Der Schwerpunkt dieser Dissertation ist die molekulare Analyse der Isoprenoid (IPP)-Biosynthesewege und der Glucose-6-phosphat Isomerase in den verschiedenen Vertretern der Plantae (Streptophyta/Chlorophyta, Rhodophyta und Glaucophyta), der Alveolata (Dinophyta, Apicomplexa, Perkinsea und Ciliata) und der "Chromista" (Haptophyta, Stramenopile und Cryptophyta).
Erst seit etwa zehn Jahren ist bekannt, dass Pflanzen über einen cytosolischen, aber auch über eine unabhängigen, plastidären Weg der IPP-Biosynthese verfügen. Die Genomanalyse von Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyta) legt das Fehlen des cytosolischen MVA-Pathways in Grünalgen nahe. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Verteilung in der Grünalge Mesostigma viride, einem Schlüsselorganismus der Evolution von Charophyceen und Landpflanzen (Streptophyta), umfassend charakterisiert. Die transformierbare Diatomee Phaeodactylum tricornutum dient als Modellorganismus zur Untersuchung der Zellbiologie komplexer Algen. Durch Transformation mit eGFP-Reportergen-Konstrukten soll untersucht werden, ob die subzelluläre Lokalisation beider Wege zur Isoprenoid-Biosynthese nach der sekundären Endosymbiose erhalten blieb.
Die Verteilung der beiden Stoffwechselwege ist in den verschiedenen Abteilungen der "Chromista" und der Alveolata bisher unbekannt und wird im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Besondere Bedeutung haben die entsprechenden IPP-Gene im Zusammenhang mit dem in jüngster Zeit kontrovers diskutierten Ursprung komplexer Algen durch sekundäre und tertiäre Endosymbiosen. Insbesondere die phylogenetischen Beziehungen der Haptophyten zu den Stramenopilen und Cryptophyten sollen in diesem Kontext untersucht werden, um die angebliche Monophylie der "Chromista" kritisch zu hinterfragen. Hinsichtlich der Alveolata können durch die Verteilung der beiden IPP-Biosynthesewege mindestens zwei offene Fragen der Evolution untersucht werden. Einerseits ist trotz der kompletten Sequenzierung des Malaria-Erregers immer noch offen, ob sich der heterotrophe Plastid der Apicomplexa auf eine Rotalge zurückführen lässt.
Andererseits ist der plastidäre MEP-Pathway ein ideales Testsystem zur genaueren Untersuchung jüngster Hinweise auf die Präsenz eines bisher unbekannten Plastiden in den Perkinsea, die eine evolutive Schlüsselstellung innerhalb des Superensembles Alveolata haben.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 Die Endosymbionten-Theorie
1.2 Die Evolution eukaryotischer Algen - Primäre und sekundäre Endosymbiose
1.3 Der Ursprung komplexer Algen mit rotem Plastiden - "Chromista" und Alveolata
1.3.1 Die Haptophyten
1.3.2 Die Diatomeen
1.4 Proteintransport über Plastidenmembranen
1.4.1 Proteinimport in die komplexen Plastiden der Diatomee Phaeodactylum tricornutum
1.5 Die Glucose-6-phosphat Isomerase als wirtszell-spezifischer Marker der Evolution
1.6 Biosynthese von Isopentenyl Pyrophosphat (IPP)
1.6.1 Der Mevalonat (MVA)-Weg der IPP-Biosynthese
1.6.2 Der Methylerythritol Phosphat (MEP)-Weg der IPP-Biosynthese
1.6.3 Verbreitung von MVA- und MEP-Pathway
1.7 Zielsetzung dieser Arbeit
2 Material und Methoden
2.1 Geräte
2.2 Verbrauchsmaterialien, Chemikalien und Enzyme
2.3 Kommerzielle Reagenzsätze (Kits)
2.4 Arbeiten mit E. coli
2.5 Plasmid- und Bakteriophagen-Vektoren
2.6 In dieser Arbeit verwendetes Algen-Zellmaterial
2.6.1 Herkunft des Algenmaterials
2.6.2 Kultivierung der in dieser Arbeit verwendeten Algenspezies
2.7 Arbeiten mit Nukleinsäuren
2.7.1 Standard-Methoden beim Arbeiten mit DNA
2.7.2 Isolierung von Gesamt-DNA aus Phaeodactylum tricornutum
2.7.3 Arbeiten mit RNA
2.7.3.1 Grundlagen des Arbeitens mit RNA
2.7.3.2 Isolation von Gesamt-RNA aus verschiedenen Algenspezies
2.7.3.3 Konzentrationsmessung von RNA-Präparationen
2.7.3.4 Aufreinigung von poly(A)+-RNA aus verschiedenen Algenspezies
2.8 RT-PCR Experimente zur partiellen Amplifikation von Transkripten für die GPI, den cytosolischen und den plastidären Weg der IPP-Biosynthese
2.8.1 Erstellung von Aminosäure-Alignments zur Konzeption degenerierter Primer
2.8.2 Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation unbekannter Transkripte der GPI und der Gene der IPP-Biosynthesewege
2.8.3 Konzeption sequenzspezifischer Primer zur Amplifikation von Transkripten der GPI und der IPP-Biosynthese
2.8.4 Durchführung von RT-PCR Experimenten
2.9 Screening von genomischen und cDNA-Banken zur Isolierung von Genen für die GPI, die DXR und die HMGR
2.10 Sequenzierung von DNA
2.11 Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Proteinen der IPP-Biosynthesewege in Phaeodactylum tricornutum
2.11.1 Der Phaeodactylum Transformations-Vektor pPha-T1
2.11.2 Herstellung von eGFP-Reportergen-Konstrukten zur Untersuchung der Lokalisation der DXS, DXR und HMGR in Phaeodactylum
2.11.3 Stabile genetische Transformation von Phaeodactylum mittels Helium-Partikel-Kanone
2.11.4 Fluoreszenzmikroskopische Untersuchung und fotografische Dokumentation transformierter Phaeodactylum-Zellen mittels eines konfokalen Laserscanning Mikroskops
2.11.5 Nachweis der Reportergen-Konstrukte in transformierten Phaeodactylum-Zellen
2.12 Phylogenetische Analysen
3 Ergebnisse
3.1 In silico Etablierung von Referenz-Sequenzen und Erstellung von Aminosäure-Alignments
3.2 Konzeption degenerierter Primer zur Amplifikation von unbekannten Genfragmenten
3.3 Die Verbreitung der Glucose-6-phosphat Isomerase in den Plantae, den Alveolata und den "Chromista"
3.3.1 Etablierung einer cytosolischen und einer partiellen plastidären GPI aus der Grünalge Mesostigma viride
3.3.2 Isolierung und Sequenzierung von Genen für die GPI aus Cyanophora paradoxa, Pyrocystis lunula, Lingulodinium polyedrum, Paramecium tetraurelia und Hanusia phi
3.3.3 Etablierung einer GPI aus Emiliania huxleyi
3.3.4 In silico Etablierung weiterer GPI-Sequenzen
3.3.5 Identifizierung einer N-terminalen Extension in GPI-Sequenzen der Plantae
3.3.6 Konservierte Introns in den Genen der cytosolischen und der plastidären GPI der Plantae
3.3.7 Phylogenetische Analysen der etablierten Glucose-6-phosphat Isomerasen
3.3.7.1 Verbreitung und Ursprung der cytosolischen und der plastidären GPI der Plantae
3.3.7.2 Verbreitung und Ursprung der GPI in den Alveolata und den "Chromista"
3.4 Die Verbreitung der beiden IPP-Biosynthesewege in den Plantae
3.4.1 In silico Etablierung der Gene für den MEP-Weg aus den Grünalgen Chlamydomonas reinhardtii und Volvox carteri
3.4.2 Isolierung und Sequenzierung zweier Klone für die HMGS aus Chara vulgaris
3.4.3 Vorkommen des MEP- und des MVA-Wegs in Mesostigma viride und Cyanophora paradoxa
3.4.4 Amplifikation einer fast vollständigen HMGS aus Mesostigma viride durch Kombination von degenerierten und genspezifischen Primern
3.4.5 In silico Etablierung von Sequenzen des MEP- und des MVA-Wegs aus den Rotalgen Cyanidioschyzon merolae und Galdieria sulphuraria
3.4.6 Identifizierung und Sequenzierung von Genen des MEP-Wegs aus der Rotalge Porphyra yezoensis
3.4.7 Zusammenfassung der Verbreitung von MVA- und MEP-Weg in den Plantae
3.5 Die Verbreitung der beiden IPP-Biosynthesewege in den Alveolata und "Chromista"
3.5.1 In silico Etablierung von Sequenzen des MEP-Wegs aus den Apicomplexa
3.5.2 In silico Etablierung von Sequenzen des MVA-Wegs aus den Ciliaten Paramecium tetraurelia und Tetrahymena thermophila
3.5.3 Isolierung und Sequenzierung des Gens für die DXR aus dem Dinophyten Pyrocystis lunula
3.5.4 In silico Etablierung von Sequenzen des MEP-Wegs aus Dinophyten
3.5.5 In silico Identifizierung des plastidären MEP-Wegs in dem Alveolaten Perkinsus marinus
3.5.6 In silico Etablierung von Sequenzen des MVA- und des MEP-Wegs aus den Stramenopilen Phaeodactylum tricornutum und Thalassiosira pseudonana (Diatomeen) sowie Phytophthora ramorum und Phytophthora sojae (Oomyceten)
3.5.7 Isolierung und Sequenzierung einer vollständigen HMGR aus Phaeodactylum tricornutum
3.5.8 Etablierung von Sequenzen des MEP-Wegs aus Cryptophyten
3.5.9 Etablierung von Sequenzen des MVA- und des MEP-Wegs aus den Haptophyten Prymnesium parvum und Pavlova lutheri
3.5.10 PCR-Amplifikation von Genfragmenten für Enzyme des MVA- und des MEP-Wegs aus dem Haptophyten Emiliania huxleyi
3.5.11 Zusammenfassung der Verbreitung von MVA- und MEP-Weg in den Alveolata und "Chromista"
3.6 Untersuchung der subzellulären Lokalisation der HMGR, DXS und DXR in Phaeodactylum tricornutum
3.7 Phylogenetische Analyse der Gene für die Enzyme des cytosolischen MVA-Wegs der IPP-Biosynthese
3.7.1 Phylogenetische Analyse der HMGS (cyt-1)
3.7.2 Evolution des MVA-Wegs in Streptophyta und Rhodophyta (Plantae)
3.7.3 Die Sequenzen aus den Ciliaten lassen keine phylogenetische Zuordnung zu
3.7.4 Monophyletischer Ursprung der Stramenopilen
3.7.5 Assoziation der Stramenopilen mit dem Haptophyten Emiliania huxleyi
3.8 Phylogenetische Analyse der Gene für die Enzyme des plastidären MEP-Wegs der IPP-Biosynthese
3.8.1 Phylogenetische Analyse der DXR (pla-2)
3.8.2 Phylogenetische Analyse der HDR (pla-7)
3.8.3 Ursprung der Gene des MEP-Wegs in den Plantae
3.8.4 Die Sequenzen aus den Apicomplexa lassen keine eindeutige phylogenetische Zuordnung zu
3.8.5 Monophyletischer Ursprung der Gene für den plastidären MEP-Weg in den "Chromista"
4 Diskussion
4.1 Multiple Entstehung und heterogene Verteilung der plastidären GPI
4.2 Die cytosolische GPI als Marker der Wirtszelle - Implikationen für die Evolution der Algen
4.3 Existenz des MVA-Wegs in Mesostigma und Cyanophora - Implikationen für die ursprüngliche Verbreitung des Pathways in den Plantae
4.4 Der MEP-Weg als plastidärer Marker unterstützt einen monophyletischen Ursprung der Plastiden der "Chromista"
4.5 Phylogenie des MVA-Wegs - Implikationen für die Evolution der komplexen Algen
4.6 Identifizierung des MEP-Wegs in Perkinsus - Indiz für einen Plastiden im Austernparasiten
5 Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht die evolutionären Verwandtschaftsbeziehungen eukaryotischer Algen, indem sie zwei zentrale Stoffwechselwege – die Glucose-6-phosphat Isomerase (GPI) und die Isoprenoid (IPP)-Biosynthese – molekular und phylogenetisch analysiert. Das primäre Ziel ist es, die Verteilung der cytosolischen und plastidären Isoformen dieser Enzyme in verschiedenen Algengruppen (Plantae, Alveolata, "Chromista") aufzuklären, um die Wirtszell-Evolution und endosymbiotische Ereignisse sowie den Ursprung komplexer Plastiden besser zu verstehen.
- Phylogenetische Analyse der GPI-Gene als Marker für Wirtszellen.
- Molekulare Charakterisierung der MVA- und MEP-Wege der IPP-Biosynthese.
- Untersuchung der subzellulären Lokalisation von Enzymen in Phaeodactylum tricornutum.
- Überprüfung der "Chromalveolat-Hypothese" und der Monophylie der Algen.
- Identifizierung von Plastiden-Hinweisen im Austernparasiten Perkinsus marinus.
Auszug aus dem Buch
1.1 Die Endosymbionten-Theorie
Bereits 1883 postulierte der deutsche Botaniker Andreas Schimper, dass die Plastiden der Pflanzen ursprünglich frei lebende Organismen seien, die von einer anderen Zelle als Symbionten aufgenommen wurden (Schimper 1883). Er stützte seine Überlegung auf die Beobachtung, dass diese Zellorganellen nie de novo entstehen, sondern sich stets durch Teilung vermehren. Schimpers Feststellung stand in scharfem Kontrast zur Darwinschen Lehre, nach der die Evolution der Arten einen hierarchisch gegliederten, linearen Prozess darstellt (Darwin 1859). Sie lieferte jedoch eine plausible Erklärung für bis dato unverständliche Sprünge in der Evolution wie z. B. die Entstehung der phototrophen Eukaryoten, und war die Geburtsstunde der Endosymbioseforschung. Der russische Biologe Constantin Mereschkowsky stellte dann zu Beginn des 20. Jahrhunderts die Hypothese auf, dass manche Organismen durch die intrazelluläre Vereinigung zweier verschiedener Zellarten entstanden sind (Mereschkowsky 1905, 1910). Er konstatierte, dass Plastiden gleichzusetzen sind mit reduzierten Cyanobakterien ("Chromatophoren"), die früh in der Evolution eine Symbiose mit einer heterotrophen Wirtszelle eingingen, und dass die Photoautotrophie der Pflanzen ausschließlich auf diese Endosymbionten zurückzuführen ist (Abb. 1). Mereschkowsky legte den Grundstein für die heutige Endosymbionten-Theorie, die seit ihrer Wiederbelebung durch Lynn Margulis (1970) als eine der treibenden Kräfte der eukaryotischen Evolution angesehen wird. Die heutige Evolutionsforschung fußt auf den wissenschaftlichen Errungenschaften der Molekularbiologie und den Fortschritten in der Bioinformatik. Dabei ermöglicht die Entschlüsselung der genetischen Information durch moderne Sequenzierungstechniken und ihre Analyse durch Computer-Programme ganz neue Einsichten in die Verwandtschafts-Beziehungen der Arten und Organellen.
Die heutige Endosymbionten-Theorie umfasst alle Ereignisse, welche zur Entstehung der Abteilungen der Eukaryoten geführt haben. Dabei sind durch die Vereinigung vorher selbständiger Organismen neuartige Zellen entstanden.
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Dieses Kapitel erläutert die Endosymbionten-Theorie und die Evolution eukaryotischer Algen, wobei die Bedeutung von Plastiden, komplexen Algen und der Biosynthese von Isoprenoiden als zentrale Forschungsfelder hervorgehoben wird.
2 Material und Methoden: Hier werden die verwendeten Laborgeräte, Chemikalien, molekularbiologische Standardmethoden, Techniken zur genetischen Transformation von Algen sowie die bioinformatischen Ansätze für phylogenetische Analysen detailliert beschrieben.
3 Ergebnisse: Dieser Hauptteil präsentiert die gewonnenen Daten zur Verbreitung und Evolution der untersuchten Gene der GPI und IPP-Biosynthesewege in verschiedenen Algenstämmen sowie die Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation in Phaeodactylum.
4 Diskussion: In diesem Kapitel werden die phylogenetischen Ergebnisse interpretiert, insbesondere im Hinblick auf die Endosymbiose, die Verteilung von Stoffwechselwegen und die Klassifizierung von Organismen wie Perkinsus marinus.
5 Zusammenfassung: Dieses Kapitel fasst die wesentlichen Erkenntnisse der Arbeit zusammen, insbesondere die evolutionäre Plastizität der Primärstoffwechselwege und die Bedeutung von Genduplikationen und horizontalem Gentransfer.
Schlüsselwörter
Endosymbionten-Theorie, Plastiden, Algen, Glucose-6-phosphat Isomerase, Isoprenoid-Biosynthese, MVA-Weg, MEP-Weg, Phaeodactylum tricornutum, Phylogenie, Evolution, Endosymbiose, Horizontaler Gentransfer, Alveolata, Chromista, Sequenzanalyse
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in der Arbeit grundsätzlich?
Die Dissertation untersucht die evolutionäre Geschichte und die Verbreitung zentraler Stoffwechselwege, speziell der Glucose-6-phosphat Isomerase und der Isoprenoid-Biosynthese, in verschiedenen eukaryotischen Algengruppen.
Was sind die zentralen Themenfelder?
Die zentralen Felder sind die Endosymbionten-Theorie, die evolutionäre Einordnung komplexer Algen (z.B. Diatomeen, Haptophyten) sowie die molekulare Analyse der MVA- und MEP-Biosynthesewege.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Ziel ist die Etablierung umfangreicher Gensequenz-Datensätze und deren phylogenetische Analyse, um die Verwandtschaftsbeziehungen zwischen verschiedenen eukaryotischen Abteilungen zu charakterisieren und die Evolution der Wirtszellen und Plastiden zu klären.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Die Arbeit nutzt molekularbiologische Methoden wie RT-PCR, Klonierung und genetische Transformation, kombiniert mit bioinformatischen Analysen, insbesondere Maximum Likelihood-Methoden für phylogenetische Stammbäume.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil befasst sich mit der detaillierten molekularen Identifizierung und phylogenetischen Analyse von Enzymen der GPI und IPP-Biosynthese in zahlreichen Spezies sowie mit der Untersuchung der subzellulären Protein-Lokalisation mittels eGFP-Konstrukten.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit wird durch Begriffe wie Endosymbionten-Theorie, Isoprenoid-Biosynthese, Phylogenie, Genduplikation und endosymbiotischer Gentransfer charakterisiert.
Warum ist Perkinsus marinus ein besonderes Studienobjekt in dieser Dissertation?
Perkinsus marinus dient als "Schlüsselorganismus", da die Entdeckung von Genen des plastidären MEP-Wegs in diesem Organismus ein starkes Indiz für die Existenz eines bislang unbekannten Plastiden bei diesem Austernparasiten liefert.
Welche Rolle spielt Emiliania huxleyi?
Emiliania huxleyi fungiert als wichtiges Modell für die molekulare Untersuchung der Haptophyten, wobei die Arbeit die Evolution der IPP-Biosynthese in dieser kosmopolitischen Alge im Kontext der komplexen Algen mit rotem Plastiden aufklärt.
- Quote paper
- Dr. Carina Grauvogel (Author), 2007, Die Evolution der Glucose-6-phosphat Isomerase und des cystolischen sowie plastidären Stoffwechselwegs zur Isoprenoid-Biosynthese, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/91098
