Polymerase Ketten Reaktion: Häufig gestellte Fragen (FAQ)
Was ist das Hauptthema dieses Textes?
Der Text bietet eine umfassende Übersicht über die Polymerase Ketten Reaktion (PCR), eine Methode zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten. Er beschreibt das Prinzip, den Ablauf, die Analyse der Produkte und verschiedene Anwendungsgebiete der PCR.
Wie funktioniert die PCR?
Die PCR basiert auf der wiederholten Denaturierung (Trennung der DNA-Doppelhelix), Primeranlagerung und DNA-Synthese durch eine hitzestabile Polymerase. Dieser Zyklus wird mehrfach wiederholt, was zu einer exponentiellen Vermehrung des DNA-Abschnitts führt.
Welche Voraussetzungen sind für die PCR notwendig?
Die Sequenzen an beiden Enden des zu kopierenden DNA-Stücks müssen bekannt sein, um passende Primer (kurze DNA-Abschnitte) zu synthetisieren, die als Startstellen für die Polymerase dienen. Eine hitzestabile Polymerase ist ebenfalls erforderlich.
Welche Schritte umfasst der PCR-Ablauf?
Der Ablauf besteht aus wiederholten Zyklen von Denaturierung der DNA durch Hitze, Abkühlung zur Primeranlagerung, DNA-Synthese durch die Polymerase und erneuter Denaturierung. Nach mehreren Zyklen liegt eine große Anzahl an Kopien des gewünschten DNA-Abschnitts vor.
Wie wichtig ist die Primerkonstruktion bei der PCR?
Die richtige Konstruktion der Primer ist entscheidend. Falsch konstruierte Primer führen entweder zu keiner Synthese oder zur Vervielfältigung falscher Abschnitte. Die Primerlänge sollte etwa 17 Basen betragen, um die Spezifität zu gewährleisten.
Wie wird die Reaktionstemperatur bei der PCR bestimmt?
Die Denaturierungstemperatur liegt bei 94°C. Die Hybridisierungstemperatur der Primer hängt von ihrer Sequenz ab und wird berechnet. Eine genaue Temperaturkontrolle ist wichtig, um die korrekte Primeranlagerung sicherzustellen. Die Berechnung der Hybridisierungstemperatur erfolgt über die Schmelztemperatur (TM).
Wie werden die PCR-Produkte analysiert?
Die Analyse der PCR-Produkte erfolgt meist mittels Agarosegelelektrophorese, um die Länge des Produkts zu bestimmen und die erfolgreiche Vervielfältigung zu überprüfen. Eine Sequenzanalyse ermöglicht die genaue Bestimmung der Basenabfolge.
Welche Anwendungsgebiete hat die PCR?
Die PCR findet breite Anwendung in verschiedenen Bereichen, darunter die DNA-Analyse (Gerichtsmedizin, Archäologie), die klinische Diagnostik (Schnelle Erkennung von Mutationen und Infektionen), die Vervielfältigung von RNA (RT-PCR) und der Vergleich verschiedener Genome (z.B. zur Untersuchung der Evolution).
Welche Vorteile bietet die PCR in der klinischen Diagnostik?
Die hohe Empfindlichkeit der PCR ermöglicht die schnelle und frühe Diagnose von Krankheiten, indem sie bereits kleinste Mengen an krankheitsspezifischer DNA oder RNA detektiert. Dies erlaubt eine frühzeitige Behandlung.
Wie funktioniert die Vervielfältigung von RNA mittels PCR?
RNA wird zunächst mithilfe der reversen Transkriptase in cDNA (komplementäre DNA) umgeschrieben. Anschließend wird die cDNA mit Hilfe der PCR vervielfältigt.
Wie wird die PCR zum Vergleich verschiedener Genome eingesetzt?
Kurze Primer, die an mehreren Stellen des Genoms binden können, erlauben es, die Gesamtstruktur des Genoms zu untersuchen und Verwandtschaftsbeziehungen zwischen Lebewesen zu ermitteln (RAPD).
Polymerase Ketten Reaktion:
I. Überblick
1. Sinn und Zweck/ Prinzip
Vervielfältigung eines DNS Stücks durch DNS- Polymerase
2. Voraussetzung:
Die Sequenzen an beiden Enden des zu kopierenden DNS Stückes müssen bekannt sein, weil an beiden Enden ( jeweils am 3' Ende) ein Oliginucleotide angebracht werden muß
= Primer = Startstelle
3. Lieferanten Polymerase/ Restriktionsenzym = Bakterienstamm ( heiße Quellen = Hitzestabil)
II. Ablauf der PCR: ( Folie!!)
1. Denauterierung der DNS durch Hitze ( Trennung der Einzelstränge)
→2. Senkung der Temperatur Primer werden hinzugefügt
3. Erhitzung Polymerase synthetisiert komlimentären Einzelstrang
4. Denauterierung der entstandenen Einzelstränge
→Exponentielles Wachstum ( nach 30 Abläufen über 268 Millionen Kopien)
5. Analyse des Produkts
Einzelheiten der PCR:
I. Wichtig für Verlauf:
Richtige Konstruktion der Primer sonst keine Synthese oder falsche Abschnitte kopiert werden
→Sequenz komplimentär zu Enden
Außerdem Primer ca. 17 Basen lang weil sonst mehrere komplimentäre Stellen auf DNS
II. Reaktionstemperatur
Denauterierung: 940 C
Hybridvisierungstemperatur vom Primer abhängig, berechnen DNS- Synthese 740 C
Wichtig genaue Einhaltung der Temperatur weil sonst Primer falsch oder nicht anheftet.
Berechnung der Hybridvisierungstemperatur:
Hybridvisierungstemperatur (TH) liegt 20 C unter Schmelztemperatur
→(TM) TH = TM - 20 C
Berechnung der Schmeltemperatur:
TM = ( 4 ( G + C) + 2 ( A + T)0 C
G = Guanin Nucleotide auf Primer
Beispiel: (Tafel) 5´ AGACTCAGAGAGAACCC 3´
4G/ 5C/ 7A / 1T einsetzen = 520 C
Analyse der Produkte der PCR:
Mehrere Möglichkeiten:
1. Agarosegelelektrophese:
a. Produkt + Agarosegel + Ethidiumbromid = ein Band sichtbar Sonst Wiederholung des Experiments
b. Feststellung der Länge ( Deletion/ Insertion ??)
2. Sequenzanalyse der gewonnen DNS ( Folie):
Aufspaltung der DNS
Normaler und modifizierter ( Magnetkügelchen) Primer Denauterierung und Trennung der Stränge
Mit Enzym Sequenzase Molekül erkennen der Aminosequenz
Anwendungsgebiete:
1. DNS Analyse
Extreme Empfindlichkeit der PCR ( ein einziges DNS Molekül kann Matrize sein)
Gerichtsmedizin: - Untersuchung von Haare und Blutflecken
- Archäologie/ Paläontologie
Ermittlung winziger DNS Spuren in fossilem Material
2. Klinische Diagnose ( Folie):
Schnellen Analyse fraglicher Mutationen durch PCR
Gegensatz Früher
→Schneller Erkennung frühere Diagnose bei viruellen
→Erkrankungen ( Krebs) frühere Behandlungsmöglichkeit durch Erkennung der Symptome bevor sie auftreten
3. Vervielfältigung von RNA
RNA + Enzym + Reverse Transkriptase = einzelsträngiger cDNS- Strang Dann Zugabe der Primer und der Polymerase = PCR
Durch sog. RT-PCR messen des Mengenverhältnisse in verschieden Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten
Je höher mRNA Konzentration desto höhere Genaktivität
Wegen hohen Empfindlichkeit der PCR Messung weniger aktiver Gene möglich
4. Vergleichen verschiedener Genome ( Folie)
→Zufallsexperimente kurze Primer Stücke die an mehreren DNS Stücken anheften kann man die Gesamtstruktur erkennen, so dass man aus dem Bandenmuster etwas über die Organisation des Genomos erfährt. Evolutionsgeschichte: Festellen der Verwandtschaft zwischen den Lebewesen ( RAPD )
Beispiel:
→Fruchtkörper eines Hallimaschpilzes besaß immer die genau gleiche Genomstruktur ein riesiger Klon der sich über 1000000 m2 erstreckt und eines der ältesten Lebewesen dieser Erde ist.
- Arbeit zitieren
- Johannes Jasper (Autor:in), 2000, Polymerase Chainreaktion, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/97359
