Polymerase Chainreaktion

Polymerase Ketten Reaktion:

I. Überblick

1. Sinn und Zweck/ Prinzip

Vervielfältigung eines DNS Stücks durch DNS- Polymerase

2. Voraussetzung:

Die Sequenzen an beiden Enden des zu kopierenden DNS Stückes müssen bekannt sein, weil an beiden Enden ( jeweils am 3' Ende) ein Oliginucleotide angebracht werden muß

= Primer = Startstelle

3. Lieferanten Polymerase/ Restriktionsenzym = Bakterienstamm ( heiße Quellen = Hitzestabil)

II. Ablauf der PCR: ( Folie!!)

1. Denauterierung der DNS durch Hitze ( Trennung der Einzelstränge)
→2. Senkung der Temperatur Primer werden hinzugefügt
3. Erhitzung Polymerase synthetisiert komlimentären Einzelstrang
4. Denauterierung der entstandenen Einzelstränge

→Exponentielles Wachstum ( nach 30 Abläufen über 268 Millionen Kopien)

5. Analyse des Produkts

Einzelheiten der PCR:

I. Wichtig für Verlauf:

Richtige Konstruktion der Primer sonst keine Synthese oder falsche Abschnitte kopiert werden

→Sequenz komplimentär zu Enden

Außerdem Primer ca. 17 Basen lang weil sonst mehrere komplimentäre Stellen auf DNS

II. Reaktionstemperatur

Denauterierung: 94⁰ C

Hybridvisierungstemperatur vom Primer abhängig, berechnen DNS- Synthese 74⁰ C

Wichtig genaue Einhaltung der Temperatur weil sonst Primer falsch oder nicht anheftet.

Berechnung der Hybridvisierungstemperatur:

Hybridvisierungstemperatur (TH) liegt 2⁰ C unter Schmelztemperatur

→(TM) TH = TM - 2⁰ C

Berechnung der Schmeltemperatur:

TM = ( 4 ( G + C) + 2 ( A + T)⁰ C

G = Guanin Nucleotide auf Primer

Beispiel: (Tafel) 5´ AGACTCAGAGAGAACCC 3´

4G/ 5C/ 7A / 1T einsetzen = 52⁰ C

Analyse der Produkte der PCR:

Mehrere Möglichkeiten:

1. Agarosegelelektrophese:

a. Produkt + Agarosegel + Ethidiumbromid = ein Band sichtbar Sonst Wiederholung des Experiments
b. Feststellung der Länge ( Deletion/ Insertion ??)

2. Sequenzanalyse der gewonnen DNS ( Folie):

Aufspaltung der DNS

Normaler und modifizierter ( Magnetkügelchen) Primer Denauterierung und Trennung der Stränge

Mit Enzym Sequenzase Molekül erkennen der Aminosequenz

Anwendungsgebiete:

1. DNS Analyse

Extreme Empfindlichkeit der PCR ( ein einziges DNS Molekül kann Matrize sein)

Gerichtsmedizin: - Untersuchung von Haare und Blutflecken

- Archäologie/ Paläontologie

Ermittlung winziger DNS Spuren in fossilem Material

2. Klinische Diagnose ( Folie):

Schnellen Analyse fraglicher Mutationen durch PCR

Gegensatz Früher

→Schneller Erkennung frühere Diagnose bei viruellen

→Erkrankungen ( Krebs) frühere Behandlungsmöglichkeit durch Erkennung der Symptome bevor sie auftreten

3. Vervielfältigung von RNA

RNA + Enzym + Reverse Transkriptase = einzelsträngiger cDNS- Strang Dann Zugabe der Primer und der Polymerase = PCR

Durch sog. RT-PCR messen des Mengenverhältnisse in verschieden Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten

Je höher mRNA Konzentration desto höhere Genaktivität

Wegen hohen Empfindlichkeit der PCR Messung weniger aktiver Gene möglich

4. Vergleichen verschiedener Genome ( Folie)

→Zufallsexperimente kurze Primer Stücke die an mehreren DNS Stücken anheften kann man die Gesamtstruktur erkennen, so dass man aus dem Bandenmuster etwas über die Organisation des Genomos erfährt. Evolutionsgeschichte: Festellen der Verwandtschaft zwischen den Lebewesen ( RAPD )

Beispiel:

→Fruchtkörper eines Hallimaschpilzes besaß immer die genau gleiche Genomstruktur ein riesiger Klon der sich über 1000000 m² erstreckt und eines der ältesten Lebewesen dieser Erde ist.