Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit ist die Taufliege D. melanogaster. Sie ist heutzutage einer der meistverwendeten Modellorganismen in der Forschung. Die Entdeckung der white-Mutation von Morgan vor etwas mehr als einem Jahrhundert weckte großes Interesse an der Fliege und ihrem Genom. Sie wurde zu einem Untersuchungsobjekt, das durch eine Reihe an Vorteilen im Vergleich zu anderen Organismen überzeugte: eine sehr kurze Generationszeit, eine große Anzahl an Nachkommen, außerdem ist sie einfach zu halten und recht kostengünstig in der Haltung. Der Lebenszyklus von Drosophila kann außerdem leicht beeinflusst werden, da dieser stark temperaturabhängig ist – bei 25 °C dauert die Generationszeit zehn bis zwölf Tage, bei 18 °C hingegen – etwa doppelt so lange. Die Larven unterscheiden sich in ihrer Morphologie erheblich von den adulten Tieren, weil die Fliege eine vollständige Metamorphose durchläuft.
Das Atemwegsepithel stellt nicht nur eine physikalische Grenze zwischen Geweben, Organen und Umwelt dar. Es erfüllt zudem komplexe metabolische und immunologische Aufgaben und spielt somit eine zentrale Rolle bei vielen Lungenerkrankungen.
Der korrekte Ablauf dieser Aufgaben ist auf eine Reihe von Signalwegen angewiesen, darunter auch der JAK/STAT-Signalweg. Seine Aktivierung kann einen Einfluss auf die Erkrankung und auch auf das Epithel selbst nehmen, indem z. B. der Signalweg die Transkription von Entzündungsgenen bewirkt. Angesichts dieser Tatsache sind JAK-Inhibitoren legitime Kandidaten für den therapeutischen Einsatz bei chronischen Entzündungskrankheiten der Lunge.
Dennoch sind diese komplexen Ablaufprozesse und deren zugrunde liegenden Mechanismen noch wenig erforscht. Vor allem die große Varietät an Komponenten des JAK/STAT-Signalweges im menschlichen Atemwegsepithel und die vielen Faktoren, die einen Einfluss darauf haben könnten, erschweren diese Aufgabe erheblich.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1.1 D. melanogaster als Modellorganismus
1.1.1 Hintergrund
1.1.2 Genetische Manipulationen von Drosophila
1.1.3 Bedeutung von D. melanogaster in der biomedizinischen Forschung
1.2 Der JAK/STAT-Signalweg
1.2.1 Der JAK/STAT-Signalweg in Drosophila
1.2.2 Einfluss des JAK/STAT-Signalweges auf epitheliale Lungenerkrankungen
1.2.2.2 Der JAK/STAT-Signalweg in Asthma
1.2.3 Einfluss von JAK-Inhibitoren auf den JAK/STAT-Signalweg
1.3 Das larvale respiratorische System in D. melanogaster
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Verbrauchsmaterial
2.1.2 Geräte
2.1.3 Puffer und Lösungen
2.1.4 Chemikalien und Nährmedien
2.1.4.1 Chemikalien
2.1.4.2 Nährmedien
2.1.4.2.1 Drosophila-Standardmedium
2.1.4.2.2 CM
2.1.4.2.3 Apfelsaftagarplatten
2.1.5 Fliegenstämme
2.1.6 Software
2.2 Methoden
2.2.1 Fliegenzucht und Kreuzungen
2.2.2 Eiablage und Screeningvorbereitung
2.2.3 Applikation der JAK-Inhibitoren
2.2.4 Fluoreszenzmikroskopie des Atemwegsepithels von L3-Larven
2.2.5 Statistische Auswertung
3 Ergebnisse
3.1 Einfluss des JAK/STAT-Signalweges auf die Morphologie des Atemwegsepithels nach geänderter Expression von upd3, hopscotch und dome mit dem ppk4-Promoter
3.1.1 Inaktivierung von dome verursacht hohe Letalität der Larven
3.1.2 Überexpression von upd3 und hopscotch in den Tracheen resultiert in der Verdickung des Atemwegsepithels
3.1.3 Eine veränderte Aktivität der JAK/STAT-Komponenten in den Tracheen führt zu einer Veränderung der Zellstruktur
3.1.4 JAK-Inhibitoren haben keinen Einfluss auf die hohe Letalität verursacht durch die dominant-negative Ausprägung in den Tracheen
3.2 Einfluss des JAK/STAT-Signalweges auf die Morphologie des Atemwegsepithels nach geänderter Expression von upd3, hopscotch und dome mit dem temperatursensitiven btl-Promoter im L2-Stadium
3.2.1 Einfluss der Komponenten des Signalweges auf den Phänotyp der Larven
3.2.2 Die im L2 aktivierte Überexpression von upd3 und hopscotch sowie das Stilllegen von dome in den Tracheen löst eine Verdickung des Atemwegsepithels aus
3.2.3 JAK-Inhibitoren haben eine positive Wirkung auf den Zuwachs des Atemwegsepithels verursacht durch hopscotch-Überexpression
4 Diskussion
4.1 Einfluss von gezielter Manipulation des JAK/STAT-Signalweges auf die Morphologie des Atemwegsepithels
4.1.1 Manipulation während der Embryonalentwicklung
4.1.2 Manipulation im L2-Stadium
4.2 Auswirkung von JAK-Inhibitoren auf die Atemwegsmorphologie
4.3 Ausblick
Zielsetzung & Themen
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss des JAK/STAT-Signalweges auf die Morphologie des Atemwegsepithels in Drosophila melanogaster. Im Zentrum steht die Forschungsfrage, wie die gezielte genetische Manipulation spezifischer Signalweg-Komponenten (upd3, hopscotch, dome) sowie die pharmakologische Hemmung durch JAK-Inhibitoren die Struktur der Tracheen verändern.
- Genetische Manipulation des JAK/STAT-Signalweges in Drosophila-Tracheen.
- Analyse morphologischer Veränderungen des Atemwegsepithels (z.B. Verdickung).
- Untersuchung der Auswirkungen des Zeitpunkts der Genaktivierung (Embryonalentwicklung vs. L2-Stadium).
- Evaluierung der Wirkung verschiedener JAK-Inhibitoren auf die Atemwegsmorphologie und Vitalität.
- Vergleich der konservierten Signalwege in Drosophila mit menschlichen Lungenerkrankungen wie Asthma und COPD.
Auszug aus dem Buch
1.2.2.1 Der JAK/STAT-Signalweg in COPD
Etwa 10 % der Erwachsenen über 40 Jahren sind von COPD betroffen. Als Risikofaktor steht an erster Stelle das Rauchen, aber auch andere Einflüsse, wie Umweltverschmutzungen und genetische Einlagerungen, sind nicht zu unterschätzen (Bossé, 2012). Die Erkrankung zeichnet sich in erster Linie durch eine chronische Bronchitis und das Auftreten eines Lungenemphysems aus. Beide Symptome führen zu einer irreversiblen und fortschreitenden Funktionseinschränkung der Atemwege. Es entsteht eine chronische Entzündung, wodurch Entzündungsmediatoren und -enzyme produziert werden, die das Lungengewebe zerstören. Die Krankheit bringt einige Umbauprozesse in den Atemwegen mit sich („Remodeling“). Dazu zählen Hyperplasie der Epithelzellen und glatten Muskulatur sowie die Verdickung der Basalmembran, was schließlich zu der für COPD-Patienten typischen Verengung der Atemwege führt (Wang et al., 2018).
Laut Metaanalysen ist eine Reihe an Genen – darunter auch Zytokine – an der Entstehung dieser Krankheit beteiligt, die Regulatoren für COPD aktivierte Prozesse darstellen (Bossé, 2012). Sie sind bei erkrankten Menschen in erhöhter Anzahl nachzuweisen. Viele davon machen sich verschiedene Signalwege zunutze oder werden mithilfe von diesen produziert (Nakamura & Aoshiba, 2017; Chunk, 2001).
Reize, wie Zigarettenrauch, aktivieren das Sezernieren von mehreren Zytokinen durch die Epithelzellen und die Makrophagen. Solche Zytokine sind die Wachstumsfaktoren TGF-β (Transforming Growth Factor-beta) und FGFs (Fibroblast Growth Factor-beta), die zur Verdickung des Gewebes in den kleinen Bronchialästen führen. Dazu zählen aber auch Lymphokine und T-Zellen-Regulatoren sowie die entzündungsfördernden Zytokine TNF-α (Tumor Necrosis Factor-alpha), IL-1β und IL-6 (Barnes, 2008).
Zusammenfassung der Kapitel
1 Einleitung: Diese Einleitung führt in das Modellsystem Drosophila melanogaster und den konservierten JAK/STAT-Signalweg ein, wobei dessen Bedeutung für die Lungenforschung hervorgehoben wird.
2 Material und Methoden: Dieser Abschnitt beschreibt detailliert die verwendeten Materialien, Fliegenstämme, Zuchtbedingungen, mikroskopischen Techniken sowie die eingesetzten JAK-Inhibitoren und statistischen Auswertungsmethoden.
3 Ergebnisse: Die Ergebnisse präsentieren die morphologischen Konsequenzen der spezifischen Genmanipulationen und der pharmakologischen Hemmung auf das Tracheen-Epithel sowie deren Auswirkung auf die Letalität der Larven.
4 Diskussion: Die Diskussion interpretiert die erhobenen Daten im Kontext bestehender Literatur und erörtert die Rolle des JAK/STAT-Signalweges bei Entwicklungsprozessen und Immunantworten sowie das Potenzial von JAK-Inhibitoren als Therapeutika.
Schlüsselwörter
Drosophila melanogaster, JAK/STAT-Signalweg, Atemwegsepithel, Tracheensystem, genetische Manipulation, upd3, hopscotch, dome, JAK-Inhibitoren, COPD, Asthma, Zellproliferation, Immunantwort, Modellorganismus, Lungenerkrankungen.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Bachelorarbeit grundsätzlich?
Die Arbeit untersucht den Einfluss des JAK/STAT-Signalweges auf die Morphologie des Atemwegsepithels bei der Taufliege Drosophila melanogaster und evaluiert, inwieweit dieser Signalweg als Modell für menschliche Lungenerkrankungen dienen kann.
Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?
Die zentralen Felder umfassen die genetische Steuerung des Atemwegswachstums, die Auswirkungen von Entzündungssignalen auf das Epithel und die pharmakologische Beeinflussung des JAK/STAT-Weges durch verschiedene Inhibitoren.
Was ist das primäre Ziel der Arbeit?
Das primäre Ziel ist es, durch gezielte Manipulation von Signalweg-Komponenten und den Einsatz von Inhibitoren die Zusammenhänge zwischen JAK/STAT-Aktivität und morphologischen Veränderungen des Atemwegsepithels aufzudecken.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Es werden genetische Werkzeuge (UAS/Gal4-System, TARGET-System), Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung des Epithels, morphometrische Auswertungen (Epitheldicke, Zellkernanalyse) und Screeningverfahren mit JAK-Inhibitoren verwendet.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die experimentellen Ergebnisse zu konstitutiven Mutationen, die Analysen zu zeitabhängigen Aktivierungen im L2-Stadium sowie die Untersuchung der Wirksamkeit diverser JAK-Inhibitoren auf die Tracheenmorphologie.
Welche Schlüsselbegriffe charakterisieren die Forschung?
Wesentliche Begriffe sind Drosophila melanogaster, JAK/STAT-Signalweg, Atemwegsepithel, Zellproliferation und JAK-Inhibitoren.
Welche Auswirkung hat die Deaktivierung des Rezeptors dome?
Die Inaktivierung von dome führt zu einer hohen Letalität der Larven, stark deformierten Tracheen sowie einem deutlich dünneren Atemwegsepithel im Vergleich zum Wildtyp.
Können JAK-Inhibitoren die durch dome-Mutation verursachte Letalität beheben?
Nein, in den durchgeführten Versuchen zeigten die eingesetzten JAK-Inhibitoren keinen signifikanten Rescue-Effekt auf die Letalität der Larven mit der dominant-negativen dome-Ausprägung.
Wie unterscheidet sich die Wirkung der Inhibitoren bei verschiedenen Fliegenlinien?
Während die Inhibitoren bei Kontrolltieren zu einer leichten Verdickung führten, bewirkten sie bei Linien mit hopscotch-Überexpression tendenziell eine Reduktion der Epitheldicke, wobei die Effektivität zwischen den verschiedenen Inhibitoren variierte.
- Arbeit zitieren
- Jonatan Krüger (Autor:in), 2018, Der Einfluss einer gezielten Manipulation des JAK/STAT-Signalweges auf die Morphologie des Atemwegsepithels in Drosophila melanogaster, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/937055
