Die Evolution der Glucose-6-phosphat Isomerase und des cystolischen sowie plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Die Endosymbionten-Theorie
1.2 Die Evolution eukaryotischer Algen - Primäre und sekundäre Endosymbiose
1.3 Der Ursprung komplexer Algen mit rotem Plastiden - "Chromista" und Alveolata
1.3.1 Die Haptophyten
1.3.2 Die Diatomeen
1.4 Proteintransport über Plastidenmembranen
1.4.1 Proteinimport in die komplexen Plastiden der Diatomee Phaeodactylum tricornutum
1.5 Die Glucose-6-phosphat Isomerase als wirtszell-spezifischer Marker der Evolution
1.6 Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP)
1.6.1 Der Mevalonat (MVA)-Weg der IPP-Biosynthese
1.6.2 Der Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weg der IPP-Biosynthese
1.6.3 Verbreitung von MVA- und MEP-Pathway
1.7 Zielsetzung dieser Arbeit

2 Material und Methoden
2.1 Geräte
2.2 Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Enzyme
2.3 Kommerzielle Reagenzsätze (Kits).
2.4 Arbeiten mit E. coli.
2.5 Plasmid- und Bakteriophagen-Vektoren
2.6 In dieser Arbeit verwendetes Algen-Zellmaterial
2.6.1 Herkunft des Algenmaterials
2.6.2 Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Algenspezies
2.7 Arbeiten mit Nukleinsäuren
2.7.1 Standard-Methoden beim Arbeiten mit DNA
2.7.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Phaeodactylum tricornutum.
2.7.3 Arbeiten mit RNA
2.7.3.1 Grundlagen des Arbeitens mit RNA
2.7.3.2 Isolation von Gesamt-RNA aus verschiedenen Algenspezies
2.7.3.3 Konzentrationsmessung von RNA-Präparationen
2.7.3.4 Aufreinigung von poly(A)+-RNA aus verschiedenen Algenspezies
2.8 RT-PCR Experimente zur partiellen Amplifikation von Transkripten für die GPI, den cytosolischen und den plastidären Weg der IPP-Biosynthese
2.8.1 Erstellung von Aminosäure-Alignments zur Konzeption degenerierter Primer
2.8.2 Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation unbekannter Transkripte der GPI und der Gene der IPP-Biosynthesewege
2.8.3 Konzeption sequenzspezifischer Primer zur Amplifikation von Transkripten der GPI und der IPP-Biosynthese
2.8.4 Durchführung von RT-PCR Experimenten
2.9 Screening von genomischen und cDNA-Banken zur Isolierung von Genen für die GPI, die DXR und die HMGR
2.10 Sequenzierung von DNA
2.11 Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Proteinen der IPP-Biosynthesewege in Phaeodactylum tricornutum
2.11.1 Der Phaeodactylum Transformations-Vektor pPha-T1
2.11.2 Herstellung von eGFP-Reportergen-Konstrukten zur Untersuchung der Lokalisation der DXS, DXR und HMGR in Phaeodactylum
2.11.3 Stabile genetische Transformation von Phaeodactylum mittels Helium-Partikel-Kanone
2.11.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung und fotografische Dokumentation transformierter Phaeodactylum-Zellen mittels eines konfokalen Laserscanning Mikroskops
2.11.5 Nachweis der Reportergen-Konstrukte in transformierten Phaeodactylum-Zellen
2.12 Phylogenetische Analysen

3 Ergebnisse
3.1 In silico Etablierung von Referenz-Sequenzen und Erstellung von Aminosäure-Alignments
3.2 Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation von unbekannten Genfragmenten
3.3 Die Verbreitung der Glucose-6-phosphat Isomerase in den Plantae, den Alveolata und den "Chromista"
3.3.1 Etablierung einer cytosolischen und einer partiellen plastidären GPI aus der Grünalge Mesostigma viride.
3.3.2 Isolierung und Sequenzierung von Genen für die GPI aus Cyanophora paradoxa, Pyrocystis lunula, Lingulodinium polyedrum, Paramecium tetraurelia und Hanusia phi
3.3.3 Etablierung einer GPI aus Emiliania huxleyi.
3.3.4 In silico Etablierung weiterer GPI-Sequenzen
3.3.5 Identifizierung einer N-terminalen Extension in GPI-Sequenzen der Plantae
3.3.6 Konservierte Introns in den Genen der cytosolischen und der plastidären GPI der Plantae
3.3.7 Phylogenetische Analysen der etablierten Glucose-6-phosphat Isomerasen
3.3.7.1 Verbreitung und Ursprung der cytosolischen und der plastidären GPI der Plantae
3.3.7.2 Verbreitung und Ursprung der GPI in den Alveolata und den "Chromista".
3.4 Die Verbreitung der beiden IPP-Biosynthesewege in den Plantae
3.4.1 In silico Etablierung der Gene für den MEP-Weg aus den Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri
3.4.2 Isolierung und Sequenzierung zweier Klone für die HMGS aus Chara vulgaris
3.4.3 Vorkommen des MEP- und des MVA-Wegs in Mesostigma viride und Cyanophora paradoxa
3.4.4 Amplifikation einer fast vollständigen HMGS aus Mesostigma viride durch Kombination von degenerierten und genspezifischen Primern
3.4.5 In silico Etablierung von Sequenzen des MEP- und des MVA-Wegs aus den Rotalgen Cyanidioschyzon merolae und Galdieria sulphuraria
3.4.6 Identifizierung und Sequenzierung von Genen des MEP-Wegs aus der Rotalge Porphyra yezoensis
3.4.7 Zusammenfassung der Verbreitung von MVA- und MEP-Weg in den Plantae
3.5 Die Verbreitung der beiden IPP-Biosynthesewege in den Alveolata und "Chromista".
3.5.1 In silico Etablierung von Sequenzen des MEP-Wegs aus den Apicomplexa
3.5.2 In silico Etablierung von Sequenzen des MVA-Wegs aus den Ciliaten Paramecium tetraurelia und Tetrahymena thermophila
3.5.3 Isolierung und Sequenzierung des Gens für die DXR aus dem Dinophyten Pyrocystis lunula
3.5.4 In silico Etablierung von Sequenzen des MEP-Wegs aus Dinophyten
3.5.5 In silico Identifizierung des plastidären MEP-Wegs in dem Alveolaten Perkinsus marinus.
3.5.6 In silico Etablierung von Sequenzen des MVA- und des MEP-Wegs aus den Stramenopilen Phaeodactylum tricornutum und Thalassiosira pseudonana (Diatomeen) sowie Phytophthora ramorum und Phytophthora sojae (Oomyceten)
3.5.7 Isolierung und Sequenzierung einer vollständigen HMGR aus Phaeodactylum tricornutum.
3.5.8 Etablierung von Sequenzen des MEP-Wegs aus Cryptophyten
3.5.9 Etablierung von Sequenzen des MVA- und des MEP-Wegs aus den Haptophyten Prymnesium parvum und Pavlova lutheri
3.5.10 PCR-Amplifikation von Genfragmenten für Enzyme des MVA- und des MEP-Wegs aus dem Haptophyten Emiliania huxleyi
3.5.11 Zusammenfassung der Verbreitung von MVA- und MEP-Weg in den Alveolata und "Chromista"
3.6 Untersuchung der subzellulären Lokalisation der HMGR, DXS und DXR in Phaeodactylum tricornutum.
3.7 Phylogenetische Analyse der Gene für die Enzyme des cytosolischen MVA-Wegs der IPP-Biosynthese
3.7.1 Phylogenetische Analyse der HMGS (cyt-1)
3.7.2 Evolution des MVA-Wegs in Streptophyta und Rhodophyta (Plantae).
3.7.3 Die Sequenzen aus den Ciliaten lassen keine phylogenetische Zuordnung zu
3.7.4 Monophyletischer Ursprung der Stramenopilen
3.7.5 Assoziation der Stramenopilen mit dem Haptophyten Emiliania huxleyi
3.8 Phylogenetische Analyse der Gene für die Enzyme des plastidären MEP-Wegs der IPP-Biosynthese
3.8.1 Phylogenetische Analyse der DXR (pla-2)
3.8.2 Phylogenetische Analyse der HDR (pla-7)
3.8.3 Ursprung der Gene des MEP-Wegs in den Plantae
3.8.4 Die Sequenzen aus den Apicomplexa lassen keine eindeutige phylogenetische Zuordnung zu
3.8.5 Monophyletischer Ursprung der Gene für den plastidären MEP-Weg in den "Chromista".

4 Diskussion
4.1 Multiple Entstehung und heterogene Verteilung der plastidären GPI
4.2 Die cytosolische GPI als Marker der Wirtszelle - Implikationen für die Evolution der Algen
4.3 Existenz des MVA-Wegs in Mesostigma und Cyanophora - Implikationen für die ursprüngliche Verbreitung des Pathways in den Plantae
4.4 Der MEP-Weg als plastidärer Marker unterstützt einen monophyletischen Ursprung der Plastiden der "Chromista"
4.5 Phylogenie des MVA-Wegs - Implikationen für die Evolution der komplexen Algen
4.6 Identifizierung des MEP-Wegs in Perkinsus - Indiz für einen Plastiden im Austernparasiten

5 Zusammenfassung

6 Literatur

7 Anhang
7.1 In dieser Arbeit verwendete degenerierte PCR-Primer
7.2 In dieser Arbeit verwendete genspezifische PCR-Primer
7.3 Accession Nummern der in dieser Arbeit etablierten Gensequenzen
7.3.1 Accession Nummern der etablierten Glucose-6-phosphat Isomerasen
7.3.2 Accession Nummern der etablierten Gene für die IPP-Biosynthese
7.4 Sequenz des RT-PCR-Amplifikats der plastidären GPI aus Mesostigma viride
7.5 Sequenzen der RT-PCR-Amplifikate von Genen des plastidären MEP-Wegs der IPP-Biosynthese aus Cyanophora paradoxa
7.5.1 Sequenz des RT-PCR-Amplifikats der DXR (pla-2) aus Cyanophora.
7.5.2 Sequenz des RT-PCR-Amplifikats der MCT (pla-3) aus Cyanophora
7.5.3 Sequenz des RT-PCR-Amplifikats der MECPS (pla-5) aus Cyanophora
7.5.4 Sequenz des RT-PCR-Amplifikats der HDS (pla-6) aus Cyanophora
7.5.5 Sequenz des RT-PCR-Amplifikats der HDR (pla-7) aus Cyanophora
7.6 TRACE Identity (TI) Nummern der genomischen TRACE-Files aus Emiliania huxleyi
7.7 Sequenzen der in Phaeodactylum transformierten eGFP-Reportergen-Konstrukte
7.7.1 Sequenz des Kontroll-Amplifikats des HMGR-Konstrukts
7.7.2 Sequenz des Kontroll-Amplifikats des DXS-Konstrukts
7.7.3 Sequenz des Kontroll-Amplifikats des DXR-Konstrukts
7.8 Phylogenetische Analysen der Gene für Enzyme des MVA- und des MEP-Wegs der IPP-Biosynthese
7.8.1 Phylogenetische Analyse der HMGR (cyt-2)
7.8.2 Phylogenetische Analyse der MK (cyt-3)
7.8.3 Phylogenetische Analyse der PMK (cyt-4)
7.8.4 Phylogenetische Analyse der MDD (cyt-5)
7.8.5 Phylogenetische Analyse der DXS (pla-1)
7.8.6 Phylogenetische Analyse der MCT (pla-3)
7.8.7 Phylogenetische Analyse der CMK (pla-4)
7.8.8 Phylogenetische Analyse der MECPS (pla-5)
7.8.9 Phylogenetische Analyse der HDS (pla-6)

1 Einleitung

1.1 Die Endosymbionten-Theorie

Bereits 1883 postulierte der deutsche Botaniker Andreas Schimper, dass die Plastiden der Pflanzen ursprünglich frei lebende Organismen seien, die von einer anderen Zelle als Symbionten aufgenommen wurden (Schimper 1883). Er stützte seine Überlegung auf die Beobachtung, dass diese Zellorganellen nie de novo entstehen, sondern sich stets durch Teilung vermehren. Schimpers Feststellung stand in scharfem Kontrast zur Darwinschen Lehre, nach der die Evolution der Arten einen hierarchisch gegliederten, linearen Prozess darstellt (Darwin 1859). Sie lieferte jedoch eine plausible Erklärung für bis dato unverständliche Sprünge in der Evolution wie z. B. die Entstehung der phototrophen Eukaryoten, und war die Geburtsstunde der Endosymbioseforschung. Der russische Biologe Constantin Mereschkowsky stellte dann zu Beginn des 20. Jahrhunderts die Hypothese auf, dass manche Organismen durch die intrazelluläre Vereinigung zweier verschiedener Zellarten entstanden sind (Mereschkowsky 1905, 1910). Er konstatierte, dass Plastiden gleichzusetzen sind mit reduzierten Cyanobakterien ("Chromatophoren"), die früh in der Evolution eine Symbiose mit einer heterotrophen Wirtszelle eingingen, und dass die Photoautotrophie der Pflanzen ausschließlich auf diese Endosymbionten zurückzuführen ist (Abb. 1). Mereschkowsky legte den Grundstein für die heutige Endosymbionten-Theorie, die seit ihrer Wiederbelebung durch Lynn Margulis (1970) als eine der treibenden Kräfte der eukaryotischen Evolution angesehen wird. Die heutige Evolutionsforschung fußt auf den wissenschaftlichen Errungenschaften der Molekularbiologie und den Fortschritten in der Bioinformatik. Dabei ermöglicht die Entschlüsselung der genetischen Information durch moderne Sequenzierungstechniken und ihre Analyse durch Computer-Programme ganz neue Einsichten in die Verwandtschafts-Beziehungen der Arten und Organellen.

Die heutige Endosymbionten-Theorie umfasst alle Ereignisse, welche zur Entstehung der Abteilungen der Eukaryoten geführt haben. Dabei sind durch die Vereinigung vorher selbständiger Organismen neuartige Zellen entstanden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1: Entstehung der "organischen Welt" nach Mereschkowsky (1910). Mereschkowsky ging von zwei unabhängigen Ereignissen bei der Entstehung von Leben aus. Demnach entstanden erst die "Urbakterien" (linker Stamm), die sich später zu den Cyanophyceen und zu den Pilzen weiterentwickelten. Später entstanden amöboide Zellen, die Bakterien als Symbionten aufnahmen und zum Zellkern bzw. zum Plastiden rekrutierten. Hieraus entwickelten sich die Tiere und Pflanzen.

Die ersten eukaryotischen Organismen haben vor ca. 2 Milliarden Jahren existiert (Feng et al. 1997, Hedges et al. 2004). Nach der „Wasserstoff-Hypothese“ (Martin und Müller 1998) geht ihre Entstehung einher mit dem Ursprung der Mitochondrien, also mit einem endosymbiotischen Ereignis, bei dem ein Vorläufer der heutigen a-Proteobakterien (Doolittle 1996, Horner et al. 1996) als Endosymbiont von einem wahrscheinlich methanogenen Archaeon aufgenommen wurde, welches Wasserstoff (H2) als Energiequelle nutzte. Treibende Kraft für die Entstehung der Endosymbiose war dabei die Wasserstoff-Abhängigkeit des strikt anaeroben Archaeon von dem Eubakterium, welches zur Atmung befähigt war und unter anaeroben Bedingungen Wasserstoff produzierte. Ein zunehmender physikalischer Kontakt der beiden Zellen resultierte schließlich in einer vollständigen Umschließung des Eubakteriums durch die archaeale Zelle.

Die Ur-Eukaryoten ernährten sich Kohlenstoff-heterotroph. Photosynthetische Eukaryoten, die Lichtenergie in chemische Energie umzuwandeln und in Form von reduzierten Kohlenstoff-Verbindungen zu speichern vermögen, sind vor ca. 1 bis 1,5 Milliarden Jahren entstanden (Hedges et al. 2004, Yoon et al. 2004), als durch ein weiteres endosymbiotisches Ereignis ein photosynthetisch aktives Cyanobakterium von einer eukaryotischen Wirtszelle aufgenommen und als photoautotropher Energielieferant rekrutiert wurde (Bhattacharya 1997, McFadden 2001).

Viele Eigenschaften der Mitochondrien und Plastiden erinnern heute noch an ihren Ursprung. Beide Organellen verfügen über ein eigenes Genom sowie einen eigenen Transkriptions- und Translationsapparat. Dabei besteht das Genom aus einem zirkulären DNA-Molekül vergleichbar mit dem der Prokaryoten, die für Eukaryoten typischen assoziierten Histone fehlen. Die Transkription in den Plastiden wird genspezifisch entweder von einer plastidär kodierten RNA-Polymerase des prokaryotischen Typs (PEP, plastid encoded RNA polymerase) oder von einer nukleär kodierten eukaryotischen RNA-Polymerase (NEP, nuclear encoded RNA polymerase) katalysiert (Allison et al. 1996): Auch die Ribosomen der Organellen sind vom bakteriellen 70S-Typ.

Der Vorteil eines Endosymbionten für den Wirt besteht im Erwerb zusätzlicher Fähigkeiten, die z. B. eine effizientere Nutzung von Nahrungsressourcen (durch den aeroben Abbau von Zuckerverbindungen über die Atmungskette in den Mitochondrien) oder eine weitgehende Unabhängigkeit davon (durch photoautotrophe Kohlenstoff (C) -Fixierung in den Plastiden) ermöglichen. Die rekrutierten Endosymbionten brachten neben einigen für den Wirt nützlichen Stoffwechselwegen aber auch solche mit, die in der Wirtszelle bereits vorhanden waren. Die meisten redundanten Eigenschaften gingen aufgrund des mangelnden Selektionsdrucks im Laufe der Evolution in den Organellen verloren. So sind die heutigen Mitochondrien und Chloroplasten im Vergleich zu ihren selbständigen Vorfahren in ihrer Funktion erheblich reduziert. Auch die Genome der heutigen Organellen enthalten nur noch Bruchteile des Genoms ihres Vorfahren, das Plastidengenom der Rotalge Porphyra purpurea enthält z. B. nur ca. 8% der Gene des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC6803 (Delwiche 1999). Die Plastome (= Plastidengenome) heutiger Landpflanzen kodieren noch für ca. 50-150 Proteine (Leister 2003), wohingegen die kleinsten bekannten cyanobakteriellen Genome ca. 1900 Proteine kodieren (Dufresne et al. 2003). Ursache für diese Reduktion war zum einen ein Verlust cyanobakterieller Gene, deren Produkte bedingt durch die neuen Umweltbedingungen überflüssig geworden waren. Ein prominentes Beispiel hierfür ist die cyanobakterielle Zellwand, die in den meisten Plastiden nicht mehr vorhanden ist. Des Weiteren kam es zu einer Substitution cyanobakterieller Gene durch homologe Gene des Wirts. Hierbei fand eine Duplikation des kernkodierten, cytosolisch transkribierten Wirts-Gens statt, dessen Produkt in den Plastiden transportiert wird (Martin und Schnarrenberger 1997). Drittens gab es einen massiven lateralen endosymbiotischen Gentransfer (EGT) vom Genom des Endosymbionten in das des Wirtes (Martin & Herrmann 1998, Martin et al. 2002, Stegemann et al. 2003). So haben z. B. ca. 18% aller Gene im Kerngenom von Arabidopsis thaliana einen cyanobakteriellen Ursprung (Martin et al. 2002).

Grundvoraussetzung für den Ersatz organell-kodierter Proteine durch nukleär kodierte ist ein Import-System für Proteine, deren Gene kernkodiert sind und die im Cytoplasma translatiert werden. Erst wenn ein im Kern kodiertes Protein an seinen Wirkungsort im Organell zurück transportiert wird und dort seine Funktion erfüllen kann, ist eine Deletion des entsprechenden Organellen-Gens ohne Funktionsverlust möglich. Die mehrfache Etablierung solcher Protein-Import-Maschinerien im Zuge der Endosymbiosen ist eine bemerkenswerte Errungenschaft eukaryotischer Organismen. Sie beinhaltet die Entwicklung von Translokationskomplexen in den Hüllmembranen der Organellen sowie die Erweiterung der Aminosäuresequenzen der entsprechenden Proteine um eine Transitsequenz, durch die der Transport zum jeweiligen Organell und der Eintritt durch die Membranen gewährleistet werden. Plastidär lokalisierte Proteine enthalten ein N-terminales Transitpeptid mit einer Länge von ca. 25-100 Aminosäuren (Foth et al. 2003). Es wird nach dem Transport des Präproteins durch die Plastidenmembran von einer Protease abgespalten. Die Notwendigkeit der Etablierung solcher Proteinimport-Systeme ist wahrscheinlich die Ursache dafür, dass erfolgreiche Endosymbiose-Ereignisse sehr selten sind (Cavalier-Smith und Lee 1985).

Allerdings sind nicht alle Proteine endosymbiotischer Herkunft nach dem Transfer des Genes auch wieder an ihrem ursprünglichen Wirkungsort aktiv. Von den Genen cyanobakteriellen Ursprungs im Arabidopsis -Genom werden mehr als die Hälfte der Proteine heute nicht mehr in den Plastiden zurücktransportiert, sondern sind in anderen Zellkompartimenten lokalisiert (Martin et al. 2002). Umgekehrt sind Proteine im Plastiden

aktiv, deren Gene nicht von seinem cyanobakteriellen Vorläufer erworben wurden. Neben der chimären Zusammensetzung eukaryotischer Genome (s. o.) gibt es folglich einen mosaikartigen Aufbau von Stoffwechselwegen aus Proteinen verschiedener Herkunft, wie z. B. für den plastidären Calvin Zyklus höherer Pflanzen beschrieben (Martin und Schnarrenberger 1997).

1.2 Die Evolution eukaryotischer Algen – Primäre und sekundäre Endosymbiose

Die heutige Vielfalt eukaryotischer Algenabteilungen (Abb. 2) lässt sich auf mehrere endosymbiotische Ereignisse zurückführen (Douglas 1998, Delwiche 1999). Man unterscheidet dabei abhängig vom Mechanismus zwischen primären (eukaryotisch-prokaryotischen) und sekundären bzw. tertiären (eukaryotisch-eukaryotischen) Endosymbiosen.

Bei der primären Endosymbiose wurde ein Cyanobakterium von einer eukaryotischen Wirtszelle aufgenommen (McFadden 2001). Die daraus entstandenen primären Plastiden sind von zwei Hüllmembranen umgeben, von denen sich die innere auf eine der beiden Zellmembranen des Cyanobakteriums zurückführen lässt. Die äußere Hüllmembran enthält sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Komponenten (Reumann und Keegstra 1999, Vothknecht und Soll 2005). Es wird heute allgemein akzeptiert, dass die Entstehung der photosynthetischen Eukaryoten auf eine einzige primäre Endosymbiose mit einem Cyanobakterium zurückzuführen ist (Bhattacharya und Medlin 1995, Douglas 1998). Aus ihr ist die Gruppe der Plantae (Cavalier-Smith 1981) hervorgegangen, zu denen die drei rezenten Linien der Chlorophyta (Grünalgen)/Streptophyta (inkl. der Landpflanzen), der Rhodophyta (Rotalgen) und der Glaucophyta gezählt werden (Rodríguez-Ezpeleta et al. 2005).

Durch sekundäre Endosymbiosen entstandene photosynthetische Eukaryoten (Abb. 2) besitzen komplexe Plastiden (Delwiche und Palmer 1997) mit drei bzw. vier Hüllmembranen und sind durch die Aufnahme eines photosynthetischen Eukaryoten (einer Alge) durch eine eukaryotische Wirtszelle entstanden. Chlorarachniophyta und Cryptophyta besitzen im periplastidären Kompartiment (zwischen den beiden inneren und den beiden äußeren Membranen) des Plastiden noch das Nukleomorph, einen Rest des Nukleus des primären Wirtes. Bei den Chlorarachniophyten ist es das Relikt einer endosymbiotischen Grünalge (van de Peer et al. 1996), bei den Cryptophyten stammt es von einer Rotalge ab (Liaud et al. 1997, Douglas et al. 2001). Euglenophyta und Chlorarachniophyta sind unabhängig durch die Aufnahme einer Grünalge entstanden, wohingegen bei den Haptophyta, Heterokontophyta (z. B. Diatomeen), Cryptophyta und den Peridinin-haltigen Dinophyta eine Rotalge rekrutiert wurde (Abb. 2).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2: Entstehung eukaryotischer Algen durch primäre und sekundäre Endosymbiosen. Verändert nach Delwiche CF (1999).

1.3 Der Ursprung komplexer Algen mit rotem Plastiden – "Chromista" und Alveolata

Während ein monophyletischer Ursprung der Plantae als gesichert gilt, wird bis heute kontrovers diskutiert, ob die verschiedenen Gruppen der Algen mit komplexem "rotem" Plastiden ebenfalls aus einer einzigen sekundären Endosymbiose mit einer Rotalge hervorgegangen sind, oder ob es mehrere solcher Ereignisse gab (Yoon et al. 2002, Harper und Keeling 2003, Palmer 2003, Falkowski et al. 2004, Keeling et al. 2004, Harper et al. 2005, Petersen et al. 2006a, Teich et al. 2006).

Haptophyta, Heterokontophyta (= Stramenopile) und Cryptophyta werden aufgrund ihres Gehaltes an Chlorophyll c unter der operationalen Bezeichnung "Chromista" (Cavalier-Smith 1981) zusammengefasst. Molekulare Untersuchungen plastiden-spezifischer Marker wie den Enzymen des Calvin Zyklus legen einen gemeinsamen Ursprung der Plastiden dieser drei Gruppen sowie der Dinophyta nahe (Patron et al. 2004, Petersen et al. 2006a, Teich et al. 2006). Besonders die Existenz einer für komplexe rote Plastiden spezifischen Form der Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase (GAPDH), der GapC-I, in allen vier Gruppen ist ein starkes Argument für eine Monophylie dieser Plastiden (Liaud et al. 1997, 2000, Fagan et al. 1998, Fast et al. 2001, Harper und Keeling 2003).

Neben den Dinophyta als einzige photosynthetische Gruppe umfasst die Abteilung der Alveolata auch noch die heterotrophen Ciliaten, die parasitischen Apicomplexa, zu denen z. B. der Malariaerreger Plasmodium gehört, sowie die Perkinsea, deren namensgebender Vertreter Perkinsus marinus (vorher Dermocystidium marinum) verantwortlich ist für eine als "Dermo" bezeichnete Krankheit von Austern, welche massiven ökologischen und ökonomischen Schaden v. a. an der Ostküste der USA anrichtet. Die gemeinsame Klassifizierung dieser unterschiedlichen Organismengruppen beruhte ursprünglich auf morphologischen Merkmalen wie den namensgebenden Alveolen (Preisig et al. 1994), inzwischen gilt die Monophylie aller Alveolata auf Wirtszellebene auch durch molekulare Analysen als gesichert (Gajadhar et al 1991, Budin und Philippe 1998, Rodríguez-Ezpeleta et al. 2005). Die Apicomplexa besitzen noch einen degenerierten Plastiden, den Apicoplasten (Wilson et al. 1996), der ihren ursprünglich photosynthetischen Ursprung belegt (McFadden et al. 1996). Dieses Organell hat zwar seine Fähigkeit zur Photosynthese verloren, verfügt jedoch noch über für die Zelle essentielle Stoffwechselwege wie z. B. die Isoprenoid-Biosynthese (Kap. 1.6). Der Ursprung dieses komplexen Plastiden durch eine sekundäre Endosymbiose wird allgemein akzeptiert. Es ist jedoch bisher nicht gesichert, ob er von einer Rotalge abstammt (Funes et al. 2002, Foth und McFadden 2003, Funes et al. 2003) oder auf eine Grünalge zurückzuführen ist (Waller et al. 2003). Perkinsus wurde ursprünglich ebenfalls zu den Apicomplexa gezählt (Levine 1978, Perkins 1996), neuere Analysen von SSU rRNA, dem Hitzeschock-Protein Hsp90 und Strukturgenen legen jedoch eine enge Verwandtschaft mit den Dinophyta nahe (Reece et al. 1997, Saldarriaga et al. 2003, Leander und Keeling 2004). Bis vor kurzem konnten in diesem parasitischen Alveolaten keine Hinweise auf die (frühere) Existenz eines Plastiden gefunden werden.

Ein möglicher monophyletischer, photosynthetischer Ursprung der "Chromista" und Alveolata, wie durch plastiden-spezifische Marker (s. o.) impliziert, wird in der "Chromalveolat-Hypothese" diskutiert (Cavalier-Smith 1999). Allerdings wird eine Monophylie der Wirtszellen der "Chromista" bisher durch phylogenetische Untersuchungen nicht unterstützt, und es gibt auch keine Hinweise auf einen photosynthetischen Ursprung der Ciliaten (Eisen et al. 2006). Neben der Möglichkeit von mehreren unabhängigen sekundären Endosymbiosen mit Rotalgen könnten auch tertiäre Endosymbiosen eine Erklärung für diese anscheinenden Inkongruenzen zwischen plastidären und Wirtszell-Phylogenien liefern (Petersen et al. 2006a, Teich et al. 2006).

1.3.1 Die Haptophyta

Die Abteilung der Haptophyten ist eine vergleichsweise kleine Gruppe mariner Algen, zu der ca. 500 bisher bekannte Arten gehören (van den Hoek et al. 1993). Sie sind durch eine sekundäre Endosymbiose entstanden, bei der eine Rotalge als Endosymbiont aufgenommen und zum Plastiden reduziert wurde. Die Plastiden der Haptophyten sind von 4 Hüllmembranen umgeben. Sie enthalten die Photosynthese-Pigmente Chlorophyll a und c sowie Fucoxanthin als wichtigstes akzessorisches Pigment, welches die grüne Farbe des Chlorophylls überlagert und die Plastiden goldbraun erscheinen lässt. Haptophyten sind meist einzellige marine Organismen. Sie enthalten zusätzlich zu zwei Geißeln noch das namensgebende Haptonema, ein fadenförmiges Anhängsel, das der Anheftung der Zelle auf einer Oberfläche sowie dem Erbeuten von Nahrung dient. Manche Arten, z. B. Prymnesium parvum, sekretieren toxische Verbindungen, und ihre Algenblüten verursachen Massen-Fischsterben. Die Zellen der Haptophyten sind außen mit Polysaccharid-Schuppen besetzt. Bei den Vertretern der Ordnung Coccolithophorales sind sie verkalkt und werden als Coccolithen bezeichnet. Ihre Funktion ist bisher nicht vollständig geklärt, sie liegt eventuell im Fraßschutz, der Regulation des Auftriebs oder auch der Lichtzufuhr. Nach dem Absterben der Zelle sedimentieren diese Coccolithen und bilden Kalkgesteine. Ein beeindruckendes Beispiel hierfür sind die Kreidefelsen auf der Insel Rügen, die zum Großteil aus fossilen Coccolithen bestehen. Den Coccolithophorales kommt daher eine wichtige Rolle im CO2-Haushalt der Atmosphäre zu, weil sie dieses Treibhausgas als Calciumcarbonat dauerhaft binden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3: Emiliania huxleyi gehört zu den Coccolithophorales. Die Polysaccharid-Schuppen auf der Zelloberfläche sind bei dieser Gruppe verkalkt und werden als Coccolithen bezeichnet. http://www.nhm.ac.uk/hosted_sites/ina/colourcoccos/source/

Der bekannteste Vertreter der Haptophyten ist Emiliania huxleyi (Abb. 3), die als "kosmopolitische" Alge weltweit verbreitet ist, in sehr großen Mengen auftreten kann und einen wesentlichen Teil des Phytoplanktons bildet (Westbroek et al. 1993). "Ehux" dient als Modellorganismus für molekular- und zellbiologische Untersuchungen. Die Genomgröße wird auf ca. 220 Megabasenpaare (Mbp) geschätzt. Aus einem EST (expressed sequence tag)-Projekt sind ca. 3000 ESTs etabliert (Wahlund et al. 2004), und seit Dezember 2004 sind die Rohdaten des Genom-Sequenzierungsprojekt des Joint Genome Institut (JGI) des Department of Energy (DOE) der USA verfügbar. Die Sequenz-Rohdaten aus diesem Projekt stehen für die BLAST-Funktion des National Center for Biotechnology Information (NCBI) zur Verfügung (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Sowohl die Sequenz des Mitochondrien- als auch des Plastidengenoms von Emiliania huxleyi sind bereits bekannt (Sánchez Puerta et al. 2004, 2005).

1.3.2 Die Diatomeen

Diatomeen gehören zur Abteilung der Heterokontophyta (= Stramenopile), zu denen auch die nicht-photosynthetischen Oomyceten wie z. B. der Erreger der Kraut- und Knollenfäule bei Kartoffeln, Phytophthora infestans, gezählt werden. Diatomeen sind wie die Haptophyten durch die Aufnahme einer Rotalge als Endosymbiont im Zuge einer sekundären Endosymbiose entstanden. Es sind ca. 100 000 rezente, durchweg einzellige oder koloniebildende kokkale Arten bekannt (van den Hoek et al. 1993), die sowohl in marinen als auch in limnischen Gewässern und terrestrischen Habitaten vorkommen (Werner 1977, Round et al. 1990). Diatomeen sind Hauptbestandteil des marinen Phytoplanktons und ein wichtiger Vertreter der Primärproduzenten von organisch gebundenen Kohlenstoff sowie atmosphärischem Sauerstoff; ihr Beitrag von ca. 20% zur Gesamt-Primärproduktion der Erde entspricht etwa dem derzeitigen Anteil der Regenwälder. Diatomeen haben wirtschaftliche Bedeutung als Futtermittel in Aquakulturen (Gladue und Maxey 1994) sowie als Lieferanten von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (Barclay et al. 1994). Darüber hinaus stellen sie eine wichtige Quelle für die Entstehung von Erdöl dar, indem sie intrazelluläre Öltröpfchen einlagern, die einerseits als Energiespeicher, andererseits aber auch zur Regulation des Auftriebs im Wasser fungieren. Ebenso wie bei den Haptophyten ist der komplexe Plastid der Diatomeen von 4 Hüllmembranen umgeben und enthält Chlorophyll a und c sowie Fucoxanthin. Auch hier dient Fucoxanthin als akzessorisches Pigment und maskiert das Chlorophyll, so dass die Plastiden eine goldbraune Färbung zeigen (van den Hoek et al. 1993).

Der Name "Kieselalgen" geht zurück auf das von vielen Arten in der Hülle eingelagerte Siliziumdioxid (SiO2), das in Wasser gelöst auch als "Kieselsäure" bezeichnet wird. Die Hülle setzt sich aus zwei schalenförmigen, überlappenden Hälften zusammen und ist mit artspezifischen Mustern versehen. Anhand der Schalengeometrie (Abb. 4) unterscheidet man die beiden Ordnungen der radiärsymmetrischen Centrales (z. B. Thalassiosira pseudonana) und der elliptischen Pennales (z. B. Phaeodactylum tricornutum).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4: Thalassiosira pseudonana (A) gehört zu den radiärsymmetrischen Centrales, Phaeodactylum tricornutum (B) zu den elliptischen Pennales. Beide Diatomeen dienen als Modellorganismen für die molekular- und zellbiologische Forschung.

http://genome.jgi-psf.org/thaps1/thaps1.home.html; http://www.icman.csic.es/servic/servCmicroalgas_en.htm

Thalassiosira pseudonana und Phaeodactylum tricornutum dienen beide als Modellorganismen für molekular- sowie zellbiologische Untersuchungen. Sie sind weltweit vertreten und haben vergleichsweise kleine Genome von ca. 34 (T.p.) bzw. weniger als 20 (P.t.) Mbp (Armbrust et al. 2004, Scala et al. 2002). Thalassiosira pseudonana war der erste eukaryotische Vertreter des marinen Phytoplanktons, für den ein Genom-Sequenzierungsprojekt initiiert wurde (Armbrust et al. 2004). Die Rohdaten der Sequenzierung sowie bereits konkatenierte Sequenzen sind im Internet frei zugänglich (http://genome.jgi-psf.org/thaps1/thaps1.home). Auch das Genom von Phaeodactylum tricornutum wird inzwischen vollständig sequenziert, nachdem für diese Diatomee bereits ein EST-Projekt etabliert worden war (Scala et al. 2002, Maheswari et al. 2005). Die Rohdaten der Sequenzierung stehen für die BLAST-Funktion des NCBI zur Verfügung (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Für Phaeodactylum ist darüber hinaus ein System zur stabilen genetischen Transformation etabliert (Kap. 2.11) (Apt et al. 1996).

1.4 Proteintransport über Plastidenmembranen

Die Hüllmembranen der Plastiden stellen eine mechanische Barriere dar, die die meisten in der Zelle vorliegenden Verbindungen nicht ungehindert passieren können. Allerdings ist es für die Funktion der Zelle nötig, Stoffwechselprodukte zwischen Plastid und Cytoplasma auszutauschen sowie die nukleär kodierten, im Cytoplasma synthetisierten Plastiden-Proteine in dieses Kompartiment zu transportieren. Folglich hat die Zelle Mechanismen entwickelt, die den Austausch von Metaboliten zwischen Stroma und Cytosol sowie den Transport von Proteinen in den Plastiden ermöglichen. Der Austausch von Stoffwechselprodukten erfolgt über eine Reihe spezifischer, regulierter Poren, Ionenkanäle und Transporter, die sowohl in der äußeren als auch in der inneren Hüllmembran vorhanden sind (Neuhaus und Wagner 2000). Der Transport von Proteinen in den Plastiden erforderte die Etablierung von Targeting- und Import-Systemen, die die Passage durch die Plastiden-Membranen ermöglichen.

1.4.1 Proteinimport in die komplexen Plastiden der Diatomee Phaeodactylum tricornutum

Heterokontophyta besitzen einen komplexen Plastiden mit vier Hüllmembranen, der aus einer sekundären Endosymbiose mit einer Rotalge hervorgegangen ist (Martin et al. 1998). Notwendig für die erfolgreiche Etablierung sekundärer Endosymbiosen war die Entwicklung von Mechanismen, die den Transport nukleär kodierter Plastiden-Proteine über die zusätzlichen Membranen hinweg ermöglichen. Diese unterscheiden sich von den Import-Systemen in Plastiden mit zwei Hüllmembranen

Die beiden inneren Hüllmembranen des Phaeodactylum -Plastiden entsprechen den beiden Hüllmembranen des Plastiden der endosymbiotischen Rotalge und werden als innere (IEM, inner envelope membrane) und äußere (OEM, outer envelope membrane) Hüllmembran bezeichnet. Die nach außen hin folgende periplastidäre Membran (PPM) entstammt der Plasmamembran des Endosymbionten (Cavalier-Smith 2000). Die äußere Hülle ist wahrscheinlich ein Derivat der ursprünglichen phagocytotischen Vakuole des Wirtes (Gibbs 1981, Cavalier-Smith 2000). Sie ist mit Ribosomen besetzt und mit dem ER der Zelle direkt verbunden (Bouck 1965, Ishida et al. 2000), weshalb sie auch als chloroplastidäres ER (CER) bezeichnet wird. Im Gegensatz zum posttranslationalen Proteinimport in die einfachen Plastiden der Plantae durch die Proteinkomplexe Toc und Tic (translocon on the outer/inner chloroplast envelope membrane) (Jarvis und Soll 2002, Gutensohn et al. 2006) erfolgt die Translokation der Proteine in Phaeodactylum kotranslational, und der erste Schritt ist der Eintritt in dieses (sekretorische) Endomembransystem der Zelle (Bhaya und Grossmann 1991). Er wird von einem ER-Signalpeptid vermittelt, das sich am N-Terminus des Proteins vor dem eigentlichen Transitpeptid befindet (Ishida et al. 2000, Kilian und Kroth 2003). Alle bekannten Präsequenzen für den Import von Proteinen in komplexe Plastiden zeigen eine solche bipartite Struktur aus Signal- und Transit-Peptid (Waller et al. 1998, Kroth und Strothmann 1999, Sulli et al. 1999, Wastl und Maier 2000, Archibald et al. 2003, Patron et al. 2005, Gould et al. 2006). Nach der Passage der äußeren Membran und somit dem Eintritt des Proteins in das Endomembransystem wird das Signalpeptid von einer Protease abgespalten (Apt et al. 2002), und das Transitpeptid vermittelt den gerichteten Weitertransport des Proteins in den Plastiden (Cavalier-Smith 2003). Die genauen Mechanismen, die den Transport über die inneren drei Membranen ermöglichen, sind noch nicht aufgeklärt (Kilian und Kroth 2005).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 5: Konsensus-Sequenzen innerhalb der bipartiten Signal-Transit-Peptide der Diatomeen Thalassiosira pseudonana und Phaeodactylum tricornutum. Abszisse: Position der jeweiligen AS relativ zur Spaltstelle des Signalpeptides. Ordinate: relative Häufigkeit der jeweiligen AS. Verändert aus Kilian und Kroth (2005).

Die bipartiten Präsequenzen der Plastiden-Proteine von Phaeodactylum tricornutum und Thalassiosira pseudonana enthalten ein konserviertes Aminosäure-Sequenzmotiv an der Protease-Spaltstelle des Signalpeptides (Kroth 2002, Kilian und Kroth 2005). Dieses ASAF- oder AFAP-Motiv (Abb. 5) ist hochkonserviert, und die Protease-Schnittstelle für die Abspaltung der Signalpeptide befindet sich in allen Protein-Vorläufern unmittelbar vor dem Phenylalanin (F). Reportergenkonstrukte, die ausschließlich aus Signalpeptiden (inklusive des ASAF-/AFAP-Motivs, jedoch ohne das Transitpeptid) und dem Green Fluorescent Protein (GFP) bestehen, zeigen in Phaeodactylum eine Anreicherung des GFP in charakteristischen Strukturen ("blob"-like structures, BLS) innerhalb der Plastidenhülle, wahrscheinlich an einer der inneren Membranen (Kap. 3.6) (Kilian und Kroth 2005), da das für den Transport durch die inneren Membranen nötige Transitpeptid fehlt.

1.5 Die Glucose-6-Phosphat Isomerase als wirtszell-spezifischer Marker der Evolution

Die im Cytosol lokalisierte Glucose-6-phosphat Isomerase (GPI, EC 5.3.1.9) erfüllt essentielle Funktionen in der katabolischen Glykolyse sowie in der anabolischen Gluconeogenese. Sie katalysiert die reversible Isomerisierung von Glucose-6-phosphat (G6P) und Fructose-6-phosphat (F6P) (Abb. 6) und ist in Eukaryoten, Bakterien und Archaeen ubiquitär verbreitet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 6: Reversible Isomerisierung von Glucose-6-Phosphat (G6P) und Fructose-6-Phosphat (F6P) durch die Glucose-6-Phosphat Isomerase (GPI) in Glykolyse und Gluconeogenese.

Höhere Pflanzen besitzen neben der cytosolischen GPI auch ein plastidär lokalisiertes Enzym cyanobakteriellen Ursprungs (Nowitzki et al. 1998), dessen Aminosäure-Sequenz nur eine Homologie von etwa 30% mit der cytosolischen Form aufweist. Diese GPI ist innerhalb der Chloroplasten essentiell sowohl für die Stärkesynthese (Yu et al. 2000) als auch für den oxidativen Pentosephosphatweg (Martin und Herrmann 1998).

Die Glykolyse war bereits vor der Entstehung der Plastiden in den heterotrophen Eukaryoten etabliert (Margulis 1970, Doolittle 1998). Sie ist charakteristisch für alle Eukaryoten. Die an diesem Stoffwechselweg beteiligten Enzyme sollten die Wirtszellen der Endosymbiosen repräsentieren und phylogenetische Analysen der GPI zur Aufklärung der Verwandtschaftsbeziehungen zwischen den Wirtszellen der verschiedenen Algengruppen beitragen.

1.6 Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP)

"Isopren" (2-Methyl-1,3-butadien) findet sich formal als Grundeinheit in der chemischen Struktur einer Vielzahl von Naturstoffen, die daher auch als "Isoprenoide" (Terpene) bezeichnet werden. Diese Stoffklasse umfasst eine große Vielfalt von mehr als 22.000 sehr heterogenen Verbindungen (Connolly und Hill 1992), von denen der Großteil in Pflanzen, ein geringerer Anteil in tierischen Organismen gebildet wird. Zu ihnen gehören u. a. die Steroide (wie z. B. Brassinosteroide in pflanzlichen, Cholesterol in tierischen Organismen), Ubi- und Plastochinone, die Carotinoide und das Phytol in den Seitenketten der Chlorophylle. Das tatsächliche Vorläufermolekül in der Biosynthese der Isoprenoide ist allerdings nicht Isopren, sondern seine biochemisch aktivierte Form, das Isopentenyl Pyrophosphat (IPP), sowie dessen Isomer Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 7: A)"Isopren" ist formal die chemische Grundeinheit der Terpene ("Isoprenoide). B) Isopentenyl Pyrophosphat (IPP) und Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP) als Vorläufermoleküle des Isopren werden durch die Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (IDI) reversibel ineinander umgewandelt

IPP und DMAPP werden von einer Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (= Isopentenyl Diphosphat Isomerase, IDI) ineinander überführt (Abb. 7); die Bildung der Terpene erfolgt durch Kondensation von IPP und DMAPP. Dieser Schritt dient ubiquitär in allen drei Reichen (Archaea, Eubakterien und Eukaryoten) der Bildung von Isopren. Die Biosynthese des IPP selbst jedoch kann über zwei völlig unterschiedliche Stoffwechselwege erfolgen (Rohmer et al. 1993, 1996, Lichtenthaler et al. 1997a, Kuzuyama 2002), deren Verbreitung innerhalb der verschiedenen Organismengruppen unterschiedlich ist (Lange et al. 2000). In höheren Pflanzen existieren beide Wege, sie zeigen jedoch ein kompartimentspezifisches Vorkommen: während sich der Mevalonat (MVA)-Pathway im Cytosol befindet, wird IPP im Plastiden über den Methylerythritol-phosphat (MEP)-Pathway gebildet (Abb. 8). Das in den verschiedenen Kompartimenten synthetisierte IPP fließt auch jeweils in die Herstellung kompartiment-spezifischer Isoprenoid-Verbindungen ein (Eisenreich et al. 1998, 2001, Lange und Ghassemian 2003).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 8: Kompartimentierung der IPP-Biosynthese in den Zellen Höherer Pflanzen (siehe Text). MEP: Methylerythritol Phosphat. MVA: mevalonic acid. GAP: Glycerinaldehyd-3-Phosphat. IPP: Isopentenyl Pyrophosphat DMAPP: Dimethylallyl Pyrophosphat.

1.6.1 Der Mevalonat (MVA)-Weg der IPP-Biosynthese

Der Mevalonat- oder MVA-Pathway (MVA = mevalonic acid, Mevalonsäure) der IPP-Biosynthese wurde erstmals in isolierten Leberzellen sowie in Saccharomyces cerevisiae entdeckt und in den 1960er Jahren von Konrad Bloch und Feodor Lynen aufgeklärt (Katsuki und Bloch 1967, Lynen 1967), denen 1964 der Nobelpreis für Medizin verliehen wurde. Er ist der einzige Biosyntheseweg für IPP in tierischen und pilzlichen Zellen. Auch in gram-positiven Eubakterien und den meisten Archaeen konnte er nachgewiesen werden und galt daher lange als der universelle Stoffwechselweg zur Herstellung von IPP (Popják 1958, Spurgeon und Porter 1981, Lichtenthaler et al. 1997a). In höheren Pflanzen wird das über den MVA-Weg im Cytosol gebildete IPP für die Synthese von Sterolen und bestimmten Sesquiterpenen (Nes und Venkatramesh 1999) sowie für den Einbau in die Ubichinon-Seitenketten (Disch et al. 1998a) in den Mitochondrien verwendet.

Das Ausgangsprodukt für die Synthese von IPP über den MVA-Pathway ist Acetoacetyl-CoA. Aus der Kondensation mit Acetyl-CoA entsteht HMG-CoA (Hydroxymethylglutaryl-CoA), was über das namensgebende Mevalonat zu IPP umgewandelt wird. Abbildung 9 zeigt schematisch die verschiedenen Reaktionen, die daran beteiligten Enzyme und die gebildeten Zwischenprodukte. Die vollständigen Bezeichnungen der Enzyme sowie ihre EC (Enzyme Commission) Nummern sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tab.1: Am MVA-Pathway beteiligte Enzyme mit verwendeten Abkürzungen, EC Nummern und Acc. Nr. der jeweiligen Referenz-Sequenz aus Arabidopsis thaliana (A.t.)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Der MVA-Pathway ist der Angriffspunkt für die so genannten "Statine" wie z. B. Atorvastatin, die in der Medizin zur Senkung erhöhter Blutfettwerte eingesetzt werden ("Cholesterin-Blocker"). Sie inhibieren effektiv durch eine kompetitive Hemmung das Enzym HMGR (Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase) (Istvan und Deisenhofer 2001) und führen somit im menschlichen Körper zu einem stark herabgesetzten IPP-Spiegel und folglich auch an daraus synthetisiertem Cholesterol. Die Hemmung der IPP-Synthese hat beträchtliche negative Auswirkungen auf die Zellfunktion, weshalb u. a. das von der Bayer AG seit 1997 unter dem Namen Lipobayâ vertriebene Cerivastatin trotz großen wirtschaftlichen Erfolgs aufgrund der massiven Nebenwirkungen und einigen Todesfällen 2001 wieder vom Markt genommen wurde. In höheren Pflanzen führt die Hemmung der HMGR durch z. B. Lovastatin zu einer verminderten Zellteilungsaktivität (Miyazawa et al. 2002) und geringerem Zellwachstum (Suzuki et al. 2003).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 9: Cytosolischer Mevalonat (MVA)-Pathway der IPP-Biosynthese. Die an der jeweiligen Reaktion beteiligten Enzyme sind rot unterlegt. MVA: mevalonic acid. IPP: Isopentenyl Pyrophosphat. cyt-: Nummer des jeweiligen Enzyms innerhalb des Pathways. Bezeichnung der Enzyme siehe Tabelle 1.

1.6.2 Der Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weg der IPP-Biosynthese

Der zweite Stoffwechselweg zur Biosynthese von IPP wird nach dem Zwischenprodukt 2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphat (MEP) heute allgemein als MEP-Pathway oder auch als Mevalonat-unabhängiger Pathway bezeichnet.

Er ist erst seit 13 Jahren bekannt und wurde von Michel Rohmer und seinen Mitarbeitern in E. coli entdeckt (1993). Der MEP-Pathway ist in den meisten Eubakterien der einzige Biosyntheseweg für IPP (Eisenreich et al. 1998, Lange et al. 2000); in Eukaryoten ist er in den Plastiden lokalisiert. In höheren Pflanzen wird das über diesen Weg gebildete IPP für die Biosynthese von plastidenspezifischen Isoprenoidverbindungen wie z. B. den Carotinoiden und den Seitenketten der Chlorophylle und Plastochinone verwendet, aber auch für die Herstellung des von Pflanzen emittierten Isopren selbst (Abb. 8) (Zeidler et al. 1997, Loreto et al. 2004). Eine schematische Darstellung der sieben Reaktionsschritte, der daran beteiligten Enzyme und der gebildeten Zwischenprodukte findet sich in Abbildung 10.

Obwohl dieser Stoffwechselweg erst unlängst entdeckt wurde, sind die daran beteiligten Enzyme und die entstehenden Zwischenprodukte bereits vollständig entschlüsselt (zusammengefasst in Rodríguez-Concepción und Boronat 2002, Eisenreich et al. 2004). Der MEP-Pathway unterscheidet sich grundlegend vom MVA-Pathway sowohl in den genutzten Ausgangsverbindungen als auch in seinen Intermediaten. Als Substrate für die Synthese von IPP dienen hier Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) und Pyruvat, die durch Kondensation zu Deoxyxylulose-Phosphat (DXP) umgewandelt werden. Über das namensgebende MEP wird letztlich IPP gebildet. Die vollständigen Bezeichnungen der Enzyme sowie ihre EC Nummern sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Tab. 2: Am MEP-Pathway beteiligte Enzyme mit verwendeten Abkürzungen, EC Nummern und Acc. Nr. der jeweiligen Referenz-Sequenz aus Arabidopsis thaliana (A.t.)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 10: Plastidärer MEP-Pathway der IPP-Biosynthese. Die an der jeweiligen Reaktion beteiligten Enzyme sind grün unterlegt. MEP: Methylerythritol-phosphat. IPP: Isopentenyl Pyrophosphat. pla-: Nummer des jeweiligen Enzyms innerhalb des Pathways. Bezeichnungen der Enzyme siehe Tabelle 2.

Der MEP-Pathway ist ein vielversprechender Ansatzpunkt für den therapeutischen Einsatz von Antibiotika, da er in den meisten Eubakterien, nicht aber im Menschen vorhanden ist. Der bekannteste Inhibitor des MEP-Wegs ist Fosmidomycin, welches das Enzym DXR (Deoxyxylulose-Phosphat Reductoisomerase, pla-2) hemmt und in den frühen 1980er Jahren als Antibiotikum gegen gram-negative Bakterien entwickelt wurde (Kojo et al. 1980, Mine et al. 1980). Hassan Jomaa und seine Mitarbeiter konnten dann Ende der 1990er Jahre nachweisen, dass auch der Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, Isoprenoide über den MEP-Pathway im Apicoplasten synthetisiert und sehr sensitiv auf die Behandlung mit Fosmidomycin reagiert (Jomaa et al. 1999). Im Rahmen klinischer Teststudien werden Fosmidomycin und Derivate desselben bereits erfolgreich in der Malaria-Therapie eingesetzt (Wiesner et al. 2003, Borrmann et al. 2005).

1.6.3 Verbreitung von MVA- und MEP-Pathway

Die Existenz des MEP-Wegs ist heute in der Mehrzahl der gram-negativen Eubakterien (Rohmer et al. 1993, Cornish et al. 2006) und in den Cyanobakterien (Disch et al. 1998b) nachgewiesen. Im Gegensatz dazu synthetisieren gram-positive Eubakterien (Wilding et al. 2000) und Archaea (Boucher et al. 2004, Grochowski et al. 2006) IPP über den MVA-Weg.

Innerhalb der Eukaryoten konnte der MEP-Weg ausschließlich in Plastiden nachgewiesen werden. Aplastidäre Organismen wie Tiere und Pilze synthetisieren IPP ausschließlich über den cytosolischen MVA-Weg. Höhere Pflanzen nutzen beide Stoffwechselwege, wobei der MVA-Weg im Cytosol und der MEP-Weg im Plastiden lokalisiert ist (Eisenreich et al. 2004).

Die allgemeine Verbreitung von MEP- und MVA-Weg innerhalb der Plantae (Streptophyta/Chlorophyta, Rhodophyta und Glaucophyta), deren gemeinsamer Ursprung auf eine einzige primäre Endosymbiose mit einem Cyanobakterium zurückzuführen ist (Rodríguez-Ezpeleta et al. 2005), wurde bisher nicht analysiert. Biochemische Untersuchungen mit radioaktiv markierten Substraten geben Hinweise darauf, dass auch die Charophyceen (Streptophyta) als höchstentwickelte Gruppe innerhalb der Grünalgen beide Stoffwechselwege besitzen, wohingegen die Chlorophyta (z. B. Chlamydomonas) sämtliche Isoprenoide über den MEP-Weg synthetisieren und anscheinend nicht über den MVA-Weg verfügen (Schwender et al. 2001). Diese Beobachtung wird dadurch bestätigt, dass sich im inzwischen vollständig sequenzierten Kerngenom der Chlorophycee Chlamydomonas reinhardtii (Shrager et al. 2003) keine Gene für Enzyme des MVA-Wegs finden lassen. Es ist bisher nicht bekannt, ob die einzellige Grünalge Mesostigma viride über beide Wege der IPP-Biosynthese verfügt. Die Klassifikation dieser Alge war lange Zeit höchst umstritten (zusammengefasst in McCourt et al. 2004). Inzwischen wird Mesostigma aufgrund zahlreicher molekularer Belege den Streptophyten zugeordnet und als ein Schlüsselorganismus in der Evolution der Landpflanzen betrachtet (Simon et al. 2006, Petersen et al. 2006b, Rodríguez-Ezpeleta et al. 2006).

Die Verbreitung der beiden Synthesewege innerhalb der Rotalgen wurde bisher nicht untersucht. Biochemische Studien deuten auf die Existenz beider Wege in Cyanidium caldarium hin (Disch et al. 1998b), wohingegen im Genom von Cyanidioschyzon merolae (Matsuzaki et al. 2004) bis auf ein Homolog der HMGS keine Gene für Enzyme des MVA-Pathways vorhanden sind.

Auch die Verbreitung von MVA- und MEP-Weg in den verschiedenen Gruppen der komplexen Algen ist bisher unbekannt. Markierungsexperimente mit verschiedenen Vertretern der Stramenopilen deuten auf die Existenz beider Stoffwechselwege in Crysophyceen (Disch et al. 1998b) und auch in Diatomeen (Cvejic und Rohmer 2000, Massé et al. 2004a, b) hin. Der Malariaerreger Plasmodium falciparum bildet IPP nur über den im Apicoplasten lokalisierten MEP-Weg (Jomaa et al. 1999), analog zu den Chlorophyten fehlen auch hier die Gene für die Enzyme des cytosolischen MVA-Wegs. Die Verbreitung der beiden IPP-Biosynthesewege innerhalb der restlichen Gruppen der komplexen Algen mit rotem Plastiden (der Haptophyta, Cryptophyta und Dinophyta) ist bisher gänzlich ungeklärt. Ebenso ist nicht bekannt, wie die Ciliaten und Perkinsus IPP synthetisieren. Sie werden zusammen mit den Apicomplexa und den Dinophyta als Alveolata klassifiziert (Gajadhar et al. 1991, Budin und Philippe 1998), wobei in den Ciliaten bisher keinerlei Hinweise auf die Existenz eines Plastiden gefunden wurden (Eisen et al. 2006).

Zielsetzung dieser Arbeit

Die vorliegende Arbeit umfasst zwei Themenschwerpunkte. Zum einen wird die Verbreitung der cytosolischen und der plastidären Isoform der Glucose-6-phosphat Isomerase (GPI) in den verschiedenen Vertretern der Plantae (Streptophyta/Chlorophyta, Rhodophyta und Glaucophyta), der Alveolata (Dinophyta, Apicomplexa, Perkinsea und Ciliata) und der "Chromista" (Haptophyta, Stramenopile und Cryptophyta) phylogenetisch analysiert. Die Evolution dieses Genes im Verlauf der primären und sekundären Endosymbiosen soll untersucht, und die Verwandtschaftsbeziehungen der verschiedenen Abteilungen sollen insbesondere anhand des cytosolischen Gens, einem spezifischen Marker der Wirtszelle, charakterisiert werden.

Der Schwerpunkt dieser Dissertation ist die molekulare Analyse der Isoprenoid (IPP)-Biosynthesewege in den oben genannten eukaryotischen Abteilungen. Ziel der Arbeit ist die Etablierung umfangreicher Sequenzdatensätze für alle fünf Enzyme des cytosolischen MVA- ("cyt-1" bis "cyt-5") sowie der sieben Enzyme des plastidären MEP-Pathways ("pla-1" bis "pla-7") und deren phylogenetische Analyse. Erst seit etwa zehn Jahren ist bekannt, dass Pflanzen über beide Stoffwechselwege verfügen. Obwohl deren Präsenz in Grünalgen bisher noch nicht molekular untersucht wurde, belegt die Genomanalyse von Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyta) das Fehlen des cytosolischen MVA-Pathways. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Verteilung in der Grünalge Mesostigma viride, einem Schlüsselorganismus der Evolution von Charophyceen und Landpflanzen (Streptophyta), umfassend charakterisiert. Die transformierbare Diatomee Phaeodactylum tricornutum dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Zellbiologie komplexer Algen. Durch Transformation mit eGFP-Reportergen-Konstrukten soll untersucht werden, ob die subzelluläre Lokalisation beider Wege zur Isoprenoid-Biosynthese nach der sekundären Endosymbiose erhalten blieb. Die Verteilung der beiden Stoffwechselwege ist in den verschiedenen Abteilungen der "Chromista" und der Alveolata bisher unbekannt und wird im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Besondere Bedeutung haben die entsprechenden IPP-Gene im Zusammenhang mit dem in jüngster Zeit kontrovers diskutierten Ursprung komplexer Algen durch sekundäre und tertiäre Endosymbiosen. Insbesondere die phylogenetischen Beziehungen der Haptophyten zu den Stramenopilen und Cryptophyten sollen in diesem Kontext untersucht werden, um die angebliche Monophylie der "Chromista" kritisch zu hinterfragen. Hinsichtlich der Alveolata können durch die Verteilung der beiden IPP-Biosynthesewege mindestens zwei offene Fragen der Evolution untersucht werden. Einerseits ist trotz der kompletten Sequenzierung des Malaria-Erregers immer noch offen, ob sich der heterotrophe Plastid der Apicomplexa auf eine Rotalge zurückführen lässt. Andererseits ist der plastidäre MEP-Pathway ein ideales Testsystem zur genaueren Untersuchung jüngster Hinweise auf die Präsenz eines bisher unbekannten Plastiden in Perkinsea, die eine evolutive Schlüsselstellung innerhalb des Superensembles Alveolata haben.

2 Material und Methoden

2.1 Geräte

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Enzyme

Es wurden Verbrauchsmaterialien und Chemikalien der Firmen Amersham Bioscience, Applichem, BD Biosciences, Bioline, Diagonal, Fluka, Invitrogen, Merck, Pall, Roth, Sarstedt, Serva und Sigma verwendet.

Restriktionsenzyme und weitere DNA-modifizierende Enzyme wurden von den Firmen Fermentas, Invitrogen, Q·BIOgene und Roche bezogen.

Radiochemikalien wurden von Hartmann Analytik (Braunschweig) geliefert. Röntgenfilme (HyperfilmÔ MP) stammen von Amersham Biosciences, Entwickler- und Fixierlösung von der Firma Kodak.

Oligonukleotid-Primer wurden von den Firmen MWG Biotech und Invitrogen synthetisiert. Verbrauchsmaterialien für die Transformation von P. tricornutum wurden von der Firma BioRad bezogen.

2.3 Kommerzielle Reagenzsätze (Kits)

Die in Tabelle 3 aufgeführten Kits wurden verwendet:

Tab. 3: Im Rahmen dieser Arbeit verwendete Reagenzsätze (Kits)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4 Arbeiten mit E. coli

Die Anzucht von Escherichia coli auf Festmedium und in Flüssigmedien, die Transfektion mit l-DNA sowie die Transformation chemisch (CaCl2) oder elektrokompetenter E. coli Zellen mit Plasmid-DNA erfolgten nach Standard-Protokollen (Sambrook et al. 1989). Zur Anzucht von E. coli Kulturen wurden CY-Medium, dYT-Medium, LB-Medium und SOC-Medium verwendet. Folgende Stämme wurden eingesetzt: XL1-Blue MRF´ (Stratagene), SOLR (Stratagene), XLOLR (Stratagene), KW251 (Promega # T3571).

2.5 Plasmid- und Bakteriophagen-Vektoren

Folgende Plasmid- und Phagen-Vektoren kamen zum Einsatz: pBlueskript II SK+ und KS+ (Stratagene), pCRÒ2.1 (Invitrogen), pPha-T1 (Zaslavskaia et al. 2000; Kap. 2.11.2), lZAPII und lZAP Express (Stratagene), lNM1149 (Murray 1983), lEMBL3 (Stratagene).

2.6 In dieser Arbeit verwendetes Algen-Zellmaterial

2.6.1 Herkunft des Algenmaterials

Die folgenden Algenspezies wurden von der Sammlung von Algenkulturen der Universität Göttingen (SAG) erworben und anschließend im Labor kultiviert: Glaucophyta: Cyanophora paradoxa SAG 29.60. Haptophyta: Emiliania huxleyi SAG 33.90, Pavlova lutheri SAG 926-1, P rymnesium parvum SAG 127.79.

Zellen der Diatomee Phaeodactylum tricornutum Bohlin (UTEX 646) wurden freundlicherweise von Carolina Río Bártulos, TU Braunschweig, zur weiteren Kultur und Transformation zur Verfügung gestellt.

Pflanzenmaterial der Grünalge Chara vulgaris wurde von Jörn Petersen, TU Braunschweig, im Freiland gesammelt (Petersen et al. 2003), gereinigt und bis zur weiteren Verwendung bei –20° C gelagert.

2.6.2 Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Algenspezies

Die Kultivierung der von der SAG erworbenen Algenspezies (Kap. 2.6.1) erfolgte jeweils im von der Sammlung empfohlenen Medium (C. paradoxa: „V+“, E. huxleyi: „SWES“, P. lutheri und P. parvum: 1/2 „SWES“). C. paradoxa wurde in 3 l Erlenmeyerkolben in einem Volumen von 1,5 l Medium in einem 16h/8h Hell/Dunkel-Rhythmus mit einer Beleuchtungsstärke von 75-100 mE kultiviert. Die verschiedenen Haptophyten-Spezies wurden in 10 l Kultivierungsgefäßen in einem Volumen von 8 l Medium mit einer Beleuchtungsstärke von 75-100 mE unter ständiger steriler Belüftung mit 1,5% CO2 angezogen. Zur Verarbeitung wurden die Kulturen in FalconÔ-Gefäße überführt und das Zellmaterial durch Zentrifugation in einer Kühlzentrifuge vom Medium befreit. Die pelletierten Zellen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefrostet und bei -80° C aufbewahrt.

P. tricornutum Wildtyp-Zellen wurden in 200 ml f/2-Medium (Guillard und Ryther 1962) unter ständigem Schütteln mit 60 rpm in einem 16h/8h Hell/Dunkel-Rhythmus inkubiert. Die Kultivierung transformierter P. tricornutum Zellen erfolgte auf Festmedium (f/2 mit 8% Agarose) bzw. in Flüssigkultur (f/2) in Dauerbeleuchtung mit 75-100 mE.

2.7 Arbeiten mit Nukleinsäuren

2.7.1 Standard-Methoden beim Arbeiten mit DNA

Standard-Methoden beim Arbeiten mit DNA erfolgten entsprechend der Standardprotokolle nach Sambrook et al. (1989). Im Zuge dieser Arbeit wurden folgende Standard-Methoden angewendet:

Methoden zur Isolierung von DNA: Plasmid-Minipräparationen aus E. coli Zellen, l-Bakteriophagen-Minipräparationen.

Methoden zur Reinigung von DNA: Phenolisierung, Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation, Agarose-Gelelektrophorese, Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren, Sephadex-G-50-Chromatographie

Enzymatische Modifikation von DNA: Restriktionsspaltungen, Ligation mit T4-DNA-Ligase, Dephosphorylierung von DNA mit Alkalischer Phosphatase, Phosphorylierung von DNA mit T4-Kinase, Auffüllreaktion mit Klenow-Polymerase.

2.7.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Phaeodactylum tricornutum

Die Isolierung von Gesamt-DNA aus Transformanten von P. tricornutum zur Kontrolle des integrierten Reportergen-Konstrukts (Kap. 2.11) erfolgte unter Verwendung des QIAamp Tissue Kit der Firma Qiagen. Dazu wurde Zellmaterial von transformierten Kolonien in je 150 ml f/2 Medium überführt und 28 Tage kultiviert (Kap. 2.6.2). Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation vom Medium befreit und durch Mörsern in flüssigem N2 mechanisch aufgebrochen. Die Isolierung der DNA erfolgte entsprechend den Herstellerangaben.

2.7.3 Arbeiten mit RNA

2.7.3.1 Grundlagen des Arbeitens mit RNA

Zur Inhibierung von RNasen wurden alle wässrigen Lösungen mit 1/1000 Diethylpyrocarbonat (DEPC) versetzt, geschüttelt, über Nacht inkubiert und anschließend autoklaviert (121° C, 1bar, 20 min). Glasgefäße wurden durch vierstündiges Erhitzen auf 180° C sterilisiert, Pipettenspitzen und Reaktionsgefäße durch 40minütiges Autoklavieren (121° C, 1 bar). Arbeitsflächen sowie Pipetten, Pinzetten und weitere Arbeitsgegenstände wurden durch Behandlung mit RNaseAwayÔ (Invitrogen) von potentiellen RNase-Kontaminationen gereinigt.

2.7.3.2 Isolation von Gesamt-RNA aus verschiedenen Algenspezies

Zur Isolation von RNA aus Emiliania huxleyi und Cyanophora paradoxa wurde Zellmaterial von Algenkulturen zum Zellaufbruch in flüssigem Stickstoff durch Mörsern fein zerkleinert. Die Isolation von Gesamt-RNA erfolgte mittels TRIzolÒ Reagenz (Invitrogen) entsprechend den Herstellerangaben. Isolierte RNA wurde in doppelt destilliertem H2O aufgenommen und 1/10 Volumen zur Qualitätskontrolle auf einem 0,7%igen Agarosegel eingesetzt. Die isolierte Gesamt-RNA wurde bei -80° C gelagert.

Gesamt-RNA aus Chara vulgaris, Mesostigma viride, Pavlova lutheri und Prymnesium parvum wurde unter Verwendung von Polyclar AT von René Teich, TU Braunschweig, isoliert (Teich et al. 2006).

2.7.3.3 Konzentrationsmessung von RNA-Präparationen

Die Konzentration von RNA wurde durch Messung der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt. Eine OD260=1 entspricht einer RNA-Konzentration von 40 mg/ml. Die Reinheit der RNA kann über das Verhältnis der OD bei 260 nm zur OD bei 280 nm bestimmt werden, welches für proteinfreie Lösungen bei 1,8-2,0 liegt (Mülhardt 2002).

2.7.3.4 Aufreinigung von poly(A)+-RNA aus verschiedenen Algenspezies

Die Aufreinigung von poly(A)+-RNA aus isolierter Gesamt-RNA von E. huxleyi, C. paradoxa, M. viride sowie P. tricornutum erfolgte unter Verwendung des OligotexÔ mRNA Mini Kit (Qiagen) entsprechend den Herstellerangaben. 1/10 Volumen der isolierten poly(A)+-RNA wurde zur Qualitätskontrolle auf ein 0,7%iges Agarosegel aufgetragen. Isolierte poly(A)+-RNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80° C gelagert.

Die Aufreinigung von poly(A)+-RNA aus Chara vulgaris, Pavlova lutheri und Prymnesium parvum erfolgte mittels Oligo-(dT)-Cellulose (Amersham Pharmacia) durch René Teich, TU Braunschweig (Teich et al. 2006).

2.8 RT-PCR Experimente zur partiellen Amplifikation von Transkripten für die GPI, den cytosolischen und den plastidären Weg der IPP-Biosynthese

2.8.1 Erstellung von Aminosäure-Alignments zur Konzeption degenerierter Primer

Um innerhalb der Gene für die zu untersuchenden Proteine konservierte Bereiche für die Primerkonzeption (Kap. 2.8.2, Kap. 3.1) zu detektieren, wurden Aminosäure (AS)-Alignments von bekannten AS-Sequenzen anderer Organismen angefertigt. Die jeweiligen Sequenzen wurden dazu mit Hilfe des Programms CLUSTAL_X (Thompson et al. 1997) Version 1.81 verglichen. Aus den hierbei gebildeten Phylip-Dateien wurden mit der "ProtDist"-Funktion des Phylip Programm-Pakets Punkt-Alignments erstellt. Punkt-Alignments führen Aminosäure-Positionen der verschiedenen Organismen, die mit der als Referenz definierten Sequenz übereinstimmen, nicht gesondert auf, sondern stellen sie durch einen Punkt dar. Diese Darstellungsweise vereinfacht die Detektion von konservierten Bereichen. Ein exemplarischer Ausschnitt aus dem Punkt-Alignment der DXR findet sich in Abbildung 14 (Kap. 3.1). Bei allen im Rahmen dieser Arbeit erstellten Alignments diente die jeweilige AS-Sequenz aus Arabidopsis thaliana (Accession Nummern siehe Kap. 1.6 bzw. Kap. 3.1) als Referenz.

2.8.2 Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation unbekannter Transkripte der GPI und der Gene der IPP-Biosynthesewege

Aus den meisten im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Organismen lagen kaum Sequenzinformationen über die GPI und keinerlei Sequenzinformationen von Genen aus den IPP-Biosynthesewegen vor. Daher wurden die erstellten Aminosäure-Alignments (Kap. 2.8.1) der einzelnen Enzyme auf hochkonservierte Sequenzbereiche durchsucht und degenerierte Primer gegen diese Abschnitte konzipiert, welche anschließend zur Amplifikation von Fragmenten der unbekannten Transkripte eingesetzt wurden. Die Primer wurden in ihrem GC-Gehalt den zu untersuchenden Spezies angepasst. Alle in dieser Arbeit untersuchten Organismen weisen einen sehr hohen GC-Gehalt der DNA von ca. 65% auf, was auf die bevorzugte Verwendung von Guanin und Cytosin in Wobble-Positionen zurückzuführen ist. Daher wurde bei der Konzeption der Primer an degenerierten Stellen meist auf die Integration von Adenin oder Thymin verzichtet. Hierdurch wird zum einen der Degenerierungsgrad der Primer und damit die Anzahl nicht bindender Basen-Kombinationen gesenkt. Zum zweiten steigt die Schmelztemperatur der Primer mit zunehmendem GC-Gehalt, wodurch sich die Annealing-Temperatur bei der PCR-Reaktion erhöhen und somit die Spezifität der Bindung steigern lässt. Abbildung 11 zeigt exemplarisch die Konzeption des Primers P396(+) für die cytosolische HMGS.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 11: Konzeption des degenerierten Primers P396(+). Obere Reihe: AS-Sequenz des konservierten Bereiches. Grau unterlegt: degenerierte Positionen. Durchgestrichen: bei der Konzeption zur Erhöhung des GC-Gehaltes nicht berücksichtigte mögliche Nukleotide. Untere Reihe: Nukleotid-Sequenz des degenerierten Primers in 5´->3´-Richtung. nt: Nukleotide. Deg: Degenerierungsgrad

Die im Rahmen dieser Arbeit konzipierten und eingesetzten degenerierten Primer sind im Anhang (Kap. 6.1) aufgeführt.

2.8.3 Konzeption sequenzspezifischer Primer zur Amplifikation von Transkripten der GPI und der IPP-Biosynthesewege

Zur Amplifikation von cDNA-Sequenzen aus E. huxleyi und P. tricornutum wurden anhand der aus den Rohdaten der Total-Sequenzierungsprojekte (Kap. 1.3, Kap. 3.1) gewonnenen genomischen Sequenzen spezifische Primer konzipiert. Aus P. parvum ist eine partielle Sequenz der DXR (DV098488) in der NCBI-Datenbank hinterlegt, anhand derer für dieses Gen ebenfalls spezifische Primer konzipiert wurden. Zur Amplifikation der fast vollständigen HMGS aus M. viride wurden durch die Amplifikation mit degenerierten Primer Sequenzinformationen gewonnen, die anschließend zur Konzeption von genspezifischen Primern genutzt wurden.

Mögliche Primersequenzen wurden mit Hilfe des Programms Oligo Analyzer im Hinblick auf die Ausbildung von Sekundärstrukturen sowie Hybridisierungen mit Gegenstrang-Primern untersucht, außerdem wurde die Schmelztemperatur kontrolliert. Um die Spezifität der Bindung zu steigern, wurden Oligonukleotide mit einer Mindestlänge von 17 nt konzipiert. Die Schmelztemperaturen von Primerpaaren wurden aufeinander abgestimmt und betrugen in der Regel zwischen 68 und 76° C.

Die im Rahmen dieser Arbeit eingesetzten spezifischen Primer sind im Anhang (Kap. 6.2) aufgeführt.

2.8.4 Durchführung von RT-PCR Experimenten

Es wurden RT-PCR Experimente zur Amplifikation der Transkripte der GPI sowie aller in Kapitel 1.6 aufgeführten an der cytosolischen oder der plastidären Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP) beteiligten Gene durchgeführt.

Die Reverse Transkription erfolgte unter Verwendung des ThermoScriptä RT-PCR System Kit (Invitrogen) entsprechend den Herstellerangaben. Es wurden jeweils 10 ml Gesamt-RNA bzw. poly(A)++-RNA eingesetzt, sowie 1 ml (50 mm) des Oligo(dT)-Primers und 2 ml (20 mm) dNTP-Mix. Auf die Zugabe von H2O zum cDNA-Synthesis Mix wurde verzichtet, das Endvolumen der Reaktionen betrug 20 ml. Die Elongationsphase für die Erststrangsynthese bestand aus einem Zyklus von jeweils 20 min bei 50° C, bei 55° C, bei 60° C und bei 65° C.

Für die PCR-Reaktionen wurde jeweils 1 ml des RT-Ansatzes unverdünnt eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte mittels der AccuPrimeä GC-Rich Polymerase (Invitrogen) entsprechend den Herstellerangaben unter Verwendung des mitgelieferten Puffer A. Die Elongationszeit richtete sich nach der erwarteten Größe der jeweils zu amplifizierenden Fragmente und betrug 1min/kb. Um unspezifische Amplifikationen zu verhindern, wurde eine „Touchdown“-PCR durchgeführt: in den ersten fünf Zyklen der Reaktion wurde eine sehr hohe Annealing-Temperatur im Bereich der Schmelztemperatur der Primer gewählt, die jeweils nach 5 Zyklen schrittweise um 4° C gesenkt wurde. Nach 3 x 5 Zyklen mit stetig sinkender Annealing-Temperatur wurden 35 Zyklen mit der endgültigen Annealing-Temperatur durchlaufen, die bei spezifischen Primern ca. 15° C unterhalb der Schmelztemperatur der Primer lag.

Zur Aufreinigung des Amplifikats wurde der Reaktionsansatz auf einem Agarosegel aufgetrennt, Amplifikate mit der erwarteten Größe aus dem Gel ausgeschnitten, die DNA mittels des Geneclean Turbo Kit (Bio 101) aus dem Gel eluiert und in 14,2 ml doppelt destilliertem H2O aufgenommen. Nach Zugabe von 10 mm dATP, Taq -Puffer und 1 U Taq -Polymerase wurde der Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 20 ml für 1 h bei 72° C inkubiert, um an die glatten Enden des Amplifikats ein zusätzliches, 3´-überhängendes Adenin anzufügen, welches für die Ligation in den PCR-Ligationsvektor pCRÒ2.1 aufgrund dessen überstehender Thymidin-Reste nötig ist. Das Amplifikat wurde anschließend wiederum unter Verwendung des Geneclean Turbo Kit bzw. mit Quick-Clean (Bioline) aufgereinigt und in 20 ml doppelt destilliertem H2O aufgenommen. Die Konzentration des Amplifikats wurde bestimmt und zur Ligation wurden ca. 50 mg mit 12,5 mg pCRÒ2.1-Vektor und 1 U T4-DNA-Ligase (Invitrogen bzw. Fermentas) bei 12° C ü. N. inkubiert. Der Ligationsansatz wurde anschließend phenolisiert, mit EtOH unter Zugabe von 20 mg Glycogen gefällt und in 15 ml doppelt destilliertem H2O aufgenommen. 5 ml wurden zur Transformation selbst hergestellter chemisch kompetenter E. coli XL1blue MRF´ Zellen (Kap. 2.4) eingesetzt.

2.9 Screening von genomischen und cDNA-Banken zur Isolierung von Genen für die GPI, die DXR und die HMGR

Im Zuge dieser Arbeit wurden Gene für die Glucose-6-Phosphat Isomerase (GPI) aus einer genomischen l-EMBL3-Bank von Cyanophora paradoxa sowie aus l-cDNA-Banken des Cryptophyten Hanusia phi (NM1149-Bank), dem Ciliaten Paramecium tetraurelia (ZapExpress-Bank) und den Dinophyten Pyrocystis lunula und Lingulodinium polyedrum (jeweils ZapII-Bank) isoliert. Des Weiteren wurden Gene für die DXR (pla-2) aus einer genomischen EMBL3-Bank des Haptophyten Prymnesium parvum und aus den cDNA-Banken des Cryptophyten Hanusia phi und des Dinophyten Pyrocystis lunula isoliert. Aus einer ZapII-cDNA-Bank der Diatomee Phaeodactylum tricornutum wurde das Gen für die HMGR (cyt-2) isoliert.

Zur Herstellung homologer Sonden wurden durch PCR mit degenerierten Primern Fragmente der Gene amplifiziert; als Matrizen dienten cDNA aus Hanusia, Prymnesium und Phaeodactylum, makronukleäre DNA aus Paramecium sowie Massenexzisionen der cDNA-Banken von Pyrocystis und Lingulodinium. Die Amplifikate wurden mit [a-32P]-dCTP markiert und die Sonden-DNA über Sephadex-G50-Säulen aufgereinigt. Die Banken wurden mit einer Konzentration von jeweils ca. 105 pfu/Platte unter Verwendung von E. coli KW251 (Kap 2.4) auf LB-Platten ausplattiert, die Replika-Filter bei ca. 60° C für eine Dauer von 6-12 h mit den Sonden hybridisiert und anschließend mit 0,3 x SSPE gewaschen.

2.10 Sequenzierung von DNA

Sequenzierungen wurden als Auftragsarbeit von der Firma SeqLab Sequencing Laboratories (Göttingen) durchgeführt. Sämtliche DNA wurde doppelsträngig sequenziert. Die Elektropherogramme wurden mittels des Programms Edit View 1.0.1 (Applied Biosystems) visualisiert, die Auswertung der Sequenzdaten erfolgte unter Verwendung des MacMolly Programm-Paketes (Mologen).

2.11 Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Proteinen der IPP-Biosynthesewege in Phaeodactylum tricornutum

Mit Hilfe des für Phaeodactylum etablierten Systems zur stabilen Transformation (s. u.) sollte die subzelluläre Lokalisierung verschiedener Enzyme des MVA- und des MEP-Stoffwechselwegs in dieser Diatomee analysiert werden. Hierzu wurden Reportergenkonstrukte mit einer auf die Codon Usage von Phaeodactylum abgestimmten Form des Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) (eGFP, enhanced green fluorescent protein) hergestellt. Diese wurden unter Verwendung des Transformations-Vektors pPha-T1 (s. u.) in Phaeodactylum transformiert, und die Lokalisation des Reportergen-Konstrukts innerhalb der Zelle durch Detektion der Fluoreszenz des eGFP mittels eines Fluoreszenz-Mikroskops festgestellt.

2.11.1 Der Phaeodactylum Transformations-Vektor pPha-T1

Phaeodactylum tricornutum Bohlin (UTEX 646) gehört zu den wenigen Algengruppen, die genetisch transformiert werden können. Das von Apt et al. etablierte System (Apt et al. 1996, Zaslavskaia et al. 2000) bringt Transgen-Konstrukte durch biolistischen Transfer mittels einer Helium-Partikelkanone in die Phaeodactylum -Zelle ein. Das Transgen integriert ungerichtet stabil in das Kerngenom der Alge. Der dafür konstruierte Transformations-Vektor pPha-T1 (Zaslavskaia et al. 2000) basiert auf dem Vektor pSP73 (Promega, Madison, WI). Er enthält eine modifizierte multiple cloning site (MCS) mit einer Vielzahl von Restriktions-Schnittstellen, in die das Transgen gerichtet kloniert werden kann. Die MCS wird flankiert vom Promotor- und Terminator-Bereich des hochexprimierten homologen fcpA Genes (Fucoxanthin Chlorophyll a bindendes Protein) aus Phaeodactylum (Bhaya und Grossman 1993), welcher eine starke Expression des Transgens vermittelt. Der Vektor umfasst eine Zeocin-Resistenz zur Selektion von Transformanten. Das entsprechende Gen wurde ursprünglich aus dem Actinobakterium Streptoalloteichus hindustanus isoliert und trägt daher die Bezeichnung sh ble (ble: Bleomycin, entspricht Zeocin). Der Vektor enthält zusätzlich eine Ampicillin-Resistenz (Amp) und den E. coli Replikationsstart (origin of replication, ori), und kann somit in E. coli amplifiziert werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 12: Karte des Phaeodactylum Transformations-Vektors pPha-T1 (Accession AF219942). MCS: multiple cloning site. fcpA/B: Promotoren der Phaeodactylum -Gene fcpA/B (s. Text). sh ble: Zeocin-Resistenzgen . ori: E. coli origin of replication. Amp: Ampicillin-Resistenzgen. Aus Zaslavskaia et al. (2000).

2.11.2 Herstellung von eGFP-Reportergen-Konstrukten zur Untersuchung der Lokalisation der DXS, DXR und HMGR in Phaeodactylum

Es wurde die Lokalisation der HMGR aus dem MVA-Weg sowie der DXS und DXR aus dem MEP-Weg analysiert. Hierzu wurde das eGFP -Gen an das 3´-Ende eines Fragments des zu untersuchenden Gens kloniert, welches den N-Terminus (einschließlich des Start-Codons und gegebenenfalls einer entsprechenden Signal-Transit-Sequenz) sowie einen Teil des reifen Proteins umfasste. Beide Fragmente wurden inframe in die MCS des pPha-T1-Vektors kloniert, so dass eine Expression unter dem fcpA- Promotor stattfand. Das eGFP war ursprünglich zur Amplifikation gerichtet in den multiple copy Vektor pBluescript SK+ kloniert und wurde durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Nco I und Hind III herausgeschnitten.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 13: Schema der Klonierungsstrategien für die Erstellung von Reportergen-Konstrukten zur Analyse der subzellulären Lokalisation der HMGR, DXS und DXR in Phaeodactylum tricornutum.

Die Nco I-Schnittstelle (CC¯ ATG G) umfasst das Startcodon des eGFP, sodass das Gen direkt hinter das zu analysierende Fragment kloniert wird. Die Fragmente der HMGR, DXS und DXR wurden durch Amplifikation mit spezifischen Primer hergestellt. Für die HMGR diente hierbei der aus einer cDNA-Bank isolierte Klon aus Phaeodactylum (Kap. 3.5.7) als Matrize, die Fragmente der DXS und DXR wurden durch RT-PCR aus poly(A)+-RNA (Kap. 2.8.4) amplifiziert. Die spezifischen Primer wurden anhand der aus der NCBI-Datenbank etablierten genomischen Sequenz konzipiert und zur gerichteten Klonierung des Fragments jeweils um eine Restriktionsschnittstelle erweitert. Dabei wurde anhand der bekannten cDNA- bzw. genomischen Sequenzinformation kontrolliert, dass die gewählten Schnittstellen nicht weitere Male innerhalb des zu amplifizierenden Fragments vorkamen. Die Amplifikate wurden im Anschluss an die PCR mit den entsprechenden Enzymen gespalten und so mit unterschiedlichen sticky ends an 5´ bzw. 3´-Ende versehen. In allen Fällen wurde durch den reverse-Primer am 3´-Ende des Fragments eine Nco I-Schnittstelle derart eingefügt, dass eGFP inframe an das Fragment ligiert werden konnte. Der forward-Primer fügte an den 5´-Terminus jeweils eine Eco RI-Schnittstelle an.

Das amplifizierte Fragment des zu untersuchenden Gens und eGFP wurden anschließend in einem gemeinsamen Ligationsansatz in den mit Eco RI und Hind III gespaltenen pPha-T1-Vektor ligiert. Dabei wurden ca. 50 ng Fragment und 50 ng eGFP zusammen mit 25 ng pPha-T1/ Eco RI/ Hind III in einem Gesamtvolumen von 10 ml mit 1 U T4-Ligase bei 12 °C ü. N. inkubiert. Abbildung 13 zeigt schematisch die Klonierungsstrategie für die Fragmente der HMGR, DXS und DXR. Das Konstrukt wurde in E. coli XL1Blue MRF´ transformiert, im analytischen Maßstab aufgereinigt und zur Kontrolle sequenziert.

2.11.3 Stabile genetische Transformation von Phaeodactylum tricornutum mittels Helium-Partikel-Kanone

Die Transformation von Phaeodactylum tricornutum Bohlin (UTEX 646) erfolgte prinzipiell wie in Apt et al. (1996) und Zaslavskaia et al. (2000) beschrieben. Es wurde das BiolisticÒ-PDS-1000/He Particle Delivery System der Firma Biorad entsprechend den Herstellerangaben verwendet.

Die zu transformierenden Zellen wurden zuvor in Flüssigkultur angezogen (Kap. 2.6.2). Zur Transformation wurden jeweils ca. 106 Zellen in der Mitte einer f/2-Platte auf einer kreisförmigen Fläche von ca. 4 cm Durchmesser ausplattiert.

Von den Reportergen-Konstrukten (Kap. 2.11.2) wurden jeweils ca. 15 μg DNA pro Transformationsvorgang an Wolfram-Microcarrier gebunden und unter Verwendung unterschiedlicher Berstscheiben bei Drücken von 650 psi, 900 psi, 1100 psi und 1350 psi auf die ausplattierten Zellen geschossen.

Die Transformations-Platten wurden ca. 24 h unter Dauerbeleuchtung mit ca. 75-100 mE inkubiert, anschließend wurden die Zellen mit 1 ml f/2-Medium abgelöst, auf 4 frische f/2-Platten ausgestrichen und für 21 Tage inkubiert (Kap. 2.6.2).

2.11.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung und fotografische Dokumentation transformierter Phaeodactylum -Zellen mittels eines konfokalen Laserscanning Mikroskops

Zur fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung wurde Zellmaterial von transformierten Kolonien in 10 ml Flüssigmedium überführt und für 10 Tage kultiviert (Kap. 2.6.2), um die Teilung der Zellen zu beschleunigen und so den Anteil abgestorbener, nicht mehr analysierbarer Zellen zu verringern.

Transformierte Phaeodactylum Zellen wurden aus der Flüssigkultur steril entnommen und mit Hilfe eines konfokalen LSM gescannt. Dabei wurde das eGFP durch Laserbestrahlung mit einer Wellenlänge von 488 nm angeregt. Zur Verifizierung des eGFP wurde die Emission bei der für dieses Chromophor charakteristischen Wellenlänge von 515-520 nm kontrolliert. Transformanten mit deutlicher und eindeutig zu lokalisierender Fluoreszenz wurden zur Dokumentation fotografiert.

2.11.5 Nachweis der Reportergen-Konstrukte in transformierten Phaeodactylum -Zellen

Für die dokumentierten Phaeodactylum- Transformanten sollte die tatsächliche Integration des jeweiligen Reportergen-Konstrukts in das Genom nachgewiesen werden, um eventuelle Kontaminationen auszuschließen. Dazu wurde Gesamt-DNA aus in Flüssigkultur angezogenen Zellen isoliert (Kap. 2.7.2). Diese wurde zur PCR-Amplifikation unter Verwendung eines eGFP -spezifischen sowie je eines Vektor-spezifischen Primers (Kap. 3.6) eingesetzt. Beide Primer binden nicht an die genomische DNA des Wildtyps, sondern ausschließlich an das integrierte Reportergen-Konstrukt. Die amplifizierten Fragmente wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt, anschließend eluiert, in pCRÒ2.1 kloniert und sequenziert.

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