Klonierung eines genomischen DNA-Fragments mit für Lamin C codierenden Sequenzen

INHALTSVERZEICHNIS

1. Einleitung

2. Material
2.1 Chemikalien
2.2 Vektoren und Bakterienstämme
2.2.1 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] -Phage EMBL3 und E.coli -Stamm P2392
2.2.2 Plasmidvektor Bluescript und E.coli K12-Stamm DH5a
2.3 Zusammensetzung häufig verwendeter Puffer und Medien
2.4 Partiell verdaute DNA von EAT-Zellen
2.5 Lamin C-cDNA-Sonden

3. Methoden
3.1 Konstruktion einer genomischen Sequenzbank
3.1.1 Ligation von EAT-DNA-Fragmenten mit EMBL3 Phagenarmen
3.1.2 In vitro -Verpackung von rekombinierter Phagen-DNA
3.1.3 Präparation von E. coli -Zellen für die Infektion mit l-Phagen
3.1.4 Infektion von E. coli -Zellen mit l-Phagen
3.1.5 Konzentrationsbestimmung von l-Phagen in Suspension
3.1.6 Amplifikation der Stammsequenzbank
3.2 Identifizierung von rekombinierten l- Phagen
3.2.1 Herstellen von Replikas
3.2.2 Radioaktive Markierung von Lamin C-cDNA mit [a-32P]dCTP
3.2.3 TCA-Präzipitation
3.2.4 Hybridisierung der Nylonmembranblots
3.2.5 Autoradiographie
3.2.6 Anreicherung, Selektion und Amplifikation von vereinzelten l-Phagenklonen
3.3 Umklonieren von genomischen DNA-Fragmenten aus dem EMBL3-Phagen in den Bluescriptvektor
3.3.1 DNA-Isolierung aus l-Phagen
3.3.2 DNA-Konzentrationsbestimmung
3.3.3 Restriktionsendonukleaseverdau
3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese
3.3.5 Southernblot
3.3.6 Gewinnung der genomischen DNA-Fragmente aus dem EMBL3-Phagenklon
3.3.7 Präparation des Bluescriptvektors für die Ligation
3.3.8 Ligation in den Bluescriptvektor
3.3.9 Herstellung von transformationskompetenten E. coli -Zellen
3.3.10 Transformation von E.coli mit rekombinierten Bluescriptvektoren
3.3.11 Isolierung von Plasmid-DNA

4. Ergebnisse
4.1 Nachweis der Lokalisation des Lamin C-Gens zwischen zwei genomischen Eco RI-Schnittstellen
4.2 Etablierung einer repräsentativen genomischen Sequenzbank
4.3 Identifizierung eines rekombinanten Klons Embl3gLCM
4.4 Identifizierung des Genfragments mit für Lamin C codierenden Sequenzen auf dem Phagenklon Embl3gLCM
4.5 Umklonierung des Eco RI-Sal I -Fragments in den Bluescriptvektor
4.6 Umklonierung des Eco RI-Eco RI -Fragments in den Bluesciptvektor

5. Diskussion

6. Zusammenfassung

7. Literaturverzeichnis

8. Lebenslauf

1. Einleitung

Die Desoxyribonukleinsäure (DNA) zählt als Träger der Erbinformation zweifellos zu des wichtigsten Molekülen des Lebens. Erst 1944 konnte durch Avery (Avery et al. 1944) mit Hilfe von Transformationsexperimenten an Pneumokokken der Nachweis erbracht werden, daß die DNA das biochemische Korrelat der Erbanlagen ist - lange nachdem die klassische Genetik mit den nach Gregor Mendel benannten Vererbungsgesetzen eingeleitet worden war. Obwohl Mendel seine Arbeit Versuche über Pflanzenhybriden der Öffentlichkeit schon 1865 vortrug, wurden die heute weithin bekannten Mendelschen Gesetze erst nach über dreißigjähriger Vergessenheit von drei Botanikern (Correns, Tschermak und de Vries) wiederentdeckt und von der wissenschaftlichen Welt als Richtlinie für weiteres Arbeiten anerkannt (zur Übersicht Watson et al. 1985). Von da an war es noch ein weiter Weg zu Averys Transformationsexperiment und zur Strukturaufklärung der DNA durch Watson und Crick im Jahre 1953 (Watson und Crick 1953). Während der letzten 20 Jahre erlebte die Molekulargenetik einen weiteren Aufschwung. Durch die Entwicklung neuer Methoden, entscheidend waren insbesondere die Entdeckung und Anwendung von Restriktionsendonukleasen, wurden die technischen Voraussetzungen zur künstlichen Rekombination bzw. zum genetic engineering geschaffen. Mit Hilfe dieser Methoden, die bereits in vielen biologischen, medizinischen und biochemischen Laboratorien routinemäßig ihre Anwendung finden, konnten neue Forschungsbereiche gefunden werden, aber auch bereits etablierte Bereiche biomedizinischer Forschung erweitert werden.

In der vorliegenden Arbeit soll mit modernen molekularbiologischen Methoden ein Beitrag zur Erforschung einer im Bereich der Kernhülle lokalisierten Proteingruppe, der sog. Lamine, geleistet werden. Die genomische DNA des Eukaryonten ist während der Interphase im Zellkern organisiert. In dieser Steuerzentrale sind genetische Vorgänge der Zelle lokalisiert (Abb. 1), wie die DNA-Replikation, die RNA-Synthese (Transkription) und die Bearbeitung der RNA (RNA- processing). Erst die reife mRNA gelangt an die zytoplasmatischen Ribosomen, dem Ort, an dem der Triplett-Code der Nukleinsäure in die Aminosäuresequenz eines Proteins übersetzt wird (Translation), das als Strukturprotein, Enzym, Hormon, Antikörper o. ä. für die Funktion lebender Systeme notwendig ist. Beim Prokaryonten findet keine räumliche und zeitliche Trennung von Transkription und Translation statt, man findet auch nicht das für Eukaryonten typische RNA-Spleißen. Während der Reifung eukaryotischer mRNA werden aus dem Primärtranskript der meisten Gene ein oder mehrere nicht codierende Abschnitte, sog. Introns, herausgeschnitten. Die verbleibenden codierenden Exons werden verknüpft, bevor die reife mRNA translatiert wird. Diese Mosaikstruktur aus Exons und Introns bzw. das Spleißen der RNA findet sich bis auf wenige Ausnahmen bei allen eukaryotischen, proteincodierenden Genen mit mehr als 550 Nukleotidpaaren (zur Übersicht Watson et al. 1985).
Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Kernhülle bildet beim Eukaryonten als komplexes Membransystem sozusagen eine funktionelle Grenze zwischen dem nukleären Transkriptionsapparat und den zytoplasmatischen Translationsereignissen (Franke 1974).

Als Hauptkomponenten der Kernhülle lassen sich differenzieren (Abbildung 2 und 3):

1. Die perinukleäre Zisterne, die von der inneren und der äußeren Kernmembran umschlossen wird.
2. Die Porenkomplexe, die den Kern mit dem Zytoplasma verbinden und
3. Die Kernlamina, die zwischen innerer Kernmembran und den peripheren Chromatingranula liegt (Franke et al. 1981).

Isolierte Kernhüllen von Rattenhepatozyten (Aaronson und Blobel 1975) zeigen nach einer Auftrennung durch Proteingelelektrophorese ein typisches Muster an Polypeptidbanden, wobei drei Hauptkomponenten erkennbar sind, deren Molekulargewicht jeweils zwischen 60.000 und 70.000 Dalton liegt. Zusammen entsprechen diese einem Viertel der in der Fraktion enthaltenen Gesamtproteine. Diese drei Hauptkomponenten konnten nach Extraktion isolierter Kernhüllen in Pufferlösungen hoher Ionenstärke in Anwesenheit nichtionischer Detergentien auf über 80% des Gesamtproteins der Fraktion angereichert werden (Aaronson und Blobel 1975).

Die elektronenmikroskopische Untersuchung dieser Fraktion zeigt Porenkomplexe, die durch eine filamentäre Struktur verbunden sind, die als Kernlamina bezeichnet wurde (Aaronson und Blobel 1975; Scheer et al. 1976). Die Resistenz und strukturelle Stabilität der Porenkomplex-Lamina-Fraktion gegenüber den erwähnten Extraktionsmethoden führte zur Einordnung in die Gruppe der Kernskelettstrukturen (Franke et al. 1981; Benavente et al. 1984; Rest et al. 1987; Werner et al. 1988).

Mit monoklonalen Antikörpern und Techniken der Immunlokalisation konnte nachgewiesen werden, daß das dominierende Proteintriplett der Porenkomplex-Lamina-Fraktion ausschließlich in der Kernperipherie lokalisiert ist (Ely et al. 1978; Gerace et al. 1978; Krohne et al. 1978). Daraus leitet sich die heute übliche Bezeichnung "Kernlamine" bzw. "Lamine" für diese Proteine ab (Gerace u. Blobel, 1980).

Vergleichende Untersuchungen über die Proteinzusammensezung der Kernlamina zeigten bei verschiedenen Spezies, daß nicht in jedem Fall wie für Rattenhepatozyten beschrieben, die Lamina aus einem Triplett von Laminen besteht, diese aber sowohl bei Vertebraten als auch bei Invertebraten gefunden werden und sich in ihrem Molekulargewicht zwischen 60.000 und 80.000 Dalton kaum unterscheiden (Dwyer und Blobel 1976). Je nach wissenschaftlicher Arbeitsgruppe und zellbiologischer Fragestellung werden heute sehr verschiedene Tiersysteme bevorzugt, u. a. die Muschel Spisula solidissima (Dessev und Goldman 1988;

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Dessev et al. 1989), die Taufliege Drosophila melanogaster (Smith und Fisher 1989; Frasch et al. 1988), der Zitteraal Torpedo marmorata (Cartaud et al. 1989), der Krallenfrosch Xenopus laevis (Hoger et al. 1988), das Huhn (Vorburger et al.1989) und selbst der Hefepilz Saccharomyces cerevisiae (Georgatos et al. 1989).

Die Kernlamina somatischer Zellen des Menschen und anderer Mammalia wie z. B. bei der Maus und der Ratte aber auch bei den Vögeln ist in aller Regel aus drei Laminen A, B und C aufgebaut, die meist in äquimolaren Mengen auftreten (Gerace und Blobel 1980). Es gibt jedoch zelltypspezifische Unterschiede, insbesondere im experimentellen Ehrlich-Ascites-Tumor der Maus, in dem Lamin A höchstens in sehr geringen Mengen exprimiert wird (Müller et al. 1983; Werner et al.1986; Bludau et al. 1986). Da Lamin C weitgehend identisch ist mit der aminoterminalen Sequenz des Lamin A (McKeon et al. 1986; Fisher 1986), wird Lamin C möglicherweise Lamin A ersetzen können, um in einigen Zellen eine funktionelle Kernhülle zu konstituieren. Diese Annahme wird auch dadurch gestützt, daß die Lamine A und C einen gemeinsamen isoelektrischen Punkt im Neutralbereich besitzen, während Lamin B mit einem isoelektrischen Punkt von 5,6 zu den sauren Laminen gehört.

Kreuzreagierende Antikörper gegen Lamine zahlreicher Tierspezies einschließlich der Amphibien und der Insekten deuten auf im Verlauf der Evolution hochkonservierte Domänen in der Aminosäuresequenz dieser Proteinfamilie hin (Bludau et al. 1986; Krohne et al. 1984).

Mittlerwiele werden die Lamine auch zu den Intermediärfilamenten (IF) gerechnet. Die Molekularbiologie unterscheidet heute mindestens fünf Gruppen von Intermediärfilamenten, die in verschiedenen Zelltypen exprimiert werden (Steinert und Roop 1988, Steinert und Liem 1990): Typ I und II Keratine finden sich in epithelialen Zellen; zum Typ III der Intermediärfilamente zählen Vimentin, Desmin, GFAP (glial fibrillary acidic protein) und Peripherin; Typ IV besteht aus neuronalen Intermediärfilamenten bzw. Neurofilamenten und Typ V schließlich repräsentiert die Kernlamine, die sich nicht nur durch ihre Lokalisation deutlich von allen anderen Intermediärfilamenten unterscheiden. In jüngster Zeit wurde Nestin, ein neuartiges Intermediärfilament vom Typ VI beschrieben (Lendahl et al. 1990), das eine Rolle im sich entwickeltnden Nervensystem spielen soll und insgesamt wenig Homologien zu den bisher bekannten IF aufweist.

Es wird angenommen, daß sich die cytoplasmatischen IF (Typ I-IVund VI) phylogenetisch von einem gemeinsamen laminartigen Vorläufer weiter entfernt haben als die Lamine selbst. Diese hohe Konservierung des Typ V der IF im Verlauf der Evolution macht die Bedeutung der Lamine für die Zelle bzw. für die strukturelle Organisation des Interphasenukleus deutlich.

Ungeachtet dieser Bedeutung blieben die Lamine bezüglich ihrer Nukleotidsequenz nur unzureichend untersucht. Die cDNA, die von Säugerlaminen kloniert und sequenziert worden war, begrenzte sich bis vor kurzem auf menschliches Lamin A und C (McKeon et al. 1986; Fisher et al.1986) sowie auf Lamin B von der Maus (Hoeger et al. 1988).

Einen ersten Intraspeziesvergleich zwischen Laminen vom A/C-Typ und vom B-Typ erfolgte 1989 (Riedel und Werner 1989). Zwischen Lamin C und B bei der Maus konnte eine 62%ige Homologie auf der Nukleotidebene gefunden werden. Obwohl dies nur einer 55%igen Homologie der Aminosäuresequenz entspricht, gibt es signifikante Bereiche mit großer Homologie, die auf die enge Verwandschaft zwischen den verschiedenen Vertretern dieser Proteinfamilie hindeuten und wahrscheinlich gemeinsame Epitope für kreuzreagierende Antikörper reflektieren (Bludau et al. 1986; Krohne et al. 1984).

Auch wenn sich der Schwerpunkt der Laminforschung eindeutig der biologischen Grundlagenforschung zuordnen läßt, gibt es doch einige medizinische Aspekte zu seltenen Autoimmunkranktheiten des Menschen. 1983 wurde eine 24-jährige Patientien beschrieben (McKeon et al. 1983), die an einer äußerst seltenen linearen Sklerodermie (Fitzpatrick und Bernhard 1987) erkrankt war. Klinisch auffällig waren die umschriebenen linearen, sklerotischen Läsionen der Haut an Arm und Körper, ohne Anzeichen auf eine systemische Erkrankung. Aus dem Serum dieser Patientin konnten Antikörper gegen die Lamine A und C isoliert werden, die sogar gegen Lamine von Drosophila melanogaster reagierten (McKeon et al. 1983), was für hochkonservierte Erkennungsdomänen der betreffenden Antikörper spricht. Da drei unterschiedliche H-Ketten von IgG nachweisbar waren, mußten diese Antikörper von verschidenen B-Zellklonen stammen (McKeon et al. 1983).

Mittlerweile wurden Anti-Lamin-Antikörper in einer Reihe von Patientenseren mit Autoimmunkrankheiten gefunden, insbesondere bei systemischen Lupus erythematodes (SLE) (Lassoued et al. 1988; Reeves und Ali 1989) und der aktiven lupoiden Hepatitis (Wesierska-Gadek et al. 1988; Wesierska-Gadek et al. 1989). Anti-Lamin-Antikörper wurden als mögliche Marker für ungewöhnliche Autoimmunkrkankheiten diskutiert (Lassoued et al. 1988). Häufig reagierten die Antikörper nur mit Lamin A/C und weniger mit Lamin B oder Lamin A/B/C (Wesierska-Gadek et al. 1989).

Nach ihrer Synthese sind die Lamine unterschiedlichen posttranslationalen Modifikationen unterworfen (vgl. Abbildung 1), welche ihre Eigenschaften verändern können. Es konnten neben Phosphorylierung (Gerace und Blobel 1980; Ottaviano und Gerace 1985; Miake-Lye und Kirschner 1985) und Methylierung (Chelsky et al. 1987, 1989) auch Isoprenylierung (Beck et al 1988; Wolda und Glomset 1988) und Glykosylierung (Ferraro et al. 1989) der Lamine nachgewiesen werden.

Um zu prüfen, ob die Lamine gleichzeitig mit DNA synthetisiert würden, untersuchten verschiedene Arbeitsgruppen (Gerace et al. 1984; Bludau et al. 1986; Lu et al. 1988) die zellzyklusspezifische Expression dieser Proteine. Während bei CHO-Zellen die Biosynthese von Laminen, die mit Pulsmarkierung und Gelelektrophorese untersucht wurde, im Zellzyklus konstant bleibt (Gerace et al. 1984), wurde mit Hilfe von aus elutriierten EAT-Zellen gewonnener mRNA der Nachweis für eine vorwiegend S-phasenspezifische Expression der Lamine erbracht (Bludau et al. 1986). Die unterschiedlichen Methoden zur Synchronisation der Zellen in Zellzyklusphasen führte offenbar zu widersprüchlichen Ergebnissen (Gerace et al. 1984; Bludau et al. 1986). Die Ergebnisse der Immunpräzipitation (Bludau et al. 1986), die eine S-phasenspezifische Expression zeigen, konnten jedoch bestätigt werden (Lu et al. 1988) durch Hybridisierung zellzyklusphasenspezifischer cDNA-Banken und Northernblotanalyse von EAT-Zellen, die mittels zentrifugaler Elutriation physikalisch in die G1-, S- und G2/M-Phase des Zellzyklus getrennt wurden.

Betrachtet man die dargelegten Erkenntnisse über die Proteinfamilie der Lamine, so ergeben sich mehrere Forschungsschwerpunkte: elektronenmikroskopische, zellbiologische und immunologische Techniken dienen der Untersuchung der Morphologie der Kernlamina, der Lokalisation und Proteincharakterisierung der Lamine. Experimente auf Ebene der mRNA bzw. der daraus hergestellten cDNA führen zu Aussagen über die Genexpression.

Über die Organisation der Lamine auf genomischer Ebene ist jedoch bisher nichts bekannt. Zu vermuten war jedoch, daß die Lamingene als Multigenfamilie benachbart auf dem Genom angeordnet sind.

Problemstellung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Forschungsansatz geschaffen werden, die genomische Organisation der Kernlamine näher untersuchen zu können, d. h. Voraussetzungen zu schaffen, um Lamingene bzw. für Lamine codierende DNA-Sequenzen insbesondere die des Lamin C-Gens zu finden.

Das Vorgehen läßt sich in folgende Problemkreise gliedern:

1. Herstellen einer repräsentativen genomischen Sequenzbank in l-Phagen. Als genetisches Material wurde die DNA von Ehrlich-Ascites-Tumor-Zellen der Maus (Zellinie HD 34) verwendet, da diese Zellinie einerseits ein gut untersuchtes Tumorsystem für zellbiologische Untersuchungen darstellt (Granzow et al. 1980; Granzow und Nielsén 1984), andererseits aber bekannt war, daß die Lamine B und C in sicher nachweisbaren Mengen exprimiert werden, während Lamin A nur schwer nachweisbar ist (Werner et al. 1984; Bludau et al. 1986; Lu et al. 1988). Die Qualität dieser Sequenzbank sollte so gut sein, daß sie auf unbegrenzte Zeit für weitere molekulargenetische Fragestellungen zur Verfügung stünde.
2. Als zentrale Aufgabe galt es, aus der zu konstruierenden genomischen Sequenzbank einen Phagenklon mit für Lamin C codierenden Sequenzen zu identifizieren und zu isolieren. Hierzu sollte humane Lamin C-cDNA als Sonde radioaktiv markiert werden, um aus einem Genomäquivalent von 1x1010 Basenpaaren ein im l-Phagen insertiertes DNA-Fragment von höchstens 2x104 Basenpaaren Länge zu finden.
3. Schließlich sollte versucht werden, den Bereich codierender Sequenzen weiter einzuengen, evtl. über Umklonierungen von Teilen eines positiven Phagenklons in geeignete Plasmidvektoren.

2. Material

2.1 Chemikalien

AGFA, Leverkusen

Entwickler (G 153) und Fixierer (G 353) für die AGFA-

Röntgenfilmentwicklungsmaschine

Amersham-Buchler, Braunschweig

[a-32P]dCTP (Triethylamrnoniumsalz, 111 TBq/mmol, 370 MBq/ml),

Nylonfilter Hybond-N (132 mm Durchmesser)

Biolab, Schwalbach

T4-DNA-Ligase

Biomol, Ilvesheim

IPTG, X-GAL

Bio-Rad, München

low melting point -Agarose

Boehringer, Mannheim

Restriktionsendonukleasen: Eco RI, Sac I, Bam HI

Alkalische Phosphatase aus Kälberdarm

BSA für Molekularoiologie

Inkubationspuffer für Restriktionsendonukleasen

Calbiochemie, Frankfurt

DTT, Spermidin

Difco-Laboratories, Detroit, USA

Hefe-Extrakt, Bacto-Trypton, Agar

Dr. Goos, Heidelberg

Verstärkerfolien für Röntgenfilm

Kodac, Rochester, USA

X-Omat AR Röntgenfilm, LX 24 Entwickler und AL 4 Fixierer für Röntgenfilm

Mast Diagnostica, Hamburg

SeaKem Me Agarose

Medac, Hamburg

Restriktionsendonuklease EcoRI

NEN, Dreieich

Nylonfilter Gene-Screen und Gene-Screen Plus,

[a-32P]dCTP (111 TBq/mmol, 370 MBq/ml, Triethylammoniumsalz)

Pharmacia-LKB, Freiburg

Restriktionsendonukleasen: Sal I, BamHI

Oligoabeling-Kit

Polaroid, Cambridge, USA

Polaroid-Schlwarzweißfilm Typ 677

Promega, Madison, USA

l-SORB (Phage Adsorbent)

Schleicher , Schuell, Dassel

GB-3 Blotting-Papier

Serva, Heidelberg

Ethidiumbromid

Sigma, München

Ampicillin Na-Salz

Stratagene, San Diego, USA

EMBL3-Cloning Kit

Whatman Ltd., Maidstone, England

Whatman 3MM, GF/C Glasfilter

Alle anderen nicht angegebenen, oft verwendeten Chemikalien wurden von den

Firmen Serva, Merck, Roth und Fluka in pro analysi -Qualität bezogen.

2.2 Vektoren und Bakterienstämme

2.2.1 [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] -Phage EMBL 3 und E. coli -Stamm P2392

EMBL 3, ein Derivat des l-Vektors l1059, nimmt DNA-Fragmente auf mit einer Länge zwischen 9 und 23 kb. Voraussetzung sind BamH1 -kompatible Enden (Sau 3A, Mbo I, Bgl II oder Bam HI). Die Insertionen können über Sal I -Verdau gewonnen werden. (Abbildungen 4 und 9).

Das EMBL 3-System macht sich die Vorteile der spi -Selektion zunutze. Nicht-rekombinierte EMBL 3-Phagen können nicht auf E.coli -Wirten wachsen, die ein sog. P2-Lysogen darstellen. Verantwortlich fur die Ausbildung dieses Phänotyps, der als spi (sensitive to P2 interference) bezeichnet wird, sind die Produkte der Gene red (exo und bet) und gam. EMBL3 Rekombinanten, denen das Stuffer-Fragment und damit die beiden Gene fehlen, weisen den Phänotyp spi auf und wachsen normal auf P2-Lysogenen.

Der E.coli -Stamm P2392 eignet sich daher besonders zur Transfektion mit EMBL3-Phagen. Denn man erhält ohne störenden Background Phagenplaques nur von rekombinierten Phagen.

Der Genonotyp von E. coli P2392:

hsdR514 (rk-, mk+), supE44, supF58, lacY1 or d (lacIZY), galK2, gaT22, met81, trpR55, (P2)

2.2.2 Plasmidvektor Bluescript und E.coli K12-Stamm DH5 a

Der Bluescript-Vektor ist ein 3,0 kb langes Plasmid mit einem Ampicillin-Resistenzgen (Abbildungen 5, 14 und 19). Führt man den Bluescriptvektor in ampicillinempfindliche Wirtszellen ein, läßt sich die Anwesenheit des Plasmids durch Wachstum der transformierten Bakterien auf ampicillinhaltigen Nährböden erkennen.

Für die Unterscheidung zwischen Rekombinanten und Nichtrekombinanten enthält der Bluescriptvektor einen Anteil des lacZ -Gens. In geeigneten E.coli -Zellen, z. B. DH5a, komplementiert das lacZ -Fragment aus Bluescript die deletierte lacZ -Region der Wirtszelle, so daß die b-Galaktosidase, für die lacZ codiert, exprimiert werden kann.

In Gegenwart von IPTG, einem potenten Induktor, der nicht gleichzeitig Substrat ist, wird das lacZ -Gen ohne Substrathemmung transkribiert. Das induzierte Genprodukt, die b-Galaktosidase, läßt sich durch ein nicht-induzierendes Substratanalogon nachweisen. Das farblose X-Gal wird durch die b-Galaktosidase zu 5-Brom-4-chlorindoxyl hydrolysiert, das an der Luft zum blauen 5,5'-Dibrom-4,4'-dichlorindigo oxidiert.

Blaue Bakterienkolonien enthalten demzufolge den Bluescriptvektor mit nicht unterbrochenem lacZ -Fragment.

Bei der Konstruktion des Vektors hat man in die lacZ -Region einen Polylinker mit 21 jeweils einmaligen Restriktionsstellen und den begrenzenden Promotersequenzen eingebaut, ohne

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Verlust der beschriebenen Galaktosidase-Induktion. Erst durch Insertion von Fremd-DNA in eine der Klonierungsstellen des Vektors, wird das lacZ -Fragment derart verändert, daß die Wirtszelle keine b-Galaktosidase mehr exprimieren kann und die mit rekombiniertem Plasmid transformierten Zellen weiße Kolonien bilden.

DH5a-Zellen (BRL, Karlsruhe) eignen sich aufgrund des deletierten lacZ -Gens zum Test, ob eine erfolgreiche Transformation auch mit dem rekombinien Bluescriptplasmid stattgefunden hat. Transformationskompetente Zellen wurden nach der Methode von Hanahan (Hanahan 1985) hergestellt.

2.3 Zusammensetzunghäufig verwendeter Puffer und Medien

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.4 Partiell verdaute DNA von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen

Ausgangsmaterial für die zu konstruierende Seqeunzbank war die DNA von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen (EAT) der Maus (Granzow et al. 1980), da diese Zellen in der Abteilung bereits gut untersucht waren. Für die Isolierung von DNA wurden im Tierlabor des Instituts 5x106 EAT-Zellen in NMRI-Mäuse intraperitoneal verimpft. Nach 6 Tagen wurden die Tiere getötet und der freie Ascites-Tumor aus der Bauchhöhle entnommen. Mit Hilfe der detaillierten Arbeitsanweisung von Gross-Bellard (Gross-Bellard et al. 1973) zur Isolation von eukaryotischer DNA wurde die DNA der EAT-Zellen gewonnen.

Die EAT-DNA war bereits mit den Restriktionsendonuklesasen Bam HI und Sau 3A partiell verdaut, d. h. nicht vollständig, sondern nur soweit, daß möglichst viele, etwa 20 kb lange Fragmente entstanden waren, was elektrophoretisch nachgewiesen wurde.

Damit das gesamte Genom möglichst vollständig in Fragmenten dieser Größenordnung für die zu konstruierende Sequenzbank repräsentiert würde, war es sinnvoll, die beiden Restriktionsendonukleasen Bam HI und Sau 3A zu wählen. Bam HI erkennnt die Hexanukleotidsequenz G/GATCC, während Sau 3A die statistisch häufigere Tetranukleotidsequenz /GATC (Winnacker 1985). Gemäß einer Konvention sind diese Sequenzen immer von links nach rechts in 5'-3' Richtung geschrieben. Die Schreibweise /GATC steht dementsprechend für die Sequenz 5'-GATC-3', wobei der Schrägstrich die Schnittstelle kennzeichnet.

Man erkennt, daß die Vierersequenz in der Sechsersequenz derart enthalten ist, daß sie überlappende Enden bilden. Ein Verdau allein mit Bam HI würde wegen der statistisch selteneren Sechsersequenz u.U. zu große Fragmente liefern, ein kompletter Verdau mit Sau 3A zu kleine.

[...]