Die Prüfung von Lebensmitteln und deren Inhalts- und Zusatzstoffe sowie die Prüfung von Arzneimitteln, von kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen auf ihre gesundheitliche Unbedenklichkeit und Umweltverträglichkeit ist gesetzlich geregelt und erfolgt unter anderem im Tierversuch [1].
Laut Tierschutzgesetz spricht man dann von Tierversuchen, „…wenn zu Versuchszwecken Behandlungen und Eingriffe am Tier bzw. an dessen Erbgut vorgenommen werden, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier bzw. für das Erbgut veränderte Tier verbunden sind“ [2]. In der Bundesrepublik Deutschland finden im Vergleich zu den Versuchstierzahlen anderer Verwendungsbereiche im Rahmen der Entwicklung und Prüfung von Arzneimitteln auf Grundlage der Bestimmungen zum Arzneimittelgesetz [3] die meisten Tierversuche statt [4]1.
Deshalb spielt der vom Gesetzgeber ausdrücklich geforderte Tierschutz im pharmazeutischen Bereich eine besondere Rolle. Es gilt daher, in diesem Bereich Prüfverfahren zu entwickeln, die einen geringeren oder schonenderen Einsatz von Versuchstieren bedeuten bzw. neben gebräuchlichen in-vivo- Verfahren auch Ersatz und Ergänzungsmethoden auf RRR– (Replacement, Refinement, Reduction) – Grundlagen anwenden[4].
Seit mehr als 100 Jahren wird nun bereits mit dem Hühnerembryo als Basisuntersuchungsmodell gearbeitet [5]. Mit der Entwicklung der HET- Embryotoxizitätsprüfung in den frühen 80- er Jahren wurden diese Grundlagenprüfungen erweitert und standardisiert. Die Prüfungen am
bebrüteten Hühnerei (HET) liefern ebenfalls Informationen hinsichtlich der Embryoletalität, Retardierung, Teratogenität und systemischer Toxizität. Darüber hinaus lassen sich mit Hilfe dieser Methode aber auch Erkenntnisse zur Immunpathologie oder zu metabolischen Aspekten, wie sie im Rahmen dieser Arbeit von besonderem Interesse sind, gewinnen.
Inhaltsverzeichnis
- Einleitung
- Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden
- Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren
- Die Entwicklung des Hühnerembryos
- Entwicklung der embryonalen Hühnerleber
- Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen
- Cytochrom P 450
- Biotransformation von Fremdstoffen
- Biotransformation von Cyclophosphamid
- Cyclophosphamid
- Metabolismus von Cyclophosphamid
- Ziel der Arbeit
- Materialien und Methoden
- Materialien
- Cyclophosphamid (Reaktant)
- Acrolein (Produkt)
- Sonstige Chemikalien
- Biologisches Material
- Methoden
- Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes
- Inkubation der Eier und Entnahme der Lebern
- Extraktion und Fraktionierung des Lebergewebes
- Pre-Test: Bestimmung der De-O-Ethylase-Aktivität des gewonnenen Leberextraktes mit Ethoxycoumarin
- Bestimmung von Hydroxy- und Ethoxycoumarin im Fluoreszenzspektrometer
- Durchführung des Enzymtests mit Ethoxycoumarin
- Differentielle Extraktion von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
- Quantitative Bestimmung von Acrolein
- Herstellung von Stammlösungen
- Herstellung eines Derivatisierungsreagenzes zur fluorimetrischen Bestimmung von Acrolein
- Die Derivatisierung von Acrolein zu 7- Hydroxychinolin und Herstellung von Eichkurven
- Bestimmung von Acrolein mittels Messungen am Fluorimeter
- Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von Cyclophosphamid
- Neutralisieren der Enzymansätze
- Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus derivatisierten und neutralisierten Enzymansätzen
- Bestimmung von Acrolein durch Dünnschichtchromatographie und densitometrische Auswertung der Chromatogramme
- Proteinbestimmung nach Bradford
- Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes
- Materialien
- Ergebnisse
- Aktivitätstest für Cytochrom P 450 mit 7- Ethoxycoumarin
- Fluoreszenz von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
- Quantitative Bestimmung der Aktivität von Cytochrom P 450 mittels Messung der De-O-Ethylierung von Ethoxycoumarin zu Hydroxycoumarin
- Kalibrierung der Fluoreszenzsignale von 7- Hydroxychinolin, dem Derivatisierungsprodukt aus Acrolein und 3- Aminophenol
- Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin im Fluorimeter
- Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin nach Dünnschichtchromatographie und Auswertung am Densitometer
- Neutralisation der Derivatisierungsansätze
- Entwicklung einer Methode zur Isolierung von 7- Hydroxychinolin aus sauren Ansätzen mittels Neutralisation und anschließender Extraktion
- Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus sauren und neutralisierten Derivatisierungsansätzen
- Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt
- Abhängigkeit der nachgewiesenen Acroleinmengen vom Volumen des eingesetzten Leberextraktes
- Erfassung von Acrolein bei konstantem Volumen Leberextrakt im Enzymansatz
- Auswirkung der Inkubationszeit auf die Erfassung von Acrolein
- Aktivierung von Cyclophosphamid und Nachweis des Aktivierungsproduktes Acrolein mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung der Chromatogramme
- Quantitativer Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt von Cyclophosphamid in Abhängigkeit von der Zeit
- Aktivitätstest für Cytochrom P 450 mit 7- Ethoxycoumarin
- Diskussion
- Zusammenfassung
Zielsetzung und Themenschwerpunkte
Diese Arbeit befasst sich mit der Aktivierung des Medikaments Cyclophosphamid durch Extrakte aus embryonalen Hühnerlebern. Im Fokus steht die Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung eines Aktivierungsproduktes, Acrolein.
- Entwicklung einer Methode zur Aktivierung von Cyclophosphamid durch Extrakte aus embryonalen Hühnerlebern
- Quantitative Bestimmung des Aktivierungsproduktes Acrolein
- Untersuchung des Metabolismus von Cyclophosphamid durch Cytochrom P 450
- Anwendung von in-vitro Verfahren zur Untersuchung von Metabolisierungswegen
- Einsatz von Hühnerembryonen als Modell für die Untersuchung von Leberfunktionen
Zusammenfassung der Kapitel
Die Einleitung der Arbeit erläutert die Bedeutung von Tierversuchen und stellt alternative Methoden vor. Sie führt in die Untersuchung von Metabolisierungswegen mit Hilfe von in-vitro Verfahren ein und beschreibt die Entwicklung des Hühnerembryos und der embryonalen Hühnerleber. Des Weiteren wird das Enzym Cytochrom P 450 und dessen Rolle bei der Biotransformation von Fremdstoffen, insbesondere Cyclophosphamid, beleuchtet. Die Zielsetzung der Arbeit wird dargelegt.
Das Kapitel "Materialien und Methoden" beschreibt die verwendeten Materialien und detailliert die einzelnen Schritte des Experiments. Dies umfasst die Herstellung des Leberextraktes, die Durchführung von Aktivitätstests für Cytochrom P 450, die quantitative Bestimmung von Acrolein sowie die Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von Cyclophosphamid.
Die Ergebnisse der Arbeit werden im Kapitel "Ergebnisse" präsentiert. Die Aktivität von Cytochrom P 450 wird mit Hilfe von Ethoxycoumarin gemessen und die Fluoreszenzsignale von 7-Hydroxychinolin, dem Derivatisierungsprodukt von Acrolein, werden kalibriert. Die Neutralisation der Derivatisierungsansätze und die Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt werden beschrieben. Die Aktivierung von Cyclophosphamid und der Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt werden mit Hilfe von Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung der Chromatogramme dargestellt.
Schlüsselwörter
Die Arbeit fokussiert auf die Aktivierung von Cyclophosphamid, die Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung des Aktivierungsproduktes Acrolein, die Anwendung von in-vitro Verfahren zur Untersuchung von Metabolisierungswegen, das Enzym Cytochrom P 450, die Biotransformation von Fremdstoffen, embryonale Hühnerlebern und Dünnschichtchromatographie.
- Quote paper
- Diplomkosmetologielehrerin Aline Wipprecht (Author), 2006, Aktivierung von Cyclophosphamid in Extrakten aus embryonalen Hühnerlebern , Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/89526
