Die Prüfung von Lebensmitteln und deren Inhalts- und Zusatzstoffe sowie die Prüfung von Arzneimitteln, von kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen auf ihre gesundheitliche Unbedenklichkeit und Umweltverträglichkeit ist gesetzlich geregelt und erfolgt unter anderem im Tierversuch [1].
Laut Tierschutzgesetz spricht man dann von Tierversuchen, „…wenn zu Versuchszwecken Behandlungen und Eingriffe am Tier bzw. an dessen Erbgut vorgenommen werden, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier bzw. für das Erbgut veränderte Tier verbunden sind“ [2]. In der Bundesrepublik Deutschland finden im Vergleich zu den Versuchstierzahlen anderer Verwendungsbereiche im Rahmen der Entwicklung und Prüfung von Arzneimitteln auf Grundlage der Bestimmungen zum Arzneimittelgesetz [3] die meisten Tierversuche statt [4]1.
Deshalb spielt der vom Gesetzgeber ausdrücklich geforderte Tierschutz im pharmazeutischen Bereich eine besondere Rolle. Es gilt daher, in diesem Bereich Prüfverfahren zu entwickeln, die einen geringeren oder schonenderen Einsatz von Versuchstieren bedeuten bzw. neben gebräuchlichen in-vivo- Verfahren auch Ersatz und Ergänzungsmethoden auf RRR– (Replacement, Refinement, Reduction) – Grundlagen anwenden[4].
Seit mehr als 100 Jahren wird nun bereits mit dem Hühnerembryo als Basisuntersuchungsmodell gearbeitet [5]. Mit der Entwicklung der HET- Embryotoxizitätsprüfung in den frühen 80- er Jahren wurden diese Grundlagenprüfungen erweitert und standardisiert. Die Prüfungen am
bebrüteten Hühnerei (HET) liefern ebenfalls Informationen hinsichtlich der Embryoletalität, Retardierung, Teratogenität und systemischer Toxizität. Darüber hinaus lassen sich mit Hilfe dieser Methode aber auch Erkenntnisse zur Immunpathologie oder zu metabolischen Aspekten, wie sie im Rahmen dieser Arbeit von besonderem Interesse sind, gewinnen.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden
1.2 Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren
1.3 Die Entwicklung des Hühnerembryos
1.4 Entwicklung der embryonalen Hühnerleber
1.5 Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen
1.5.1 Cytochrom P 450
1.5.2 Biotransformation von Fremdstoffen
1.5.3 Biotransformation von Cyclophosphamid
1.5.3.1 Cyclophosphamid
1.5.3.2 Metabolismus von Cyclophosphamid
1.6 Ziel der Arbeit
2 Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Cyclophosphamid (Reaktant)
2.1.2 Acrolein (Produkt)
2.1.3 Sonstige Chemikalien
2.1.4 Biologisches Material
2.2 Methoden
2.2.1 Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes
2.2.1.1 Inkubation der Eier und Entnahme der Lebern
2.2.1.2 Extraktion und Fraktionierung des Lebergewebes
2.2.2 Pre-Test: Bestimmung der De-O-Ethylase-Aktivität des gewonnenen Leberextraktes mit Ethoxycoumarin
2.2.2.1 Bestimmung von Hydroxy- und Ethoxycoumarin im Fluoreszenzspektrometer
2.2.2.2 Durchführung des Enzymtests mit Ethoxycoumarin
2.2.2.3 Differentielle Extraktion von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
2.2.3 Quantitative Bestimmung von Acrolein
2.2.3.1 Herstellung von Stammlösungen
2.2.3.2 Herstellung eines Derivatisierungsreagenzes zur fluorimetrischen Bestimmung von Acrolein
2.2.3.3 Die Derivatisierung von Acrolein zu 7- Hydroxychinolin und Herstellung von Eichkurven
2.2.3.4 Bestimmung von Acrolein mittels Messungen am Fluorimeter
2.2.3.5 Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von Cyclophosphamid
2.2.3.6 Neutralisieren der Enzymansätze
2.2.3.7 Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus derivatisierten und neutralisierten Enzymansätzen
2.2.3.8 Bestimmung von Acrolein durch Dünnschichtchromatographie und densitometrische Auswertung der Chromatogramme
2.2.3.9 Proteinbestimmung nach Bradford
3 Ergebnisse
3.1 Aktivitätstest für Cytochrom P 450 mit 7- Ethoxycoumarin
3.1.1 Fluoreszenz von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
3.1.2 Quantitative Bestimmung der Aktivität von Cytochrom P 450 mittels Messung der De-O-Ethylierung von Ethoxycoumarin zu Hydroxycoumarin
3.2 Kalibrierung der Fluoreszenzsignale von 7- Hydroxychinolin, dem Derivatisierungsprodukt aus Acrolein und 3- Aminophenol
3.2.1 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin im Fluorimeter
3.2.2 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin nach Dünnschichtchromatographie und Auswertung am Densitometer
3.3 Entwicklung einer Methode zur Isolierung von 7- Hydroxychinolin aus sauren Ansätzen mittels Neutralisation und anschließender Extraktion
3.3.1 Neutralisation der Derivatisierungsansätze
3.3.2 Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus sauren und neutralisierten Derivatisierungsansätzen
3.4 Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt
3.4.1 Abhängigkeit der nachgewiesenen Acroleinmengen vom Volumen des eingesetzten Leberextraktes
3.4.2 Erfassung von Acrolein bei konstantem Volumen Leberextrakt im Enzymansatz
3.4.3 Auswirkung der Inkubationszeit auf die Erfassung von Acrolein
3.5 Aktivierung von Cyclophosphamid und Nachweis des Aktivierungsproduktes Acrolein mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung der Chromatogramme
3.5.1 Quantitativer Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt von Cyclophosphamid in Abhängigkeit von der Zeit
4 Diskussion
5 Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die Aktivierung des Zytostatikums Cyclophosphamid (CPA) durch Extrakte aus der Leber von Hühnerembryonen (Tag 11) zu untersuchen. Im Fokus steht dabei die Entwicklung einer quantitativen Analysemethode für Acrolein, einem relevanten Metaboliten und Aktivierungsprodukt von CPA, mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung.
- Biologische Aktivität des Hühnerembryos als alternatives Prüfmodell zu Tierversuchen.
- Einfluss der hepatischen Biotransformation auf die Aktivierung von Prodrugs.
- Entwicklung und Optimierung von Extraktions- und Neutralisationsverfahren für Derivatisierungsansätze.
- Quantifizierung von Acrolein als Maß für die enzymatische Aktivität von Cytochrom P 450.
- Vergleich verschiedener Methoden zur Bestimmung des Aktivierungsproduktes (Fluorimetrie vs. Densitometrie).
Auszug aus dem Buch
1.1 Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden
Die Prüfung von Lebensmitteln und deren Inhalts- und Zusatzstoffe sowie die Prüfung von Arzneimitteln, von kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen auf ihre gesundheitliche Unbedenklichkeit und Umweltverträglichkeit ist gesetzlich geregelt und erfolgt unter anderem im Tierversuch [1].
Laut Tierschutzgesetz spricht man dann von Tierversuchen, „…wenn zu Versuchszwecken Behandlungen und Eingriffe am Tier bzw. an dessen Erbgut vorgenommen werden, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier bzw. für das Erbgut veränderte Tier verbunden sind“ [2].
In der Bundesrepublik Deutschland finden im Vergleich zu den Versuchstierzahlen anderer Verwendungsbereiche im Rahmen der Entwicklung und Prüfung von Arzneimitteln auf Grundlage der Bestimmungen zum Arzneimittelgesetz [3] die meisten Tierversuche statt [4]. Deshalb spielt der vom Gesetzgeber ausdrücklich geforderte Tierschutz im pharmazeutischen Bereich eine besondere Rolle. Es gilt daher, in diesem Bereich Prüfverfahren zu entwickeln, die einen geringeren oder schonenderen Einsatz von Versuchstieren bedeuten bzw. neben gebräuchlichen in-vivo- Verfahren auch Ersatz und Ergänzungsmethoden auf RRR– (Replacement, Refinement, Reduction) – Grundlagen anwenden[4].
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Beschreibt die regulatorischen Rahmenbedingungen für Tierversuche, die Bedeutung von Ersatzmethoden sowie die biologischen Grundlagen der Entwicklung des Hühnerembryos und dessen metabolischer Kapazität.
2 Materialien und Methoden: Detaillierte Auflistung der verwendeten Chemikalien und biologischen Materialien sowie der spezifischen Protokolle für die Leberextrakt-Herstellung, die Enzymtests und die quantitative Analyse mittels Derivatisierung.
3 Ergebnisse: Darstellung der Aktivitätstests für Cytochrom P 450, der methodischen Optimierung der Extraktion von 7-Hydroxychinolin und der quantitativen Erfassung von Acrolein unter variierenden Versuchsbedingungen.
4 Diskussion: Interpretation der experimentellen Ergebnisse, kritische Reflexion der gewählten Analysemethoden (Densitometrie vs. HPLC) sowie Erörterung der biologischen Variabilität.
5 Zusammenfassung: Zusammenfassende Darstellung der Erkenntnisse zur Eignung des embryonalen Hühnerleber-Modells zur Untersuchung der enzymatischen Aktivierung von Cyclophosphamid.
Schlüsselwörter
Cyclophosphamid, Acrolein, Hühnerembryo, Biotransformation, Cytochrom P 450, Enzymaktivität, Dünnschichtchromatographie, Densitometrie, 7-Hydroxychinolin, Tierversuchsersatzmethoden, Metabolisierung, Zytostatika, Leber, Extraktion, Pharmakometabolismus.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht die Aktivierung des Zytostatikums Cyclophosphamid durch die enzymatische Wirkung von Extrakten aus embryonalen Hühnerlebern und entwickelt hierfür ein quantitatives Nachweisverfahren für das Aktivierungsprodukt Acrolein.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Themen sind der Ersatz von Tierversuchen durch alternative in-vitro-Modelle, die Rolle der hepatischen Biotransformation bei der Arzneimittelaktivierung und die chemisch-analytische Quantifizierung von Metaboliten.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Das Hauptziel ist die Entwicklung einer verlässlichen Methode zur quantitativen Bestimmung des Aktivierungsproduktes Acrolein, um die Aktivität des Cytochrom P 450-Enzymsystems im embryonalen Hühnerleber-Modell messen zu können.
Welche wissenschaftliche Methode wurde verwendet?
Es wurde eine fluorimetrische Methode zur Derivatisierung von Acrolein zu 7-Hydroxychinolin angewandt, die anschließend mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung quantifiziert wurde.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil dokumentiert die Materialauswahl, die Probenaufbereitung (Homogenisierung, Fraktionierung), die Validierung der Extraktionsschritte und die Durchführung der Enzymkinetik-Versuche.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind Cyclophosphamid, Hühnerembryo-Modell, Biotransformation, Acrolein, Cytochrom P 450 sowie Densitometrie.
Warum wurde die Extraktion mit Ethylacetat als Methode gewählt?
Im Verlauf der Untersuchung stellte sich heraus, dass durch eine Neutralisation des sauren Derivatisierungsansatzes mit Natriumhydrogencarbonat die Extrahierbarkeit von 7-Hydroxychinolin mit Ethylacetat deutlich effizienter ist als mit anderen Lösungsmitteln.
Welche Probleme traten bei der Analyse von Acrolein auf?
Es zeigte sich eine unerwünschte Abnahme der Acrolein-Wiederfindungsrate bei längeren Inkubationszeiten sowie eine Beeinflussung der Fluoreszenzsignale durch andere Komponenten des Leberextrakts, was die Anwendung einer densitometrischen Auftrennung erforderlich machte.
- Quote paper
- Diplomkosmetologielehrerin Aline Wipprecht (Author), 2006, Aktivierung von Cyclophosphamid in Extrakten aus embryonalen Hühnerlebern , Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/89526
