Aktivierung von Cyclophosphamid in Extrakten aus embryonalen Hühnerlebern

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden
1.2 Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren
1.3 Die Entwicklung des Hühnerembryos
1.4 Entwicklung der embryonalen Hühnerleber
1.5 Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen
1.5.1 Cytochrom P 450
1.5.2 Biotransformation von Fremdstoffen
1.5.3 Biotransformation von Cyclophosphamid
1.5.3.1 Cyclophosphamid
1.5.3.2 Metabolismus von Cyclophosphamid
1.6 Ziel der Arbeit

2 Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Cyclophosphamid (Reaktant)
2.1.2 Acrolein (Produkt)
2.1.3 Sonstige Chemikalien
2.1.4 Biologisches Material
2.2 Methoden
2.2.1 Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes
2.2.1.1 Inkubation der Eier und Entnahme der Lebern
2.2.1.2 Extraktion und Fraktionierung des Lebergewebes
2.2.2 Pre-Test: Bestimmung der De-O-Ethylase-Aktivität des gewonnenen Leberextraktes mit Ethoxycoumarin
2.2.2.1 Bestimmung von Hydroxy- und Ethoxycoumarin im Fluoreszenzspektrometer
2.2.2.2 Durchführung des Enzymtests mit Ethoxycoumarin
2.2.2.3 Differentielle Extraktion von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
2.2.3 Quantitative Bestimmung von Acrolein
2.2.3.1 Herstellung von Stammlösungen
2.2.3.2 Herstellung eines Derivatisierungsreagenzes zur fluorimetrischen Bestimmung von Acrolein
2.2.3.3 Die Derivatisierung von Acrolein zu 7- Hydroxychinolin und Herstellung von Eichkurven
2.2.3.4 Bestimmung von Acrolein mittels Messungen am Fluorimeter
2.2.3.5 Durchführung des Enzymtests zur Aktivierung von Cyclophosphamid
2.2.3.6 Neutralisieren der Enzymansätze
2.2.3.7 Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus derivatisierten und neutralisierten Enzymansätzen
2.2.3.8 Bestimmung von Acrolein durch Dünnschichtchromatographie und densitometrische Auswertung der Chromatogramme
2.2.3.9 Proteinbestimmung nach Bradford

3 Ergebnisse
3.1 Aktivitätstest für Cytochrom P 450 mit 7- Ethoxycoumarin
3.1.1 Fluoreszenz von Ethoxy- und Hydroxycoumarin
3.1.2 Quantitative Bestimmung der Aktivität von Cytochrom P 450 mittels Messung der De-O-Ethylierung von Ethoxycoumarin zu Hydroxycoumarin
3.2 Kalibrierung der Fluoreszenzsignale von 7- Hydroxychinolin, dem Derivatisierungsprodukt aus Acrolein und 3- Aminophenol
3.2.1 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin im Fluorimeter
3.2.2 Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin nach Dünnschicht- chromatographie und Auswertung am Densitometer
3.3 Entwicklung einer Methode zur Isolierung von 7- Hydroxychinolin aus sauren Ansätzen mittels Neutralisation und anschließender Extraktion
3.3.1 Neutralisation der Derivatisierungsansätze
3.3.2 Extraktion von 7- Hydroxychinolin aus sauren und neutralisierten Derivatisierungsansätzen
3.4 Erfassung von Acrolein in Ansätzen mit Leberextrakt
3.4.1 Abhängigkeit der nachgewiesenen Acroleinmengen vom Volumen des eingesetzten Leberextraktes
3.4.2 Erfassung von Acrolein bei konstantem Volumen Leberextrakt im Enzymansatz
3.4.3 Auswirkung der Inkubationszeit auf die Erfassung von Acrolein
3.5 Aktivierung von Cyclophosphamid und Nachweis des Aktivierungsproduktes Acrolein mittels Dünnschichtchromatographie und densitometrischer Auswertung der Chromatogramme
3.5.1 Quantitativer Nachweis von Acrolein als Metabolisierungsprodukt von Cyclophosphamid in Abhängigkeit von der Zeit

4 Diskussion

5 Zusammenfassung

6 Literatur

7 Anhang

Abkürzungsverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Reaktionsgleichung zur Derivatisierung von Acrolein

Abbildung 2: Fluoreszenz von Hydroxycoumarin (0- 5 nmol in 200 µl Probenvolumen bei Ex.: 360 nm, Em.: 465 nm, gain40, Mikrotiterplatten: weiß)

Abbildung 3: Fluoreszenz von Ethoxycoumarin (0- 15 nmol in 200 µl Probenvolumen bei Exc.: 360 nm, Em.: 465nm, gain40, Mikrotiterplatten: weiß)

Abbildung 4: Abhängigkeit der Hydroxycoumarinbildung von der eingesetzten Extraktmenge, Ansatzvolumen: 200 µl

Abbildung 5: Vergleich der Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin bei verschiedenen Parametereinstellungen und Emissionsfiltern

Abbildung 6: Densitometrische Bestimmung von Acrolein bei Ex. 365 nm, Em. 420 nm nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung

Abbildung 7: Densitometrische Bestimmung bei Ex. 365 nm, Em. 420 nm zum Verbleib von 7- Hydroxychinolin; Vergleich der verschiedenen Phasen; Extraktionsmittel: Ethylacetat

Abbildung 8: Densitometrische Bestimmung bei Ex. 365 nm, Em. 420 nm zum Verbleib von 7- Hydroxychinolin; Vergleich der verschiedenen Phasen; Extraktionsmittel: Chloroform

Abbildung 9: Fluoreszenzmessungen zur Abhängigkeit der Menge des gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes bei Ex. 360nm, Em. 465 nm

Abbildung 10: Fluoreszenzmessung zum Nachweis von Acrolein bei Einsatz von 10 µl Leberextrakt/Ansatz bei Ex. 360, Em. 465

Abbildung 11: Nachweis von Acrolein unter Berücksichtigung der Inkubationszeit

Abbildung 12: Enzymkinetik: zeitabhängige Bildung von Acrolein

Abbildung 13: Fluoreszenzmessungen zur Abhängigkeit der Menge des gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes, Einsatz von TCA

Abbildung 14: Densitometrische Bestimmung zur Abhängigkeit der Menge des erfassten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes

Abbildung 15: Säulendiagramm zur densitometrischen Bestimmung, Abhängigkeit der Menge des erfassten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes

Abbildung 16 : Densitometrische Bestimmung zur Abhängigkeit der Menge des gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes, Einsatz von TCA

Abbildung 17: Vergleich der UV- Spektren von 6- und 8- Hydroxychinolin

Abbildung 18: Densitometrische Bestimmung zur Bildung von 7- Hydroxychinolin in Abhängigkeit von der Inkubationszeit

Abbildung 19: Abhängigkeit zwischen eingesetzter Menge Acrolein im Ansatz und resultierendem Fluoreszenzsignal von 7- Hydroxychinolin

Abbildung 20: Eichkurve BSA zur Proteinbestimmung im Leberextrakt

Abbildung 21: Keimscheibe am animalen Pol, Reorganisation der Keimscheibe und Bildung von Epi- und Hypoblast[8]

Abbildung 22: Bildung der Primitivrinne[8]

Abbildung 23: Bildung des Proamnions[11]

Abbildung 24: Metabolisierung von Cyclophosphamid

Tabellenverzeichnis

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Reaktionsgleichung zur Derivatisierung von Acrolein

Abbildung 2: Fluoreszenz von Hydroxycoumarin (0- 5 nmol in 200 µl Probenvolumen bei Ex.: 360 nm, Em.: 465 nm, gain40, Mikrotiterplatten: weiß)

Abbildung 3: Fluoreszenz von Ethoxycoumarin (0- 15 nmol in 200 µl Probenvolumen bei Exc.: 360 nm, Em.: 465nm, gain40, Mikrotiterplatten: weiß)

Abbildung 4: Abhängigkeit der Hydroxycoumarinbildung von der eingesetzten Extraktmenge, Ansatzvolumen: 200 µl

Abbildung 5: Vergleich der Fluoreszenz von 7- Hydroxychinolin bei verschiedenen Parametereinstellungen und Emissionsfiltern

Abbildung 6: Densitometrische Bestimmung von Acrolein bei Ex. 365 nm, Em. 420 nm nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung

Abbildung 7: Densitometrische Bestimmung bei Ex. 365 nm, Em. 420 nm zum Verbleib von 7- Hydroxychinolin; Vergleich der verschiedenen Phasen; Extraktionsmittel: Ethylacetat

Abbildung 8: Densitometrische Bestimmung bei Ex. 365 nm, Em. 420 nm zum Verbleib von 7- Hydroxychinolin; Vergleich der verschiedenen Phasen; Extraktionsmittel: Chloroform

Abbildung 9: Fluoreszenzmessungen zur Abhängigkeit der Menge des gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes bei Ex. 360nm, Em. 465 nm

Abbildung 10: Fluoreszenzmessung zum Nachweis von Acrolein bei Einsatz von 10 µl Leberextrakt/Ansatz bei Ex. 360, Em. 465

Abbildung 11: Nachweis von Acrolein unter Berücksichtigung der Inkubationszeit

Abbildung 12: Enzymkinetik: zeitabhängige Bildung von Acrolein

Abbildung 13: Fluoreszenzmessungen zur Abhängigkeit der Menge des gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes, Einsatz von TCA

Abbildung 14: Densitometrische Bestimmung zur Abhängigkeit der Menge des erfassten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes

Abbildung 15: Säulendiagramm zur densitometrischen Bestimmung, Abhängigkeit der Menge des erfassten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes

Abbildung 16 : Densitometrische Bestimmung zur Abhängigkeit der Menge des gebildeten Acroleins vom Volumen des zugesetzten Leberextraktes, Einsatz von TCA

Abbildung 17: Vergleich der UV- Spektren von 6- und 8- Hydroxychinolin

Abbildung 18: Densitometrische Bestimmung zur Bildung von 7- Hydroxychinolin in Abhängigkeit von der Inkubationszeit

Abbildung 19: Abhängigkeit zwischen eingesetzter Menge Acrolein im Ansatz und resultierendem Fluoreszenzsignal von 7- Hydroxychinolin

Abbildung 20: Eichkurve BSA zur Proteinbestimmung im Leberextrakt

Abbildung 21: Keimscheibe am animalen Pol, Reorganisation der Keimscheibe und Bildung von Epi- und Hypoblast[8]

Abbildung 22: Bildung der Primitivrinne[8]

Abbildung 23: Bildung des Proamnions[11]

Abbildung 24: Metabolisierung von Cyclophosphamid

1 Einleitung

1.1 Tierversuche, Ersatz- und Ergänzungsmethoden

Die Prüfung von Lebensmitteln und deren Inhalts- und Zusatzstoffe sowie die Prüfung von Arzneimitteln, von kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenständen auf ihre gesundheitliche Unbedenklichkeit und Umweltverträglichkeit ist gesetzlich geregelt und erfolgt unter anderem im Tierversuch[1].

Laut Tierschutzgesetz spricht man dann von Tierversuchen, „…wenn zu Versuchszwecken Behandlungen und Eingriffe am Tier bzw. an dessen Erbgut vorgenommen werden, die mit Schmerzen, Leiden oder Schäden für das Tier bzw. für das Erbgut veränderte Tier verbunden sind“[2].

In der Bundesrepublik Deutschland finden im Vergleich zu den Versuchstierzahlen anderer Verwendungsbereiche im Rahmen der Entwicklung und Prüfung von Arzneimitteln auf Grundlage der Bestimmungen zum Arzneimittelgesetz[3] die meisten Tierversuche statt[4] ¹. Deshalb spielt der vom Gesetzgeber ausdrücklich geforderte Tierschutz im pharmazeutischen Bereich eine besondere Rolle. Es gilt daher, in diesem Bereich Prüfverfahren zu entwickeln, die einen geringeren oder schonenderen Einsatz von Versuchstieren bedeuten bzw. neben gebräuchlichen in-vivo- Verfahren auch Ersatz und Ergänzungsmethoden auf RRR(Replacement, Refinement, Reduction) - Grundlagen anwenden[4].

Seit mehr als 100 Jahren wird nun bereits mit dem Hühnerembryo als Basisuntersuchungsmodell gearbeitet[5]. Mit der Entwicklung der HET- Embryotoxizitätsprüfung in den frühen 80- er Jahren wurden diese Grundlagenprüfungen erweitert und standardisiert. Die Prüfungen am bebrüteten Hühnerei (HET) liefern ebenfalls Informationen hinsichtlich der Embryoletalität, Retardierung, Teratogenität und systemischer Toxizität. Darüber hinaus lassen sich mit Hilfe dieser Methode aber auch Erkenntnisse zur Immunpathologie oder zu metabolischen Aspekten, wie sie im Rahmen dieser Arbeit von besonderem Interesse sind, gewinnen.

1.2 Untersuchung von Metabolisierungswegen durch die Nutzung hepatischer Funktionen für in- vitro Verfahren

Die oben genannte Testung am bebrüteten Hühnerei stellt laut Lüpke[5] einen Grenzfall zwischen in- vivo und in- vitro dar. Nach allgemeiner Ansicht kollidiert dies nicht mit ethischen und juristischen Aspekten, insbesondere der Tierschutzgesetzgebung.

Da das bebrütete Hühnerei in der Bundesrepublik Deutschland keinerlei tierschutzrechtlichen Restriktionen unterliegt, ist die innerhalb dieser Arbeit stattgefundene Entnahme embryonaler Hühnerlebern mit dem geltenden Gesetz vereinbar[2]. Auch ist laut Tierschutzgesetz §7, Abs. 1 eine „...Organentnahme aus dem zuvor getöteten Tier nicht als Tierversuch zu definieren…“[4]. Tests mit aufbereiteten Hepatocyten sind zweifelsfrei als in- vitro- Verfahren zu betrachten. Die im Rahmen dieser Arbeit zu testenden Substanzen wurden nicht direkt in den Eikörper injiziert, eine invasorische Behandlung des lebenden Organismus fand also nicht statt.

Trotz allem weist die in- vitro- Nutzung des hier verwendeten Prüfmaterials engen Bezug zum Hühnereitest auf, da hier die Leber als Ort der Metabolisierung von zum Beispiel Xeno- oder Endobiotica als ein Baustein innerhalb einer Vielzahl von Prüfsystemen des Hühnerembryos, die im HET untersucht werden, isoliert betrachtet und auf seine Aktivität hin untersucht werden kann.

Die Mikrosomenaufbereitungen des entnommenen Lebergewebes eignen sich für die Prüfung metabolischer Aktivierung, da mithilfe dieses Testmaterials eine große Anzahl von in- vitroVersuchen ermöglicht wird.

Bei in- vitro Metabolisationstests kann die Bestimmung der verstoffwechselten Substanzen durch direkten laborchemischen Nachweis erfolgen.

Das angebrütete Hühnerei ist in diesem Zusammenhang Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten, insbesondere deshalb, weil es bereits sehr früh in seiner Entwicklung eine hohe metabolische Aktivität ausbildet.

Sicher stellt sich auch hier wie in anderen Prüfverfahren die Frage nach der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den menschlichen Organismus. Denn die meisten in- vitro- Versuchsverfahren stellen nur ein monofaktorielles System dar. Verschiedene physiologische Abläufe innerhalb des in-vivo- Pharmakometabolismus wie der Leber- Nieren- Kreislauf oder der Leber- DarmKreislauf bleiben unberücksichtigt[7].

Jedoch bietet dieses in- vitro- Verfahren den Vorteil der Flexiblen Gestaltung der Experimente je nach Fragestellung. So zum Beispiel könnten Hepatozyten mit anderen Zelltypen kokultiviert werden, radioaktiv markierte Substanzen können einfach inkubiert und Hepatocyten oder Zellfraktionen für spätere Referenzversuche eingefroren werden. Da eine aufbereitete Leber ein Volumen liefert, welches hohe Versuchszahlen ermöglicht, kann aus diesem Prüfverfahren eine Reduktion von Tierversuchen resultieren.

Ein Verbundverfahren des BMBF ist bereits 1996 angelaufen, um die „...Nutzung hepatischer Funktionen für in-vitro- Verfahren zur Prüfung von Stoffen mit dem Ziel der Einsparung von Tierversuchen...“ zu erforschen[4].

Abschließend ist jedoch darauf hinzuweisen, dass sich in fortgeschrittenen Stadien der Arzneimittelentwicklung mit den angeführten Methoden abschließende Untersuchungen am Ganztier nicht ersetzen lassen.

1.3 Die Entwicklung des Hühnerembryos

Die Embryonalentwicklung aller Wirbeltiere ist ausschließlich in wässriger Umgebung möglich. Für terrestrisch lebende Organismen bedeutet dies die Erfordernis eines flüssigkeitsgefüllten Kompartimentes. Im Verlauf der Evolution entwickelte sich das von einer Schale umhüllte Ei der Reptilien, Vögel und Monotremen. Eine weitere Variante dieser Kompartimentiertung ist der Uterus placentaler Säuger. In Eischale und Uterus befinden sich die Embryonen in einer flüssigkeitsgefüllten Blase, dem Amnion, was zur Bezeichnung dieser Wirbeltierklassen als Amnioten beitrug[8].

Innerhalb der Klasse der Vögel (Aves) bilden die Hühnervögel (Galliformes) eine der insgesamt 28 Ordnungen[9], die wiederum in verschiedene Familien zu unterteilen sind. Die meisten Hühnervögel gehören der beinahe über die ganze Erde verbreiteten Familie der Fasanvögel (Phasianidae) an. Das Haushuhn, zu denen Rassen wie Leghorn, New Hampshire und Cochinchina gehören, stammt von einer weit verbreiteten Kammhuhnart, dem Bankivahuhn (Gallus gallus) ab[10].

Mit der Befruchtung der Oozyte des Huhnes durch das männliche Spermium beginnt die Embryonalentwicklung. Im Ovidukt werden dem sich bereits furchenden Keimling die Eiweißhülle und die kalkhaltige Eischale (sekundären Eihüllen) angelagert. Zum Zeitpunkt der Eiablage sind die Furchungstadien bereits fast vollständig durchlaufen[11].

Infolge meroblastischer Furchung entsteht zunächst eine der Dottermasse diskoidal aufliegende Keimscheibe am animalen Pol [s. Anhang, Abb. 21]. Dieser Entwicklungsschritt vollzieht sich kurz vor der Eiablage. Die Keimscheibe reorganisiert sich durch Zellteilung zum Hypoblast an der Dottergrenze und Epiblast an der Oberfläche. Diese beiden Schichten umschließen ein Blastocoel, die Subgerminalhöhle. Im Bereich des Epiblasten bildet sich durch Emigrationsgastrulation bereits während des ersten Bebrütungstages die Primitivrinne [s. Anhang, Abb.22]. Durch sie wandern Zellen des Epiblasten in den Subgerminalraum und bilden dort entodermale und mesodermale Strukturen. Als Entoderm bezeichnet man die Zellschicht, die durch Einwanderung die Hypoblastzellen verdrängt hat. Das Mesoderm (auch Chordamesoderm) ist eine sich flächig ausbreitende Zellformation in der Subgerminalhöhle. Der Epiblast kann in diesem Stadium nun als Neuroektoderm bezeichnet werden[12].

Im Laufe der Entwicklung falten sich über dem Chordamesoderm die so genannten Neuralfalten auf und bilden im weiteren Verlauf das Neuralrohr, das sich nun komplett vom Epiblasten gelöst hat. Das flächenhafte Aggregat der mesodermalen Zellen differenziert sich zu Chorda, segmentalen Somiten und geschlossenen Seitenplatten[12]. Das über der Dottermasse liegende Entoderm wölbt sich auf und formiert sich zum Rohr des Darmes.

Ekto- und Entoderm breitet sich über die Oberfläche der Dottermasse aus. Das Mesoderm folgt der Umwachsung des Dotters im extraembryonalen Bereich. Eine Vorstufe des Amnions ektound entodermalen Ursprungs bildet sich in Form einer sehr zarten Falte (Proamnion) vor dem Kopfgebiet [s.Anhang, Abb. 23].

Schließlich geht dieses seitlich, hinten in das Amnion über und es beginnt eine Amnionfaltung rings um den Embryo (extraembryonale Gewebe). Aus diesem Prozess entsteht eine doppelwandige, mit Flüssigkeit gefüllte, den Embryo schützende Blase, die Amnionhöhle. Die äußere Wand wird als Chorion (Seerosa) bezeichnet. Die Alantois, ein weiteres extraembryonales Organ entsteht aus der Ausstülpung des Enddarmes gegen das Exocoel. Ursprünglich dient es als embryonaler Harnsack, wird jedoch später zum Atmungs- und Resorbtionsorgan. Im Laufe der Entwicklung breitet sich die Allantois über die gesamte Chorionhöhle aus. Zur Ernährung dienen ausschließlich Reservestoffe aus Dotter und Eiweiß. In der Schlussphase der Entwicklung, nach Veröden der Chorion- und Allantoisgefäße, setzt bereits vor dem Schlüpfen die Lungenatmung ein. Der Schlupf findet in der Regel am 19. bis 21. Bebrütungstag statt[12].

1.4 Entwicklung der embryonalen Hühnerleber

Die Entwicklung der embryonalen Hühnerlebern ist der Leberentwicklung von Säugerembryonen sehr ähnlich, was eine Übertragbarkeit von Erkenntnissen im Rahmen von Untersuchungen beim Huhn auf den Menschen ermöglicht und beispielsweise für den Bereich der Medizin eine wesentliche Rolle spielt.

Die embryonale Leber setzt sich aus drei Gewebearten zusammen. Zum einen sind dies Zellen entodermalen Ursprungs, die aus einer Ausstülpung des Kopfdarmes herrühren. Des Weiteren findet man das mesenchymale Septum Transversum und Endothelzellen des Primär- sinusoids [14].

Die ersten Leberzellen sind bereits nach dem 2. Bebrütungstag zu erkennen, wenn der Embryo ein 20 bis 23- Somiten- Stadium erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt haben sich bereits Anlagen zu Neuralrohr und Chorda gebildet. Die mesodermalen Säume beidseitig der Chorda sind von Zellblöcken, den Somiten, flankiert[8]. Die primäre Leberanlage ist entodermalen Ursprungs. Nach Entstehen der sekundären Leberzellen bilden sich am vierten und fünften Bebrütungstag ausgehend vom der Darmanlage zwei Seitenäste, so genannte Divertikel. Dies sind die Vorstufen des späteren linken und etwas größeren rechten Leberlappens und der Gallenblase. Zwischen dem 5 und siebten Bebrütungstag beginnt die Sekretion der Gallenflüssigkeit, die aus der rechten und linken Leberhälfte über den paarig angelegten Lebergang (Ductus Hepaticus), der dann in den Ductus Cysticus über geht, eingesammelt wird. Bis zum elften Bebrütungstag erfährt die Leber eine starke Wachstumsphase, in der sie ihr Gewicht von 0,03 mg auf 75 mg vermehrt. [15]. Die Verstoffwechselung von Kohlenhydraten durch die Leber beginnt etwa ab dem sechsten bis siebten Bebrütungstag. In diesem Entwicklungsstadium sind bereits Enzyme und Stoffwechselprodukte des Fett- und Proteinstoffwechsels nachweisbar[16]. Die Bildung Xenobiotika- metabolisierender Enzymsysteme, wie zum Beispiel Cytochrom P 450, tritt etwa ab dem vierten und fünften Tag ein[17].

Im Folgenden wird das angesprochene Cytochrom P 450- Enzymsystem näher betrachtet.

1.5 Cytochrom P 450 und die Biotransformation von Fremdstoffen

1.5.1 Cytochrom P 450

Die Cytochrome P 450 (CYP 450) sind eine bedeutende Familie der Hämproteine, die in ihrer reduzierten Form Kohlenmonoxyd binden und dadurch eine charakteristische Absorptionsbande bei 450 nm aufweisen, die für diese Proteinfamilie namensgebend wurde [18, 39]. Die Hauptfunktionen von CYP 450 in der Leber sind die einer O- oder N- Dimethylase oder allgemeiner Dealkylase sowie einer Hydroxylase[19]. Die am weitesten verbreitet Reaktion ist die Monooxidation lipophiler Substanzen[20]. Durch reduktive Spaltung von molekularem Sauerstoff (O2) wird eines der beiden Sauerstoffatome auf den Fremdstoff übertragen, das zweite Sauerstoffatom wird als Wassermolekühl freigesetzt[21]. Deshalb wird CYP 450 auch als mischfunktionelle Oxygenase bezeichnet[22]. Die notwendigen Reduktionsäquivalente werden durch ein FAD- haltiges Hilfsprotein vom Coenzym NADPH+H+ auf die eigentliche Monooxigenase übertragen[23]. In Eukaryoten sind diese Cytochrome vor allem in Membranen des glatten Endoplasmatischen Retikulums lokalisiert. In der Leber der Säuger ist CYP 450 an zahlreichen Entgiftungsreaktionen, vor allem in den so genannten Phase- I- Reaktionen, beteiligt. In Umwandlungsreaktionen werden hier Substanzen oxidativ, reduktiv- oder hydrolytisch verändert. Durch die Hydroxylierung wird die Substanz hydrophiler und kann in der Phase- II- Reaktion mit hydrophilen Stoffen gekoppelt und über die Niere ausgeschieden werden. Besonders gut werden unpolare Verbindungen umgesetzt, die aliphatische oder aromatische Ringe enthalten[23], zum Beispiel Steroidhormone, aber auch Arzneimittel. In bestimmten Fällen werden Arzneistoffe erst durch die Biotransformationsprozesse biologisch aktiv[39]. Aus diesem Grund sind CYP 450- Enzyme für die Pharmakologie von besonderem Interesse. Innerhalb der CYP 450- Familie ist das humane Cytochrom P-450 2B6 (CYP2B6) einer der hauptsächlich beteiligten Enzyme für die Metabolisierung von Cyclophosphamid[24].

1.5.2 Biotransformation von Fremdstoffen

Viele Fremdstoffe, die in den Organismus gelangen, aber auch körpereigene Substanzen haben toxisches Potential, welches es über bestimmte Mechanismen zu beseitigen gilt. Dies geschieht durch Biotransformation, einen Prozess, in dem körpereigene- und fremde Substrate inaktiviert und ausgeschieden werden. Die Biotransformation geschieht vor allem in der Leber und ist, wie bereits angesprochen, durch eine Phase- I- und eine Phase- II- Reaktion gekennzeichnet. In Phase I werden unpolare Moleküle in wasserlösliche Formen umgewandelt, was eine Verringerung der Giftigkeit bzw. der biologischen Aktivität dieser Stoffe zur Folge haben kann, jedoch auch im Falle bestimmter Arzneistoffen erst eine Aktivierung dieser Substanzen bewirkt. Die betreffenden Enzymsysteme sind subtratspezifisch, d.h., sie werden von ihrem Substrat induziert. In Phase II der Biotransformation (auch Konjugatbildung) werden die Substrate an sehr polare, negativ geladene Moleküle gekoppelt. Somit wird die Hydrophilie noch zusätzlich verstärkt. Durch rezeptorvermittelte Exkretion werden die Konjugate (Bilirubin, Steroidhormone, Xenobiotika, Pharmaka) von der Leber in die Galle oder auf dem Weg über Blut und Niere eliminiert[23].

Da sich diese Arbeit gezielt mit der Aktivierung einer bestimmten pharmazeutisch relevanten Substanz - Cyclophosphamid - über den Weg der Biotransformation in embryonalen Hühnerlebern beschäftigt, wird im Folgenden speziell auf die Metabolisierung dieses Stoffes eingegangen.

1.5.3 Biotransformation von Cyclophosphamid

1.5.3.1 Cyclophosphamid

Cyclophosphamid (CPA) ist ein 1958 in den Asta-Werken, Bielefeld entwickeltes

Chemotherapeutikum, das als Zytostatikum in der Krebstherapie zum Einsatz kommt. Des Weiteren findet es als Immunsupressivum bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder zur Unterdrückung von Abstoßungsreaktionen bei Organtransplantationen Verwendung[25]. CPA ist ein Phosphoramid Mustard Derivat. Seine Wirkeigenschaften, welche in der Funktion als Alkylantie zu sehen sind, entwickeln sich erst durch metabolische Aktivierung. Deshalb wird CPA auch als indirekt wirkendes Agens bezeichnet[19] bzw. ist in die Gruppe der Prodrugs einzuordnen. Als Alkylierungsmittel weist es im Organismus eine besondere Affinität zu biologischen Makromolekülen wie der DNA auf. Dort induziert es Quervernetzungen, Kettenabbrüche und abnorme Basenpaarungen, was eine Beeinträchtigung von Zellteilungsprozessen zur Folge hat. Auf Zellen, die eine hohe Proliferationsrate aufweisen, wie Tumorzellen, entfaltet CPA somit seine zytotoxische Wirkung[22].

1.5.3.2 Metabolismus von Cyclophosphamid

Die Biotransformation von CPA ist ein mehrstufiger Prozess (s. Anhang, Abb. 24), der zunächst durch die Hydroxylierung von CP zu 4-Hydroxy-Cyclophosphamid (4-OH-CPA) durch CYP 450 eingeleitet wird[22]. 4-OH-CPA steht im tautomeren Gleichgewicht mit dem ringoffenen Aldophosphamid (Aldo-PA). Beide Substanzen zeigen keine signifikante Anti-Tumor-Aktivität [19], jedoch haben sie eine zentrale Bedeutung als Transportform von CPA. Aus Aldo-PA wird durch ß-Eliminierung Acrolein freigesetzt. Als ungesättigter Aldehyd ist Acrolein sehr reaktionsfähig (elektrophil) und verursacht durch seine bevorzugten Reaktionen mit Proteinen die Nebenwirkungen des CPA [19, 22]. Identifiziert wurde es als auslösendes Agens der hämorrhagischen Cystitis der Blase, die bei Behandlungen mit CPA auftreten kann. In der Krebstherapie wird aus diesem Grund häufig parallel Mesna (Natrium-2-Mercaptoethansulfonat) verabreicht. Dieses geht mit Acrolein Additionsverbindungen ein und hemmt somit die urotoxische Wirkung von Acrolein[26]. Weiterhin entsteht aus den primären Metaboliten N- Lost-Phosphorsäure-Diamid (auch Phophoramid- Mustard genannt[19] ), das als zytotoxisch wirksamer Metabolit gilt. Ein Nebenweg für die Ausscheidung und Inaktivierung ist die Weiteroxidation von 4-OH-CPA zu 4-Keto-Cyclophosphamid (4-Keto-CPA).

Innerhalb dieser Metabolisierungsreaktionen kann es laut Himmelseher zu einer Verlangsamung der Bildung von Acrolein und N-Lost-Phosphorsäure-Diamid kommen, wenn Aldo-PA mit SH- gruppenhaltigen Verbindungen (z.B. Proteinen) reagiert. Es entsteht ein Thioether, aus welchem 4-OH-CPA zurück gebildet werden kann. Somit wird die alkylierende Aktivität nur verzögert frei gegeben, was für die Einwirkdauer und den Transport im Körper von Bedeutung ist.

1.6 Ziel der Arbeit

Die Prüfungen von Arzneistoffen auf Metabolismuswege, toxische Eigenschaften und ihren Wirkspiegel sind bei der Entwicklung von Medikamenten von besonderem Interesse. Dies gilt auch im Hinblick auf Prodrugs, die erst durch hepatische Bioaktivierung als aktive Metaboliten ihre Wirkung im Organismus entfalten. Hierfür sind Erkenntnisse über qualitative und quantitative Metabolismen von wesentlicher Bedeutung.

Das letztendliche Ziel pharmakologischer Untersuchungen sollte prinzipiell eine Verbesserung der Therapierbarkeit, eine Individualisierung der Therapie sowie die Vermeidung bzw. das Eindämmen von Nebenwirkungen sein.

In frühen Stadien der pharmakologischen Forschung wird im Hinblick auf die bereits besprochenen Alternativen zum Tierversuch neben Grenzformen zwischen in-vivo- und in-vitro- Tests (Hühnereitest) auch in-vitro mit Zellkulturen oder Mikrosomenaufbereitungen gearbeitet. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Aktivierung von Cyclophosphamid, einem vor Allem in der Krebstherapie angewandten Zytostatikum, welches beim Menschen über das CYP 450- Enzymsystem metabolisiert wird. Da CYP 450 ebenfalls in der embryonalen Hühnerleber vorzufinden ist, bietet sich der Hühnerembryo als Prüfmodell an.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Extrakte aus Hühnerlebern elf Tage bebrüteter Hühnereier für die Enzymtests verwendet. Verschiedene Arbeiten, die sich im Vorfeld mit der Metabolismusaktivität embryonaler Hühnerlebern beschäftigten, bestätigten die metabolische Aktivität der Leber in diesem Entwicklungsstadium[27].

Die unterschiedlichen Metaboliten von CPA sind in der Literatur eingehend benannt worden. Acrolein, welches im Verlaufe der Biotransformation in der Leber neben der eigentlich wirksamen, alkylierenden Substanz entsteht, sollte in dieser Arbeit durch die Entwicklung einer Analysemethode als Aktivierungsprodukt quantitativ bestimmt werden. In der Reihe der Metaboliten von CPA bot sich Acrolein an, da hierfür in der Literatur bereits Verfahren zur Analytik beschrieben wurden. Diese Verfahren galt es auf die Eignung zur quantitativen Bestimmung von Acrolein zu untersuchen und gegebenenfalls Alternativverfahren zu entwickeln. Dies beinhaltete unter Anderem die Erarbeitung einer Methode zur Extraktion von 7- Hydroxychinolin, dem Reaktionsprodukt aus Acrolein und 3- Aminophenol.

Wenn die Bedingungen für eine erfolgreiche quantitative Analyse erfüllt waren, sollte die CYP 450- Aktivität bezüglich der Metabolisierung von Cyclophosphamid zu Acrolein bestimmbar sein.

2 Materialien und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Cyclophosphamid (Reaktant)

Synonyme: 2-[Bis(2-chlotethyl)-amino]-1, 3,2 -oxazaphosphinan-2-oxid Handelsname: Endoxan ®

C7H15Cl2N2O2P

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Cyclophosphamid (CPA) ist leicht löslich in Alkohol, Benzol, Ethylenglykol, Tetrachlorkohlenstoff und Dioxan. In Ether und Aceton ist es nur schwer löslich[32]. CPA wurde 1962 von Asta Medica (Endoxan®) patentiert und ist generikafähig. Aufgrund seiner alkylierenden Wirkung findet es als Zytostatikum Verwendung. Es gilt als karzinogen und mutagen und hat unter anderem urotoxische Nebenwirkungen[33].

2.1.2 Acrolein (Produkt)

Synonyme: Acrylaldehyd, Propenal, 2- Propenal, Aqualin

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Löslichkeit: in Wasser gut, in Alkohol und Ether sehr leicht löslich

Acrolein neigt in Folge seiner Doppelbindung leicht zu Polimerisation und Additionsreaktionen und ist daher in reinem Zustand kaum stabil[33]. Besonders unter Lichteinwirkung und im alkalischen oder stark sauren Milieu neigt es zur Bildung von Disacryl[34]. Unter Einsatz von Inhibitoren, z.B. Hydroquinon, können diese Polymerisationsreaktionen gehemmt werden[35]. In der Literatur findet man verschiedene Analysemethoden für die Acroleinbestimmung[35, 27, 38].

2.1.3 Sonstige Chemikalien

- Acrolein (Fluka, Taufkirchen)
- Rinder- Serum- Albumin (Sigma Aldrich, Taufkirchen)
- 3-Aminophenol (Fluka, Taufkirchen)
- Chloroform (Merck, Darmstadt)
- Coomassie Brilliant Blue G 250 (Serva, Heidelberg)
- Cyclophosphamid (Baxter Oncology GmbH, Frankfurt)
- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Fluka, Taufkirchen)
- Ethanol (unvergällt) (Merck, Darmstadt)
- Ethoxycoumarin (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)
- Ethylacetat (Essigsäureethylester) (Fluka, Taufkirchen)
- Glukose-6-Phosphat (Serva, Heidelberg)
- Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (Serva, Heidelberg)
- n-Hexan (Merck, Darmstadt)
- 6-Hydroxychinolin (Fluka, Taufkirchen)
- 8-Hydroxychinolin (Fluka, Taufkirchen)
- Hydroxycoumarin (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)
- Hydroxylamin ⋅ HCl (Serva- Heidelberg) Materialien und Methoden 21
- Kaliumdihydrogenphosphat (Merck, Darmstadt)
- Natriumacetat (Fluka, Taufkirchen)
- Natriumchlorid (Fluka, Taufkirchen)
- Natriumhydrogencarbonat (Fluka, Taufkirchen)
- Natriumhydroxid (Sigma- Aldrich, Taufkirchen)
- Nikotinamid- Adenosin- Dinucleotid- Phosphat (NADP, Dinatriumsalz) (Serva, Heidelberg)
- Phosphorsäure (85%) (Fluka, Taufkirchen)
- Trichloressigsäure (TCA) (Merck, Darmstadt)
- Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Sigma- Aldrich, Taufkirchen) Die meisten Chemikalien waren von p.a.- Qualität.

2.1.4 Biologisches Material

Im Rahmen diese Arbeit wurde mit embryonalen Hühnerlebern aus frischen, fertilen Bruteiern des genetisch kontrollierten Stammes Lohmann Selected Leghorn gearbeitet. Die durchschnittlich 50g bis 60 g schweren Hühnereier wurden am Legetag vom Zuchtbetrieb Gutendorf Geflügelzucht Ankum geliefert und anschließend im Brutschrank (Typ KMB 6, Emmendingen) bebrütet.

2.2 Methoden

2.2.1 Die Herstellung des gebrauchsfertigen Leberextraktes

2.2.1.1 Inkubation der Eier und Entnahme der Lebern

Die Inkubation der Hühnereier erfolgte in einer Ehret Bebrütungsanlage (Typ KMB 6, Emmendingen). Die Eier wurden auf waagerecht angebrachten Schieberollentabletts gelagert und alle 2 Stunden automatisch gewendet. Unter kontinuierlicher Luftumwälzung, bei einer Temperatur von 37 °C (± 0,5 °C) und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 62,5 % (± 7,5 %) wurde somit eine Bebrütung unter natürlichen Bedingungen simuliert. Die Selektion abgestorbener Embryonen oder unbefruchteter Eier erfolgte mittels Durchleuchten des Prüfmaterials mit einer Quecksilberdampflampe. Nach einer Inkubationszeit von 11 Tagen wurden die Hühnereier am spitzen Pol geöffnet, der Hühnerembryo durch Dekapitation abgetötet und die embryonale Hühnerleber entnommen. Die durchschnittlich 60 mg schweren Lebern wurden zunächst bei - 20 °C in 1,5 ml Eppendorfgefäßen zu jeweils 5 Lebern pro Gefäß gelagert und später nach Bedarf weiter verarbeitet.

2.2.1.2 Extraktion und Fraktionierung des Lebergewebes

Nach dem Auftauen der Lebern bei Raumtemperatur erfolgte die Homogenisierung des Lebergewebes. Der Inhalt eines Eppendorfgefäßes wurde hierbei mit dem 5- fachen Volumen an 50 mM Tris - HCl- Puffer (pH 7,7) mit 0,25 M Saccharose in einen 2 ml Dounce- Gewebehomogenisator (Braun, Melsungen) überführt. Um Lebergewebe mit einem Gesamtgewicht von 500 mg aufzuschließen, sollten laut Scholze[36] 15 Hübe mit dem S- Stempel des Homogenisators genügen. Der Inhalt eines Eppendorfgefäßes betrug durchschnittlich 300 mg, konnte also mit der angegeben Anzahl an Hüben aufgeschlossen werden. Anschließend wurde das Homogenat in Zentrifugenröhrchen überführt und 10 Minuten bei 1.000g zentrifugiert (Hettich-Zentrifuge/ Universal 16). Durch diesen Schritt wurde das Lebergewebe in eine obere Fettschicht, eine mittlere Fraktion aus Mitochondrien, Mikrosomen und löslichen Zellbestandteilen und eine untere aus Zellkernen und Zelltrümmern bestehende Schicht getrennt.

Nach Beseitigung der Fettschicht mit Hilfe eines Plastikspatels wurde die mittlere Fraktion mit einer Glaspipette abgenommen, gewogen, in 1,5 ml Eppendorfgefäße gegeben und erneut 10 Minuten bei 10.000g (Eppendorf-Zentrifuge 5414S) zentrifugiert. Es bildeten sich abermals 3 Phasen, von denen die obere (Fettschicht) entfernt und die mittlere Schicht (Überstand= Ü10), die nun aus Mikrosomen und löslichen Enzymen des Cytosols bestand, auf 1,5 ml Eppendorfgefäße aufgeteilt und bei -20 °C gelagert wurde. Das Sediment wurde verworfen.

Der somit gewonnene Leberextrakt wurde später im Enzymtest (s. Kap. 2.2.2.2 und Kap. 2.2.3.5) eingesetzt.

2.2.2 Pre-Test: Bestimmung der De-O-Ethylase-Aktivität des gewonnenen Leberextraktes mit Ethoxycoumarin

Zur Überprüfung der Enzymaktivität des gewonnenen Leberextraktes wurde in Anlehnung an Scholze[36] ein Versuch zur Bestimmung der De-O-Ethylase- Aktivität von CYP 450P durchgeführt. Dabei wurde in einem Enzymtest die Umsetzung von Ethoxycoumarin zu Hydroxycoumarin quantitativ ausgewertet.

2.2.2.1 Bestimmung von Hydroxy- und Ethoxycoumarin im Fluoreszenzspektrometer

Für die Erstellung von Eichkurven für Hydroxy- und Ethoxycoumarin wurden unter Berücksichtigung der Angaben von Scholze[36] zunächst Stammlösungen dieser Substanzen hergestellt. Ethoxycoumarin (50 mM) wurde mit Dimethylsulfoxid (DMSO), Hydroxycoumarin (1 mM) mit dd H2O in Lösung gebracht. Es wurden dann verschiedene Konzentrationen von Ethoxycoumarin (0- 15 nmol) und Hydroxycoumarin (0- 5 nmol) durch Verdünnen der jeweiligen Stammlösung in 10 mM NaOH mit 1 M NaCl in einem Volumen von 200 µl direkt in weiße Mikrotiterplatten (FluoroNunc) pipettiert. Die Fluoreszenzmessung erfolgte im Fluorimeter (Typ HTS 7000 Series, Bio Assay Reader, FA. Perkin Elmer).

2.2.2.2 Durchführung des Enzymtests mit Ethoxycoumarin

Stammlösungen Ausgangs- Volumen Konzentrationen

konzentrationen im Ansatz (200 µl)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Reaktionsansatz zur Messung der De-O-Ethylase-Aktivität des Leberextraktes

Aufgrund der kleinen Volumina wurden insgesamt 7 dieser Reaktionsansätze zu einem Sammelansatz mit einem Gesamtvolumen von 1260 µl vereinigt. 180 µl des Sammlansatzes wurden auf 6 1,5 ml- Eppendorfgefäße verteilt (s. Tabelle 2)

Der aufgetaute Leberextrakt (Ü10) wurde nach folgendem Schema in unterschiedlichen Volumina (0- 20 µl) zu den Enzymansätzen gegeben:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2: Reaktionsansatz zur Messung der De-O-Ethylase-Aktivität des

Leberextraktes in Abhängigkeit vom eingesetzten Extraktvolumen

Die Inkubation der Enzymansätze erfolgte 1 h bei konstanter Temperatur von 37 °C unter ständigem Schütteln auf maximaler Stufe durch den Eppendorf- Thermomixer (Typ 5436). Nachdem die Enzymreaktion durch Zugabe von 25 µl 15 %- iger Trichloressigsäure abgestoppt wurde, erfolgte eine 5- minütige Zentrifugation bei 10.000 g (Eppendorf- Zentrifuge: Typ 5414S).

Mit einer Kolbenhubpipette wurden vom wässrigen Überstand jeweils 100 µl abgenommen, in ein weiteres Eppendorfgefäß überführt und in der differentiellen Extraktion eingesetzt (s. Kap. 2.2.2.3). An den Extraktionsschritt schloss die fluorimetrische Bestimmung von Hydroxycoumarin an (s. Kap. 2.2.2.1).

2.2.2.3 Differentielle Extraktion von Ethoxy- und Hydroxycoumarin

Die Extraktion erfolgte im Anschluss an den Enzymtest (Kap. 2.2.2.2). Zu 100 µl des wässrigen Überstandes aus dem Enzymtest wurden 200 µl n-Heptan gegeben und 5 Minuten im Eppendorfmixer (Typ 5432, Eppendorf, Hamburg) geschüttelt. Dieses Verfahren wurde 2 weitere Male wiederholt. Das Entfernen von Ethoxycoumarin aus der wässrigen Phase gelang durch den Übertritt von Ethoxycoumarin in die Lösungsmittelphase, welche mittels einer Kolbenhubpipette möglichst vollständig entfernt und verworfen wurde.

Um Hydroxycoumarin zu extrahieren, wurden 200 µl Ethylacetat zum Ansatz gegeben, dieser ebenfalls 5 Minuten im Eppendorfmixer geschüttelt und 100 µl der Ethylacetatphase zur Auswertung in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß pipettiert. Nach Abdampfen der organischen Phase wurde der trockene Rückstand mit 50 µl Ethanol (unvergällt) aufgenommen. Davon wurden wiederum 25 µl mit doppelt destilliertem Wasser auf ein Volumen von 200 µl gebracht und fluorimetrisch analysiert (s. Kap. 2.2.2.1). Die verbleibenden 25 µl der Ethanolphase wurden bei 4 °C gelagert, um für eine spätere Auftrennung mittel Dünnschichtchromatrographie und anschließende densitometrische Auswertung zur Verfügung zu stehen.

2.2.3 Quantitative Bestimmung von Acrolein

Das methodische Vorgehen zur quantitativen Analyse von Acrolein als Metabolisierungsprodukt von CPA orientierte sich unter anderem an Arbeiten von Bohnenstengel et al.[37] sowie Alarcon et al.[38]. Acrolein sollte als ein Metabolisierungsprodukt von CPA in Abhängigkeit von der Inkubationszeit quantitativ erfasst werden.

2.2.3.1 Herstellung von Stammlösungen

Für die Herstellung der Cyclophosphamid-Stammlösung wurden 100 mg CPA mit 5,0 ml dd H2O gelöst. Die hergestellte 76,6 mM Cyclophosphamid- Stammlösung wurde später mit doppelt destilliertem Wasser weiter auf 25 mM verdünnt. Die Bereitung dieser Stammlösungen erfolgte in 1,5 ml- Eppendorfgefäßen.

Die Acrolein- Stammlösung wurde in einer Konzentration von 20 mM durch Verdünnen mit dd H2O in verschließbaren Reagenzröhrchen angesetzt. Des Weiteren wurden in 1,5 mlEppendorfgefäßen Acrolein- Stammlösungen niedrigerer Konzentrationen (0- 0,1 mM) durch verdünnen mit dd H2O angefertigt. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden überwiegend mit 1 mM Acrolein- Stammlösungen gearbeitet. welche laut Bohnenstengel et al. über einen Zeitraum von maximal 6 Wochen ihre Stabilität behalten sollten.

Sämtliche Stammlösungen wurden lichtgeschützt bei 4 °C gelagert, mit Ausnahme der 76,6 mM Cyclophosphamid- Stammlösung, welche im Septumfläschchen in einem verschlossenen Schrank unter Lichtausschluss aufbewahrt wurde.

Es wurden weitere Stammlösungen angesetzt (Tab. 3).

[...]

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¹ Ein weiterer großer Teil der Versuche basiert auf den Bestimmungen des Chemikaliengesetztes (ChemG) und des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LmBG) [Prisma].