Polymerase Ketten Reaktion:
I. Überblick
1. Sinn und Zweck/ Prinzip
Vervielfältigung eines DNS Stücks durch DNS- Polymerase
2. Voraussetzung:
Die Sequenzen an beiden Enden des zu kopierenden DNS Stückes müssen bekannt sein, weil an beiden Enden ( jeweils am 3' Ende) ein Oliginucleotide angebracht werden muß
= Primer = Startstelle
3. Lieferanten Polymerase/ Restriktionsenzym = Bakterienstamm ( heiße Quellen = Hitzestabil)
II. Ablauf der PCR: ( Folie!!)
1. Denauterierung der DNS durch Hitze ( Trennung der Einzelstränge)
→2. Senkung der Temperatur Primer werden hinzugefügt
3. Erhitzung Polymerase synthetisiert komlimentären Einzelstrang
4. Denauterierung der entstandenen Einzelstränge
→Exponentielles Wachstum ( nach 30 Abläufen über 268 Millionen Kopien)
5. Analyse des Produkts
Einzelheiten der PCR:
I. Wichtig für Verlauf:
Richtige Konstruktion der Primer sonst keine Synthese oder falsche Abschnitte kopiert werden
→Sequenz komplimentär zu Enden
Außerdem Primer ca. 17 Basen lang weil sonst mehrere komplimentäre Stellen auf DNS
II. Reaktionstemperatur
Denauterierung: 940 C
Hybridvisierungstemperatur vom Primer abhängig, berechnen DNS- Synthese 740 C
Wichtig genaue Einhaltung der Temperatur weil sonst Primer falsch oder nicht anheftet.
Berechnung der Hybridvisierungstemperatur:
Hybridvisierungstemperatur (TH) liegt 20 C unter Schmelztemperatur
→(TM) TH = TM - 20 C
Berechnung der Schmeltemperatur:
TM = ( 4 ( G + C) + 2 ( A + T)0 C
G = Guanin Nucleotide auf Primer
Beispiel: (Tafel) 5´ AGACTCAGAGAGAACCC 3´
4G/ 5C/ 7A / 1T einsetzen = 520 C
Analyse der Produkte der PCR:
Mehrere Möglichkeiten:
1. Agarosegelelektrophese:
a. Produkt + Agarosegel + Ethidiumbromid = ein Band sichtbar Sonst Wiederholung des Experiments
b. Feststellung der Länge ( Deletion/ Insertion ??)
2. Sequenzanalyse der gewonnen DNS ( Folie):
Aufspaltung der DNS
Normaler und modifizierter ( Magnetkügelchen) Primer Denauterierung und Trennung der Stränge
Mit Enzym Sequenzase Molekül erkennen der Aminosequenz
Anwendungsgebiete:
1. DNS Analyse
Extreme Empfindlichkeit der PCR ( ein einziges DNS Molekül kann Matrize sein)
Gerichtsmedizin: - Untersuchung von Haare und Blutflecken
- Archäologie/ Paläontologie
Ermittlung winziger DNS Spuren in fossilem Material
2. Klinische Diagnose ( Folie):
Schnellen Analyse fraglicher Mutationen durch PCR
Gegensatz Früher
→Schneller Erkennung frühere Diagnose bei viruellen
→Erkrankungen ( Krebs) frühere Behandlungsmöglichkeit durch Erkennung der Symptome bevor sie auftreten
3. Vervielfältigung von RNA
RNA + Enzym + Reverse Transkriptase = einzelsträngiger cDNS- Strang Dann Zugabe der Primer und der Polymerase = PCR
Durch sog. RT-PCR messen des Mengenverhältnisse in verschieden Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten
Je höher mRNA Konzentration desto höhere Genaktivität
Wegen hohen Empfindlichkeit der PCR Messung weniger aktiver Gene möglich
4. Vergleichen verschiedener Genome ( Folie)
→Zufallsexperimente kurze Primer Stücke die an mehreren DNS Stücken anheften kann man die Gesamtstruktur erkennen, so dass man aus dem Bandenmuster etwas über die Organisation des Genomos erfährt. Evolutionsgeschichte: Festellen der Verwandtschaft zwischen den Lebewesen ( RAPD )
Beispiel:
Häufig gestellte Fragen
Was ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR)?
Die PCR ist eine Methode zur Vervielfältigung eines spezifischen DNA-Abschnitts mithilfe der DNA-Polymerase.
Welche Voraussetzungen sind für eine PCR erforderlich?
Man muss die Sequenzen an beiden Enden des zu kopierenden DNA-Abschnitts kennen, da dort Oligonukleotide (Primer) angebracht werden müssen, die als Startstellen dienen.
Woher stammen die für die PCR benötigten Polymerasen und Restriktionsenzyme?
Sie werden aus Bakterienstämmen gewonnen, oft aus heißen Quellen, um Hitzestabilität zu gewährleisten.
Wie läuft eine PCR ab?
- Denaturierung der DNA durch Hitze (Trennung der Einzelstränge).
- Senkung der Temperatur, Primer werden hinzugefügt.
- Erhitzung: Die Polymerase synthetisiert einen komplementären Einzelstrang.
- Denaturierung der entstandenen Einzelstränge.
Dieser Zyklus wird wiederholt, was zu exponentiellem Wachstum der DNA-Kopien führt.
Was ist bei der Konstruktion der Primer zu beachten?
Die Primer müssen korrekt konstruiert sein, da sonst keine Synthese oder falsche Abschnitte kopiert werden. Sie sollten komplementär zu den Enden des zu vervielfältigenden Abschnitts sein und etwa 17 Basen lang, um spezifische Bindung zu gewährleisten.
Welche Temperaturen sind für die einzelnen Schritte der PCR wichtig?
Denaturierung: 94°C. Hybridisierungstemperatur: Abhängig vom Primer, muss berechnet werden. DNA-Synthese: 74°C. Die genaue Einhaltung der Temperaturen ist entscheidend für den Erfolg der PCR.
Wie wird die Hybridisierungstemperatur berechnet?
Die Hybridisierungstemperatur (TH) liegt 2°C unter der Schmelztemperatur (TM): TH = TM - 2°C.
Wie wird die Schmelztemperatur berechnet?
TM = (4 * (G + C) + 2 * (A + T))°C, wobei G, C, A und T die Anzahl der Guanin-, Cytosin-, Adenin- und Thymin-Nukleotide im Primer sind.
Wie können die Produkte der PCR analysiert werden?
Es gibt verschiedene Möglichkeiten, darunter:
- Agarosegelelektrophorese: Visualisierung der DNA-Banden nach Anfärbung.
- Sequenzanalyse der gewonnenen DNA: Bestimmung der genauen Nukleotidsequenz.
Welche Anwendungsgebiete hat die PCR?
- DNA-Analyse (z.B. in der Gerichtsmedizin, Archäologie, Paläontologie).
- Klinische Diagnose (z.B. schnelle Analyse von Mutationen, Früherkennung viraler Erkrankungen und Krebs).
- Vervielfältigung von RNA (mittels RT-PCR zur Messung von Genaktivität).
- Vergleich verschiedener Genome (z.B. zur Feststellung von Verwandtschaftsbeziehungen, RAPD-Analyse).
Was ist RT-PCR?
RT-PCR (Reverse Transkriptase PCR) ermöglicht die Vervielfältigung von RNA. Zuerst wird RNA durch Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben, welche dann per PCR amplifiziert wird. Dies ermöglicht die Messung von Genexpression.
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- Citation du texte
- Johannes Jasper (Auteur), 2000, Polymerase Chainreaktion, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/97359
