro­gene die der sekundären weiblichen Geschlechtsmerkmale. Estrogene wirken außerdem am Eireifungszyklus und dem Wachstum der Brust mit. Glucocorticoide (wie Cortisol) fördern die Gluconeogenese und die Glucogenbildung, und erhöhen darüber hinaus den Fett- und Proteinab­bau. Mineralcorticoide (Aldosteron) sind für die erhöhte Reabsorption von Na+, Cl- und HCO3- in der Niere verantwortlich, was in der Erhö­hung des Blutvolumens und des Blutdrucks zum Ausdruck kommt. Diese Hormone werden hauptsächlich in den folgenden Organen syn­thetisiert: Gestagene im Corpus luteum, Estrogene in den Ovarien, An­drogene in den Testes, Glucocorticoide und Mineralocorticoide in der Nebennierenrinde (Stryer , 1983). Der Wirkmechanismus der Stero­ide basiert auf einer hochspezifischen Bindung an die entsprechenden intrazellulären Rezeptoren. Diese üben einen direkten Einfluß auf die Genexpression und damit auf die Proteinsynthese aus.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Synthese der Steroidhormone

1.1.1 Estrogene

Estrogene, die als weibliche Geschlechtshormone bezeichnet werden können, wirken regulatorisch auf geschlechtsspezifische Prozesse. (Jensen et al., 1973). Der wichtigste Vertreter dieser Stoffklasse ist, neben Estron und Estriol, das Estradiol (E2), welches mit der höchsten Affinität am Estrogenrezeptor bindet. Aufgrund seines lipophilen Cha­rakters gelangt es durch die Zellmembran direkt zum Wirkungsort in der Zelle, dem Estrogenrezeptor im Zellkern . Diesen findet man primär in den Zielgeweben des Hormons wie Uterus, Vagina, Ovarien und dem Brustdrüsenepithel. Die Regulation der Estrogensynthese erfolgt im we­sentlichen durch die Ausschüttung der Gonadotropine in der vom Hy­pothalamus gesteuerten Hypophyse. Die Synthese folgt im weiblichen Geschlecht einem zyklischen Muster innerhalb des Menstruationskreis­laufes. Geringe Mengen von Estrogen werden zudem im Muskel- und Fettgewebe ohne Steuerung durch Gonadotropine synthetisiert. Neben den natürlichen Liganden des Estrogen-Rezeptors wurden künstliche Substanzen synthetisiert, die in der Lage sind mit hoher Affinität am Rezeptor zu binden. Einige davon wie die Antiestrogene Tamoxifen oder Faslodex (ICI 182780) wirken als kompetetive Inhibitoren des Rezep­tors und sind somit in der endokrinen Therapie von Tumorerkrankun­gen einsetzbar.

1.1.1.1 Estrogenabhängige Tumore

Das Mammakarzinom ist das häufigste Malignom der Frauen in der westlichen Welt und nach wie vor Gegenstand intensiver Forschung. In den USA sind 32% aller bei Frauen auftretenden malignen Neoplasien Mamma-Karzinome, gefolgt vom kolorektalen Karzinom mit nur 14% (Silverberg et al., 1990). In der Altersgruppe der fünfundzwanzig- bis vierunddreißigjährigen Frauen in den Vereinigten Staaten ist der Brust­krebs die häufigste Ursache eines Versterbens durch eine Krankheit, in der Gruppe der fünfunddreißig- bis vierundfünfzigjährigen Frauen sogar die häufigste Einzeltodesursache (Silverberg et al., 1990). Eine Heilung durch operative Entfernung kann meist nur erreicht werden, bevor der Tumor Metastasen gebildet hat. Ist dieses Stadium bereits erreicht, kann der Krebs meist nur noch mit Chemo- oder endokriner Therapie bekämpft werden. Im Gegensatz zur Chemotherapie wird die endokrine Therapie von den Patienten besser toleriert. Die endokrine Therapie zielt darauf ab in die normale Steroidhormon-Regulation des Zell­wachstums einzugreifen. Dies kann zum einen durch eine Unterdrüc­kung der Produktion der natürlichen Steroide, oder durch Verabrei­chung von Estrogen-Antagonisten, sog Antiestrogenen, erreicht wer­den. Ein wichtiger Indikator für eine erfolgreiche endokrine Therapie ist das Vorhandensein von Estrogenrezeptoren (ER) in den Tumorzellen. Etwa 70% aller Brusttumore enthalten den Estrogen-Rezeptor und sind somit sensitiv gegenüber Wachtumshemmung durch Antiestrogene. Ist dieser Rezeptor im Tumorgewebe nicht nachweisbar oder mutiert (in­trinsische Resistenz), so bedeutet dies eine schlechte Prognose im Hin­blick auf einen Heilungserfolg mittels dieser Therapieform. Neben dieser Einschränkung des Einsatzbereiches von Antiestrogenen zur Tumorbe­kämpfung, zeigt sich noch ein weiteres Problem. Leider ist bei vielen Patienten, nach anfänglich gutem Ansprechen auf die Therapie, ein all­mähliches Abklingen der Wirkung im Laufe der Medikation festzustellen. Verantwortlich hierfür ist die Ausbildung von Resistenzen, die sich in einer Umwandlung von anfangs Estrogen-abhängigen zu Estrogen-un­abhängigen Tumorzellen manifestieren (Larsen et al., 1999). Die Me­chanismen, die einer intrinsischen Resistenz oder der Entwicklung von Resistenz nach anfänglicher Wirksamkeit der endokrinen Therapie zu­grunde liegen, sind noch weitestgehend unbekannt. Gelänge es diese Mechanismen aufzuklären, so könnte man in Zukunft neue Substanz­klassen entwickeln, die eine wirksamere oder länger wirkende Therapie ermöglichten.

1.1.1.2 Antiestrogene

Antiestrogene konkurrieren mit dem natürlichen Steroid um die Bindung am spezifischen Estrogen-Rezeptor. Die Wirkung dieser Substanzen basiert somit auf der kompetetiven Inhibition des Estrogenrezeptors, die zu einer Blockierung der Estrogen-abhängigen Zellproliferation füh­ren kann. Gleichzeitig bewirken Antiestrogene eine Änderung des kom­plexen Expressionsmusters vieler Rezeptoren und Effektormoleküle der Zelle. Dies führt, neben dem antiproliferativen Effekt, beispielsweise zum Auslösen von Apoptose, dem programmierten Zelltod (Michna & Tenniswood, 1995; Perry et al., 1995). Das zur Zeit in der endokrinen Therapie meistverwendete Antiestrogen ist Tamoxifen. Es steht jedoch im Verdacht, neben der dokumentierten Estrogen-antagonistischen Wir­kung auf Brustdrüsengewebe, auch eine proliferative Wirkung auf Tu­morzellen in anderen Geweben auszuüben und damit deren Wachstum zu unterstützen. In der klinischen Phase befindet sich zur Zeit ein wei­teres Antiestrogen namens Faslodex. Es handelt sich hierbei nicht wie im Fall von Tamoxifen um einen Partialantagonisten, sondern um eine Substanz, die rein antagonistisch gegenüber Estrogen wirkt. Faslodex bewirkt eine sehr viel stärkere Proliferationshemmung in Mammakarzi­nomzellen als Tamoxifen, ohne daß eine agonistische Wirkung auf an­dere Gewebe festzustellen ist. Es induziert darüber hinaus in einem viel stärkeren Maße apoptotische Prozesse und scheint somit geeigneter für eine endokrine Therapie zu sein.

1.2 Apoptose

Der Begriff Apoptose bezeichnet eine Reihe gesteuerter, biochemischer Reaktionsmuster mit morphologisch sichtbaren Veränderungen, die zum programmierten Zelltod führen. Es ist ein Prozeß, dem eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Fortbestand eines Organismus zu­kommt. Unerwünschte und überflüssige körpereigene Zellen werden entfernt. Dies spielt neben der Differenzierung von Immunzellen und der Embryonalentwicklung auch in der Beseitigung von Tumorzellen eine wichtige Rolle. Apoptose findet unter physiologischen Bedingungen statt; ist ein aktiver, energiekonsumierender, nicht reversibler Prozeß, bei dem die Veränderungen vom Zellkern ausgehen. Sie betrifft in der Regel Einzelzellen. Am Ende ist der Vorgang von einer Nekrose nicht zu unterscheiden, aber, da auf Einzelzellen beschränkt, tritt meist keine lokale Entzündung auf. Während die Apoptose Kennzeichen des vom Körper gewünschten physiologischen Zelltods ist, ist die Nekrose pa­thologisch, durch Zellschädigung, induziert.

Typische Kennzeichen der Apoptose sind Kondensation und Fragmen­tierung des Chromatins, Abschnürungen der Plasmamembran und Ver­kleinerung des Zellvolumens sowie schließlich der vollständige Zerfall der Zelle in apoptotische Vesikel, die innerhalb kurzer Zeit phagozytiert werden. Der makromolekulare Abbau geschieht hierbei durch Proteasen und Endonukleasen. Die letztgenannten Enzyme bauen die DNA der Zelle schrittweise zu Fragmenten zwischen 50 und 200 bp Länge ab, die sich elektrophoretisch als sog. DNA-Leiter nachweisen lassen. Obwohl diese Vorgänge durch eine komplexe Vielfalt potentieller Aktivatoren ausgelöst werden (Zytokine, Onkogene, Wachtumsfaktormangel und DNA-schädigende Substanzen) liegt ihnen anscheinend immer ein einheitlicher, hochkonservierter Mechanismus zugrunde. Er besteht aus einem intrazellulären System von Proteasen der ICE/CED-3 Familie (im folgenden als Caspasen bezeichnet), die durch Abbau zellulärer Substrate den programmierten Zelltod vollstrecken.

1.2.1 Signaltransduktion apoptotischer Prozesse

Am Beginn der Signalkaskade des programmierten Zelltodes steht eine Familie von Oberflächenrezeptoren, die zur TNF-Superfamilie zusam­mengefaßt werden. Die wichtigsten Vertreter sind der Fas-Rezeptor (CD95), die TNF-Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 sowie CD40, CD27 und CD30. In der zytoplasmatischen Domäne des TNF-R1 und des Fas-Rezeptors findet man Bereiche mit sehr hoher Homologie, die als death domain bezeichnet werden. Die Aktivierung dieser Rezeptoren durch deren natürliche Liganden oder agonistische Antikörper führt zu einer Trimerisierung der Rezeptoren und zur Anlagerung einer Reihe von Ef­fektormolekülen an die intrazelluläre death domain. Die wichtigsten Ef­fektormoleküle sind das TNF-R1 associated death domain protein (TRADD) und das Fas-associated protein with death domain (FADD). Der so entstandene death inducing signaling complex (DISC) induziert die kaskadenartige Aktivierung einer ganzen Familie von Cystein-Pro­teasen, die als Caspasen bezeichnet werden. Der Caspase-8 (FLICE) kommt dabei eine Schlüsselrolle zu. Die Spaltung spezifischer Substrate, wie z.B. Lamin, Actin und poly(ADP)Ribose Polymerase, ist dann letzt­endlich für die Ausprägung der typischen morphologischen Veränderun­gen der Zellen bzw. Zellkerne und für die Degradierung der DNA ver­antwortlich. Zwei Signalwege, die zur Auslösung der Apoptose führen, sind heute teilweise aufgeklärt. Im ersten Fall assoziiert der aktivierte TNF-Rezeptor 1 Komplex über die death domain mit TRADD und FADD. In einem zweiten Schritt bindet die proenzymatische Form der Caspase-8 (FLICE) über die death domain von FADD an den Komplex. Die Bindung führt zur Aktivierung der Caspase-8, die dann die Caspase-Kaskade auslöst. Dieser Signalweg kann nicht durch Bcl-2 blockiert werden. Der zweite Signalweg führt über die Assoziation der Effektor­moleküle TRADD und RIP. Eine Bindung dieser Proteine an den oligo­merisierten TNF-Rezeptor 1 kann zum einen zur Apoptoseinduktion durch Aktivierung der Caspase-Kaskade führen, zum anderen zum Überleben der Zelle durch Aktivierung von NF-kB. Eine Modulation des Apoptosesignals geschieht durch eine Molekülfamilie, die nach dem Protoonkogen Bcl-2 benannt wurde. Einige Vertreter dieser Familie sind in der Lage die Apoptose zu hemmen (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1). Über die genaue Funktion des TNF-Rezeptors 2 ist wenig bekannt. Der Rezeptor besitzt keine death domain und interagiert daher nicht mit den Effek­torproteinen FADD, RIP und TRADD. Seine zytoplasmatische Domäne bindet an Proteine, welche als TRAF-1 und TRAF-2 bezeichnet werden. Die Aktivierung des TNF-Rezeptors 2 scheint je nach Bedingungen und Zelltyp das über TNF-R1 ausgelöste Apoptosesignal zu verstärken oder zu schwächen.

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