Die Desoxyribonukleinsäure (DNA) zählt als Träger der Erbinformation zweifellos zu des wichtigsten Molekülen des Lebens. Erst 1944 konnte durch Avery (Avery et al. 1944) mit Hilfe von Transformationsexperimenten an Pneumokokken der Nachweis erbracht werden, daß die DNA das biochemische Korrelat der Erbanlagen ist - lange nachdem die klassische Genetik mit den nach Gregor Mendel benannten Vererbungsgesetzen eingeleitet worden war. Obwohl Mendel seine Arbeit Versuche über Pflanzenhybriden der Öffentlichkeit schon 1865 vortrug, wurden die heute weithin bekannten Mendelschen Gesetze erst nach über dreißigjähriger Vergessenheit von drei Botanikern (Correns, Tschermak und de Vries) wiederentdeckt und von der wissenschaftlichen Welt als Richtlinie für weiteres Arbeiten anerkannt (zur Übersicht Watson et al. 1985). Von da an war es noch ein weiter Weg zu Averys Transformationsexperiment und zur Strukturaufklärung der DNA durch Watson und Crick im Jahre 1953 (Watson und Crick 1953). Während der letzten 20 Jahre erlebte die Molekulargenetik einen weiteren Aufschwung. Durch die Entwicklung neuer Methoden, entscheidend waren insbesondere die Entdeckung und Anwendung von Restriktionsendonukleasen, wurden die technischen Voraussetzungen zur künstlichen Rekombination bzw. zum genetic engineering geschaffen. Mit Hilfe dieser Methoden, die bereits in vielen biologischen, medizinischen und biochemischen Laboratorien routinemäßig ihre Anwendung finden, konnten neue Forschungsbereiche gefunden werden, aber auch bereits etablierte Bereiche biomedizinischer Forschung erweitert werden. [...]
Aus der Zusammenfassung von 1990: "Trotz der ständig wachsenden Kenntnisse über die im Laufe der Evolution hochkonservierte Proteinfamilie der Kernlamine, ist über ihre Organisation auf genomischer Ebene nichts bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Voraussetzungen geschaffen, um Lamingene bzw. für Lamine codierende Sequenzen - insbesondere des Lamin C-Gens - zu finden und damit möglicherweise ein Beitrag dazu geleistet, die genomischen Organisation der Lamingene in Zukunft aufzuklären."
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
2. Material
2.1 Chemikalien
2.2 Vektoren und Bakterienstämme
2.2.1 λ−Phage EMBL3 und E.coli-Stamm P2392
2.2.2 Plasmidvektor Bluescript und E.coli K12-Stamm DH5α
2.3 Zusammensetzung häufig verwendeter Puffer und Medien
2.4 Partiell verdaute DNA von EAT-Zellen
2.5 Lamin C-cDNA-Sonden
3. Methoden
3.1 Konstruktion einer genomischen Sequenzbank
3.1.1 Ligation von EAT-DNA-Fragmenten mit EMBL3 Phagenarmen
3.1.2 In vitro-Verpackung von rekombinierter Phagen-DNA
3.1.3 Präparation von E. coli-Zellen für die Infektion mit λ−Phagen
3.1.4 Infektion von E. coli-Zellen mit λ−Phagen
3.1.5 Konzentrationsbestimmung von λ−Phagen in Suspension
3.1.6 Amplifikation der Stammsequenzbank
3.2 Identifizierung von rekombinierten λ−Phagen
3.2.1 Herstellen von Replikas
3.2.2 Radioaktive Markierung von Lamin C-cDNA mit [α-32P]dCTP
3.2.3 TCA-Präzipitation
3.2.4 Hybridisierung der Nylonmembranblots
3.2.5 Autoradiographie
3.2.6 Anreicherung, Selektion und Amplifikation von vereinzelten λ−Phagenklonen
3.3 Umklonieren von genomischen DNA-Fragmenten aus dem EMBL3-Phagen in den Bluescriptvektor
3.3.1 DNA-Isolierung aus λ-Phagen
3.3.2 DNA-Konzentrationsbestimmung
3.3.3 Restriktionsendonukleaseverdau
3.3.4 Agarose-Gelelektrophorese
3.3.5 Southernblot
3.3.6 Gewinnung der genomischen DNA-Fragmente aus dem EMBL3-Phagenklon
3.3.7 Präparation des Bluescriptvektors für die Ligation
3.3.8 Ligation in den Bluescriptvektor
3.3.9 Herstellung von transformationskompetenten E. coli-Zellen
3.3.10 Transformation von E.coli mit rekombinierten Bluescriptvektoren
3.3.11 Isolierung von Plasmid-DNA
4. Ergebnisse
4.1 Nachweis der Lokalisation des Lamin C-Gens zwischen zwei genomischen Eco RI-Schnittstellen
4.2 Etablierung einer repräsentativen genomischen Sequenzbank
4.3 Identifizierung eines rekombinanten Klons Embl3gLCM
4.4 Identifizierung des Genfragments mit für Lamin C codierenden Sequenzen auf dem Phagenklon Embl3gLCM
4.5 Umklonierung des Eco RI-Sal I-Fragments in den Bluescriptvektor
4.6 Umklonierung des Eco RI-Eco RI-Fragments in den Bluesciptvektor
5. Diskussion
6. Zusammenfassung
Zielsetzung & Themen
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Schaffung eines Forschungsansatzes zur Untersuchung der genomischen Organisation der Kernlamine. Dabei soll insbesondere ein Klon identifiziert und isoliert werden, der DNA-Sequenzen enthält, die für das Lamin C-Gen codieren.
- Erstellung einer repräsentativen genomischen Sequenzbank in λ-Phagen auf Basis von Ehrlich-Ascites-Tumorzellen der Maus.
- Identifizierung und Isolierung eines spezifischen Phagenklons (Embl3gLCM) mit Lamin C-codierenden Sequenzen mittels Hybridisierung.
- Charakterisierung und Eingrenzung der codierenden Sequenzen durch Restriktionsanalyse.
- Umklonierung der identifizierten DNA-Fragmente in Plasmidvektoren (Bluescript) zur Amplifikation und weiteren Untersuchung.
Auszug aus dem Buch
3.1.1 Ligation von EAT-DNA-Fragmenten mit EMBL3-Phagenarmen
Die Ligation erfolgte nach Anweisungen von EMBL3-Anbieter Stratagene (San Diego, USA) mit einzelnen Modifikationen.
Die Arbeitsschritte wurden, wenn nicht anders erwähnt, im Eisbad vorgenommen. Zur Vermeidung von Religation, waren die EAT-DNA-Fragmente dephosphoryliert. Für die Ligation wurden 4 µl (2 µg) in TE 0,1 gelöste DNA-Fragmente mit 5 µl (5 µg) EMBL3-Phagenarmen gemischt und anschließend mit TE 0,1 auf 50 µl aufgefüllt. Danach wurde die DNA mit 5 µl, 3 M NH4-Acetat, pH 5,2 und 165µl abs. Äthanol bei -20° C für 60 min. gefällt.
Nach 20 min Zentrifugieren in der Eppendorf-Zentrifuge bei 4° C wurde der Überstand verworfen und das Pellet für 10 min unter einer 60 W Tischlampe getrocknet. Das Pellet wurde in 7 µl H2O und 1 µl 10 x Ligasepuffer (500 mM Tris/HCL, pH 8,0, 70 mM MgCI2, 10 mM DTT) gelöst und 2 min bei 65° C erhitzt, kurz bei Raumtemperatur abgekühlt und dann 5 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 1 µl 10 mM ATP und 1 µl T4-DNA-Ligase (100 IU) wurde bei 4° C 60 Stunden inkubiert.
Die Ligation wurde durch Agarose-Gelektrophorese überprüft. Dazu wurde jeweils vor und nach Inkubation 1 µl des Ligationsansatzes mit 4 µl TE und 3 µl Stoppuffer versetzt. Anschließend erfolgte die elektrophoretische Auftrennung der DNA-Banden wie unter 3.3.4 beschrieben.
Zusammenfassung der Kapitel
1. Einleitung: Die Einleitung gibt einen Überblick über die Bedeutung der DNA, die Entwicklung der Molekulargenetik und die biologische Rolle der Lamine als Intermediärfilamente in der Kernhülle.
2. Material: Dieses Kapitel listet die verwendeten Chemikalien, Enzyme, Vektoren und Bakterienstämme sowie die Zusammensetzung der verwendeten Pufferlösungen auf.
3. Methoden: Hier werden die experimentellen Schritte zur Konstruktion der Genom-Bank, zur Identifizierung der Phagenklone, zum Southernblot sowie zur Klonierung in Bluescript-Plasmide detailliert beschrieben.
4. Ergebnisse: Dieses Kapitel präsentiert den Nachweis der Genlokalisation, die Etablierung der Genom-Bank sowie die erfolgreiche Identifizierung und Umklonierung des Lamin C-Gensegments.
5. Diskussion: Die Diskussion reflektiert die Ergebnisse der Arbeit und bewertet die Eignung der gewählten Methode zur Aufklärung der genomischen Organisation der Lamingene.
6. Zusammenfassung: Hier werden die wichtigsten erzielten Ergebnisse und der wissenschaftliche Fortschritt der Arbeit in fünf zentralen Punkten zusammengefasst.
Schlüsselwörter
Genomische DNA, Lamin C, Ehrlich-Ascites-Tumorzellen, EAT, λ-Phage EMBL3, Bluescriptvektor, Klonierung, Restriktionsendonukleasen, Southernblot, Hybridisierung, cDNA-Sonde, Molekularbiologie, Genexpression, Intermediärfilamente, Genbank.
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der molekularbiologischen Untersuchung der genomischen Organisation von Laminen, einer speziellen Proteinfamilie der Kernhülle, bei Mäusen.
Was sind die zentralen Themenfelder der Publikation?
Im Zentrum stehen die Klonierung von genomischen DNA-Fragmenten, die das Lamin C-Gen der Maus enthalten, sowie die Untersuchung derer struktureller Organisation.
Was ist das primäre Ziel oder die Forschungsfrage?
Das Ziel war es, Voraussetzungen zu schaffen, um Lamingene bzw. für Lamine codierende DNA-Sequenzen (speziell das Lamin C-Gen) aus dem Genom der Maus zu isolieren und zu charakterisieren.
Welche wissenschaftliche Methode wurde verwendet?
Es wurden klassische molekularbiologische Techniken wie die Konstruktion einer genomischen Genbank in λ-Phagen, Hybridisierung mit radioaktiv markierten Sonden, Southernblot-Analysen und das Umklonieren in Plasmidvektoren angewendet.
Was wird im Hauptteil behandelt?
Der Hauptteil beschreibt detailliert die Vorbereitung der DNA, die Identifizierung der spezifischen Phagenklone, die Klonierung der Fragmente in Bluescript-Vektoren und die experimentelle Validierung der Ergebnisse durch Restriktionsanalysen.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit ist durch Begriffe wie Genomik, Lamin-Klonierung, λ-Phagen-Technologie, Blau-Weiß-Selektion und molekulare Charakterisierung von Tumorzell-DNA geprägt.
Was bedeutet "Embl3gLCM" in diesem Kontext?
Es handelt sich um den spezifischen Phagenklon, der aus der Genbank isoliert wurde und die genomische Sequenz des Lamin C-Gens der Maus im Vektor EMBL3 enthält.
Warum wurden gerade Ehrlich-Ascites-Tumorzellen (EAT) als Material gewählt?
EAT-Zellen sind ein gut untersuchtes Tumorsystem, bei dem bekannt ist, dass die Lamine B und C in signifikanten Mengen exprimiert werden, was sie zu einem idealen Modell für diese molekulargenetische Untersuchung macht.
- Citation du texte
- Dr. med. Robert Eibl (Auteur), 1990, Klonierung eines genomischen DNA-Fragments mit für Lamin C codierenden Sequenzen, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/93884
