In dieser Arbeit soll der mögliche Einfluss von CAR und PPARa auf die Regulation des Indy-Gens in Säugetierhepatozyten untersucht werden. Dazu wurden Rattenhepatozyten mit dem CAR-Aktivator Phenobarbital und dem PPARa-Agonisten WY 14643 stimuliert und anschließend die Indy mRNA, die Indy-Promotoraktivität und der 14C-Citrattransport untersucht. Die Ergebnisse und deren Konsequenzen werden in dieser Arbeit dargestellt.
Kalorische Restriktion verbessert die Gesundheit und verlängert die Lebensspanne über nahezu alle Speziesgrenzen hinweg. Hierbei kann durch Funktionsänderungen von Genen wie z.B. dem Indy („I am not dead-yet“)-Gen der Zustand kalorischer Restriktion simuliert und folglich die Lebenserwartung erhöht werden. Das in Drosophila melanogaster entdeckte Indy-Gen codiert einen Tricarboxylattransporter, der Intermediate des Citrat-Zyklus in Zellen transportiert. Diese können zur Energieversorgung des Organismus genutzt werden. Über die Regulation des Indy-Gens ist noch wenig bekannt.
In Voruntersuchungen wurde gezeigt, dass die Indy-Expression in Drosophila malanogaster, Caenorabididtis elegans und Mus musculus durch Fasten reprimiert wurde. In Rattenhepatozyten dagegen wurde das Gen durch das Hungerhormon Glucagon
induziert. Im Fastenzustand werden noch weitere Gene hochreguliert, wie z.B die Transkriptionsfaktoren PPARa und CAR. Diese kontrollieren wiederum Gene des Energiestoffwechsels.
Unser Lebensstil - der Anteil an körperlicher Aktivität oder die Art und Menge der täglichen Nahrungsaufnahme - beeinflusst nicht nur das Auftreten bestimmter Erkrankungen sondern darüber hinaus unsere Lebenserwartung. Gerade das Ernährungsverhalten spielt dabei eine entscheidende Rolle. Eine den Bedarf übersteigende Nahrungsaufnahme führt langfristig zur Adipositas und erhöht das Risiko ernährungsbedingte Krankheiten wie Diabetes mellitus Typ II, Insulinresistenz, oder kardiovaskuläre Erkrankungen zu entwickeln. Dadurch sinkt die Lebenserwartung.
Dagegen ist es möglich durch eine reduzierte Kalorienzufuhr die Entstehung von Krankheiten zu vermeiden und so die Lebenserwartung zu erhöhen. Auch unabhängig von der Krankheitsvermeidung kann Kalorienrestriktion die Lebenserwartung verlängern, denn durch Verringerung der Nahrungsaufnahme wird nicht nur der Körperfettanteil reduziert sondern zudem der Alterungsprozess verlangsamt.
Inhaltsverzeichnis
I. Einleitung
I.1 Molekulare Mechanismen kalorischer Restriktion und Langlebigkeit
I.2 Das Indy-Gen und seine Funktion im Zustand kalorischer Restriktion
I.2.1 Struktur und Funktion des Indy-Genprodukts
I.2.2 Zusammenhang zwischen Indy-Expression und Lebenserwartung
I.3 Die Rolle von CAR und PPARα im Energiemetabolismus
I.4 Ziel der Arbeit
II. Material und Methoden
ZELLBIOLOGISCHE METHODEN
II.1 Isolierung und Reinigung von Hepatozyten nach Meredith
II.2 Hepatozytenkultivierung
II.2.1 Puffer und Lösungen
II.2.2 Durchführung der Hepatozytenkultivierung
II.3 Transfektion von primären Rattenhepatozyten
II.3.1 Puffer und Lösungen
II.3.2 Prinzip
II.3.3 Transfektionscocktail
II.3.4 Durchführung der Transfektion primärer Hepatozyten
II.4 Stimulation von primären Rattenhepatozyten mit Phenobarbital und WY14643
II.4.1 Puffer und Lösungen
II.4.2 Stimulation primärer Hepatozyten
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
II.5 Isolierung von Gesamt-RNA
II.5.1 Puffer und Lösungen
II.5.2 RNA-Isolierung
II.6 Synthese von cDNA-mRNA-Hybriden
II.6.1 Puffer und Lösungen
II.6.2 Synthese von cDNA
II.7 Real-Time-quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)
II.7.1 Puffer und Lösungen
II.7.2 Grundprinzip der RT-qPCR
II.7.3 Durchführung der RT-qPCR
II.8 Agarosegel-Elektrophorese
II.8.1 Puffer und Lösungen
II.8.2 Auftrennung der DNA im Agarosegel
II.8.3 Isolierung von DNA aus Agarosegel
II.9 Umklonierung der rIndy-Promotorfragmente aus pGL3-basic in den Vektor pGL4.83
II.9.1 Prinzip
II.9.2 Puffer und Lösungen
II.9.3 Ligation der rIndy-Promotorfragmente mit pGL4.83
II.10 Transformation der pGL4.83 - rIndyprom- Plasmide in E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation
II.10.1 Puffer und Lösungen
II.10.2 Transformation kompetenter E.coli XL-1 Zellen durch Elektroporation
II.11 Analyse rekombinanter Bakterienkolonien durch Plasmidpräparation im Mini-Maßstab
II.11.1 Puffer und Lösungen
II.11.2 Reinigung von Plasmid-DNA durch Affinitäts-Chromatographie im Mini-Maßstab
II.12 Charakterisierung von Plasmid-DNA durch Restriktionsspaltung
BIOCHEMISCHE METHODEN
II.13 Messung der Luciferase-Reportergenaktivität
II.13.1 Puffer und Lösungen
II.13.2 Grundprinzip des Luciferase Assay
II.13.3 Durchführung des Luciferase-Assays
II.13.4 Proteinbestimmung nach Bradford
II.14 Messung des Citrattransports in primäre Hepatozyten der Ratte
II.14.1 Puffer und Lösungen
II.14.2 Durchführung der Citrattransportstudie
III. Ergebnisse
III.1 Regulation der Indy und Cyp2B1 mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
III.1.1 Induktion der Cyp2B1 mRNA
III.1.2 Induktion der Indy mRNA
III.2 Regulation der Cyp2B10 und Indy mRNA in mHC durch PB und WY14643
III.2.1 Induktion der Cyp2B10 bei C57B/6 Mäusen
III.2.2 Induktion der Indy mRNA bei C57B/6 Mäusen
III.2.3 Induktion der Cyp2B10 und Indy mRNA in 129SV Mäusen
III.3 Regulation der Aktivität von Indy- und Cyp2B1-Reportergenkonstrukten durch PB und WY14643 in Rattenhepatozyten
III.3.1 Aktivierung des Cyp2B1-Promotors und der Indy-Promotorfragmente
III.4 Umklonierung der rIndy-Promotorfragmente in Renilla Luciferasevektor
III.5 Regulation der Aktivität von Indy Reportergenkonstrukten durch PB und WY14643 mit Renilla-Luciferase als Reportergen
III.6 Modulation der Firefly-Luciferase mRNA in Rattenhepatozyten durch PB und WY1463
III.7 Regulation des 14C-Citrattransports in Rattenhepatozyten durch PB und WY14643
IV. Diskussion
IV.1 Einfluss von PB und WY 14643 auf die Cyp2B- und Indy Expression in Ratten- und Maushepatozyten
IV.1.1 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Cyp2B1-Expression in Rattenhepatozyten
IV.1.2 Wirkung von PB und WY 14643 auf die Indy-Expression in Rattenhepatozyten
IV.1.3 Einfluss von PB und WY 14643 auf den Citrattransport
IV.1.4 Vergleich der Indy- und Cyp2B-Regulation in Maus – und Rattenhepatozyten
IV.2 Mögliche physiologische Relevanz einer Regulation von Indy durch die Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα
IV.3 Luciferase als Reportergen bei der Untersuchung PB-abhängigen Aktivierung von Promotoren
IV.4 Schlussfolgerung
Zielsetzung & Themen
Die Arbeit untersucht den Einfluss der Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα auf die Regulation des Langlebigkeitsgens "Indy" in Säugetierhepatozyten, um die molekularen Mechanismen der kalorischen Restriktion besser zu verstehen. Mittels Reportergen-Analysen und Transportstudien wird geprüft, ob Indy als Zielgen dieser Faktoren fungiert und wie sich dessen Expression auf den Citrattransport auswirkt.
- Molekulare Mechanismen der kalorischen Restriktion
- Indy-Genregulation durch CAR und PPARα
- Vergleichende Analyse in Ratten- und Maushepatozyten
- Methodische Validierung von Luciferase-Reportergenen
- Einfluss auf den metabolischen Citrattransport
Auszug aus dem Buch
I.1 Molekulare Mechanismen kalorischer Restriktion und Langlebigkeit
Unter der kalorischen Restriktion versteht man die Reduktion der totalen Kalorienzufuhr um mehr als 30 % ohne gleichzeitige Mangelernährung [6]. Sie wird durch niedrige Plasmakonzentrationen von Glucose, anabolen Hormonen (z.B. Insulin) und Wachstumsfaktoren (z.B IGF) charakterisiert. Der Energiebedarf des Organismus wird hauptsächlich durch eine verstärkte Fettsäureoxidation gedeckt. Zusätzlich wird durch geringere Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) der oxidative Stress auf die Zellen verringert bei gleichzeitiger Beschleunigung des Protein-Turnover von bereits geschädigten Proteinen. Somit wird einer möglichen Zellschädigung vorgebeugt [3].
Die Effekte kalorischer Restriktion konnten anhand mehrerer Untersuchungen durch Modulation verschiedener Gene ermittelt werden. Diese Gene sind auch gleichzeitig Faktoren, die mit Langlebigkeit assoziiert werden, wie beispielsweise p53, Sirtuine (SIR), das Insulinrezeptorsubstrat (IRS), TOR, die AMP-Kinase sowie Indy [3-8].
Zusammenfassung der Kapitel
I. Einleitung: Beschreibt die physiologischen Grundlagen der kalorischen Restriktion, die Bedeutung des Indy-Gens und die Rolle nukleärer Rezeptoren wie CAR und PPARα im Energiestoffwechsel.
II. Material und Methoden: Detailliert die zellbiologischen, molekularbiologischen und biochemischen Verfahren, einschließlich der Hepatozytenisolierung, Transfektionsmethoden und Reportergen-Assays.
III. Ergebnisse: Präsentiert die experimentellen Daten zur mRNA-Regulation von Indy und Cyp2B1 durch Phenobarbital und WY14643 sowie die Analysen der Promotoraktivitäten.
IV. Diskussion: Interpretiert die Ergebnisse bezüglich der CAR-abhängigen Indy-Regulation und diskutiert die physiologische Relevanz sowie die methodischen Herausforderungen bei der Nutzung von Luciferase als Reportergen.
Schlüsselwörter
Kalorische Restriktion, Indy-Gen, CAR, PPARα, Hepatozyten, Phenobarbital, WY14643, Genregulation, Reportergen-Assay, Citrattransport, Langlebigkeit, Fastenadaptation, Transkriptionsfaktoren, mRNA-Expression, Zellstoffwechsel
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in dieser Arbeit grundsätzlich?
Die Arbeit befasst sich mit der Identifikation von Promotorelementen des Indy-Gens und der Untersuchung einer CAR-abhängigen Induktion von Indy in Säugetierhepatozyten.
Welche zentralen Themenfelder werden behandelt?
Die zentralen Felder sind die kalorische Restriktion, die Genregulation durch nukleäre Rezeptoren (CAR, PPARα) sowie der Energiestoffwechsel in der Leber.
Was ist das primäre Ziel der Untersuchung?
Ziel ist es, den Einfluss der Transkriptionsfaktoren CAR und PPARα auf die Indy-Genregulation zu klären und zu prüfen, ob Indy als Zielgen für diese Faktoren in Betracht kommt.
Welche wissenschaftlichen Methoden kommen zum Einsatz?
Die Arbeit nutzt unter anderem primäre Hepatozytenkulturen, RT-qPCR zur mRNA-Quantifizierung, Luciferase-Reportergen-Assays zur Promotoranalyse sowie Studien zum 14C-Citrattransport.
Was behandelt der Hauptteil?
Der Hauptteil ist in Material und Methoden sowie die Ergebnisse unterteilt, welche die Regulation von Indy und Vergleichsgenen wie Cyp2B1 in Ratten- und Mausmodellen experimentell nachweisen.
Welche Schlüsselwörter charakterisieren die Arbeit?
Wichtige Begriffe sind Kalorische Restriktion, Indy-Gen, CAR, PPARα, Hepatozyten und Genregulation.
Wie unterscheidet sich die Indy-Regulation zwischen Ratten und Mäusen?
Obwohl Indy in beiden Spezies durch Phenobarbital induziert wird, konnte die Induktion in Rattenhepatozyten durch WY14643 signifikant verstärkt werden, was in Maushepatozyten nicht beobachtet wurde.
Warum wurde die Luciferase-Reportergenanalyse normalisiert?
Da Phenobarbital einen unspezifischen hemmenden Effekt auf die Firefly-Luciferaseaktivität zeigte, war eine Normalisierung mit SV40-Promotor-Konstrukten notwendig, um echte regulatorische Effekte zu isolieren.
Welche funktionelle Relevanz hat die Regulation von Indy?
Die Regulation könnte zur Versorgung des Organismus mit gluconeogenetischen Substraten während des Fastenzustands beitragen und so den Energiehaushalt stabilisieren.
- Arbeit zitieren
- Christine Ploschenz (Autor:in), 2011, Identifikation von Promotorelementen, die zu einer CAR-abhängigen Induktion von INDY führen. Nachweis der funktionellen Relevanz, München, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/981525
