Eine computergestützte Laserbestrahlungs-Apparatur für die Photothermale Therapie (PTT). Aufbau und Erprobung

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung

2. Aufgabenstellung und Zielsetzung
2.1. Einstellen der Bestrahlungsparamater selektiv
2.2. Einstellung der Bestrahlungsparameter gruppiert

3. Grundlagen
3.1. RS-232
3.2. D/A-Wandlung
3.3. Schrittmotoren

4. Ist-Zustand der Hardware
4.1. Aufbau

5. Steuerung

6. Anforderungen an das LICSY
6.1. Anforderung an die Entwicklungsumgebung f\2. Anforderungen an das Anwenderprogramm
6.2.1. Struktur
6.2.2. Modularität
6.2.3. Erweiterbarkeit
6.3. Funktionale Anforderungen
6.3.1. Vorgabe von Bestrahlungsparametern
6.3.2. Referenzfahrt
6.3.3. Vorheizen des Lasers
6.3.4. Parkposition nach Abarbeitung
6.3.5. Anforderung an den Ablauf
6.4. Anforderungen an die Sicherheit
6.5. Anforderungen an die Benutzeroberfläche

7. Realisierung und Implementierung
7.1. Steuerung
7.1.1. RS-232 Einbinden
7.1.2. Tabellenwerte einlesen
7.1.3. Tabellenwerte ausgeben
7.1.4. Teilen in zwei Bytes
7.2. Software-Grundstruktur des LICSYs
7.2.1. Event- Struktur
7.2.2. Zustandsautomat
7.2.3. Producer/Consumer Loop
7.2.4. Funktionale globale Variable
7.3. Benutzeroberfläche
7.3.1. Aufbau
7.3.2. Sicherheit
7.3.3. Komfort

8. Einsatz des Systems
8.1. Synthese und Funktionalisierung von Gold-Nanostäbchen
8.2. Isolation von Immunzellen
8.3. Bestrahlung im Versuchsaufbau
8.4. Ergebnisse und Fazit

9. Zusammenfassung und Ausblick

10. Anhang
10.1. Programm
10.1.1. Project Expl orer
10.1.2. Main VI und Producer Consumer Loops
10.1.3. Sub VIs
10.1.4. Controls

11. Literaturverzeichnis

12. Abkürzungsverzeichnis

13. Abbildungsverzeichnis

14. Tabellenverzeichnis

1. Einleitung

Im Jahr 2018 gab es weltweit etwa 18,1 Millionen Krebsneuerkrankungen und rund 9,6 Millionen Menschen starben an dessen Folgen. 1 Damit gehören Krebserkrankungen zu den häufigsten Todesursachen weltweit und nehmen auf Grund der stetig älter werdenden Bevölkerung fortlaufen zu. [1, 2]

Als Krebs wird eine genetische Erkrankung bezeichnet, die durch maligne (bösartige) Entartungen, körpereigner Zellen entsteht. Sie unterscheiden sich von nicht entarteten Zellen, durch sechs grundlegende Eigenschaften: die Inaktivierung von wachstumshemmenden Faktoren, ein andauerndes Proliferationssignal (Wachstumssignal), die Inaktivierung des programmierten Zelltods, die Aktivierung der Invasion und Metastasierung sowie eine stimulierte Gefäßneubildung und ein unbegrenztes Potenzial zu Proliferation (Zellteilungen/Wachstum). 3

Bevor aus einer Körperzelle jedoch ein Tumor entsteht, müssen zunächst die drei Phasen der Immunüberwachung überwunden werden. In der ersten Phase (Elimination) erkennt das Immunsystem maligne transformierte Zellen und zerstört diese. Werden die malignen Transformationen in der ersten Phase nicht vollständig zerstört, so kann das adaptive Immunsystem, in der zweiten Phase (Equilibrium), nur noch das Tumorwachstum hemmen, es entsteht ein Gleichgewicht zwischen Tumor und Immunsystem. In dieser Phase kann das adaptive Immunsystem Tumore jahrzehntelang festhalten, bis es ggf. zur dritten und letzten Phase (Escape) kommt, in der die transformierten Zellen ungehindert proliferieren und zu einem klinisch sichtbaren Tumor heranwachsen. [4, 5]

Viele der bisher verfolgten Ansätze zur Behandlung von Krebserkrankungen, weisen nur mäßige Erfolge auf, haben teilweise schwere Nebenwirkungen und sind, medizinisch gesehen, unspezifisch. 6 Beispielsweise führt eine Chemotherapie mit Cisplatin, bei der nicht nur die Krebszellen, sondern zusätzlich gesunde Zellen geschädigt werden, zu starken Nebenwirkungen wie Nierenschäden, Nervenschäden, Schwerhörigkeit, Haarausfall, Erbrechen und zu Störung des Immunsystems. 7

Ein weiteres Beispiel bietet die chirurgische Entfernung des Tumors. Hierbei ist eine vollständige Resektion der Tumorzellen notwendig, da eine geringe Anzahl nicht entfernter Zellen ausreicht, um einen neuen Tumor zu bilden. [8, 9]

Auch bei der Strahlentherapie mit beispielsweise Ionisierender Strahlung, kommt es oft zu Begleiterscheinungen am Normalgewebe, wovon vor allem Schleimhäute, auf Grund ihrer ebenso schnellen Zellteilung, teils stark betroffen sind. Dies kann bei Bestrahlungen im mediastinalen Bereich (Bereich zwischen linker und rechter Lunge) zu Ösophagitis (Speiseröhrenentzündung) und Pneumonitis (entzündliche Veränderung der Lunge) führen, wohingegen es bei Bestrahlungen im abdominalen Bereich (Bereich zwischen Zwerchfell und Becken) häufig zu Übelkeit und Diarrhö kommt. 10

In den letzten zwei Jahrzehnten wurde das Potential der Nanotechnologie für diagnostische und therapeutische Zwecke entdeckt und Nanopartikel in der Krebstherapie eingesetzt.

Als Nanopartikel werden künstlich hergestellte Partikel bezeichnet, die auf Grund ihres Größenbereich von 1-100 nm, mit dem sie ähnliche Dimensionen wie Proteine (Enzyme, Antigene, Antikörper), oder die der DNA aufweisen, denen besonderes Interesse in der Biomedizin zukommen. Vor allem Nanopartikel aus Metall, wie Gold, deren Oberfläche sich leicht mit Liganden modifizieren lässt und besondere optische und physikochemische Eigenschaften aufweisen, ermöglichen nicht nur den Einsatz in der Diagnostik (Lateral Flow Tests), sondern auch in der Therapeutik (Drug-Delivery). [11-14]

Eine derzeit sehr vielversprechende Alternative zur chirurgischen Resektion und Chemo- sowie Strahltherapie, ist die Photothermale Therapie (PTT) mit Gold-Nanopartikeln, welche von Hirsch et al. und Zharov et al. das erste Mal beschrieben wurde. Dieser therapeutische Ansatz zielt darauf ab Krebszellen unter der Einwirkung hoher Temperaturen oberhalb der normalen Körpertemperatur (~37 °C) lokal und auf zellulärer Ebene irreversibel zu schädigen. Die daraus resultierende Schädigung der Zelle lässt sich dabei in zwei Kategorien einteilen: Bei Temperaturen zwischen 41 °C und 48 °C werden die Zellen, auf Grund der Denaturierung ihrer Proteine, der Erhöhung des oxidativen Stresses und der Störung des zellulären Stoffwechsels, apoptotisch (programmierter Zelltod). Eine für wenige Minuten andauernde Temperatureinwirkung über 48 °C führt zu einer irreversiblen zellulären Nekrose der Zelle (Zelltod). 15

Damit Kollateralschäden der umgebenden Zellen reduziert und der Effekt zellspezifisch und lokal begrenzt eingesetzt werden kann, werden Gold-Nanopartikel (AuNP) eingesetzt.

Der photothermale Therapieansatz macht sich dabei die Interaktion zwischen einer eingestrahlten elektromagnetischen Welle und dem Plasmon eines Partikels zu Nutze. Dabei wird das Plasmon, also das Quasi-Teilchen, welches die Gesamtheit aller Elektronen des Nanopartikels beschreibt, unter der Einwirkung von Licht, mit einer Wellenlänge resonant zur Plasmonfrequenz der AuNP, zum Schwingen angeregt. Die Schwingung der freien Leitungsbandelektronen des AuNP, hat dabei die gleiche Frequenz wie die des Lichts und wird auch als lokale Oberflächen-Plasmon-Resonanz (localized surface plasmon resonance, kurz LSPR) bezeichnet. Während der Schwingung kommt es zu Dämpfungsmechanismen, wie zum Beispiel die Kollisionen der oszillierenden Elektronen untereinander und Valenzband Elektronen, sowie mit dem Atomgitter, wodurch Hitze entsteht, welche nach außen hin abgegeben wird (Abbildung 1). [16, 17]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Schematische Darstellung des photothermalen Prozesses, bei der Bestrahlung eines AuNP in Form eines Stäbchens.

Der Laser bringt die Elektronen zum Schwingen, welche mit dem Atomgitter kollidieren können. Die resultierende Gittervibration wird in Form von Hitze an die Umgebung abgegeben. 18

AuNP lassen sich mit spezifischen Antigenen, welche an einer Krebszelle binden, Funktionali- sieren. So ist es möglich, die bei der Bestrahlung absorbierte Hitze der AuNP, lokal zu generieren und sie somit zur selektiven Zerstörung von Krebszellen zu nutzen. [18, 19]

Eine effiziente Hitzeentwicklung, kommt der Bestrahlung von AuNP, bei der PTT somit eine primäre Bedeutung zu und wird vor allem durch Form und Größe der Partikel maßgebend beeinflusst. Damit auch tiefer liegende Tumore mit der PTT erreicht werden können, sollte die Wellenlänge des Lichts auf Grund des biologischen Fensters, in dem das Gewebe die größte Transparenz für Licht aufweist, im nahinfraroten Bereich (NIR, 700-1200 nm) liegen. 20

Gold-Nanostäbchen (AuNR) stellen eine besondere Form der AuNP dar und sind durch ihr großes Oberflächen-Volumenverhältnis, bei dem das Licht sehr effizient absorbiert und in Hitze umgewandelt werden kann besonders attraktiv für die PTT. Außerdem besitzen AuNP die Eigenschaft, dass sich die Lage ihrer LSPR-Bande und somit die Wellenlänge des absorbierten Lichtes, nicht ausschließlich über ihrer Größe, wie es bei sphärischen AuNP der Fall ist, sondern ihrem Längen-/Breitenverhältnis bestimmt. Diese Besonderheit ermöglicht es, die LSPR- Bande der AuNR, auch bei kleinen Durchmessern, in den infraroten Bereich zu bewegen, zumal die messbare Lichtstreuung mit größer werdenden AuNP teils stark zunimmt. Dies hat einen negativen Einfluss auf den Anteil des absorbierten Lichtes und somit auf die Effizienz des photothermalen Effekts. [21, 22]

Die aufgezeigten Aspekte zeigen sowohl das Potenzial der PTT, als auch die Komplexität der dafür notwendigen physikochemischen Zusammenhänge.

Ein Bestrahlungssaufbau, welcher eine Bestrahlung der Proben unter möglichst konstanten Bedingungen ermöglicht, um bei der Weiterentwicklung der PTT aussagekräftige und reproduzierbare Ergebnisse zu liefern, ist daher unabdingbar.

In der vorliegenden Arbeit soll ein Mess- und Automatisierungssystem, für einen vorgegebenen mechanischen Versuchsaufbau entwickelt werden. Dieses soll auf die wissenschaftlichen Forschungsvorhaben, in Bezug auf die für die Weiterentwicklung der PTT erforderlichen, individuellen, Parametrierbarkeit eingehen.

2. Aufgabenstellung und Zielsetzung

Im Forschungsbereichen kommt es immer wieder vor, dass sich neue wissenschaftliche Fragestellungen ergeben.

Um Berechnungsergebnisse und Beobachtungen aus einer Modelbildung zu verifizieren, benötigt es häufig einen Versuchsaufbau, welchen es bis dahin, in einer für die Forschung geeigneten Form, noch nicht gab.

Damit die Steuerung eines solchen Versuchsaufbau, ohne besondere Vorkenntnisse ermöglicht werden kann, ist ein Anwendungsprogramm erforderlich, welches über eine intuitive Benutzeroberfläche verfügt. Eine damit verbundene Automatisierung der Versuchsdurchführung, führt zu reproduzierbaren Ergebnissen.

Im Rahmen dieser Bachelor Arbeit, soll eine Anwendung, mit Hilfe der graphischen Entwicklungsumgebung LabVIEW¹, für einen vorgegebene Laserbestrahlungs-Apparatur (Abbildung 2), welche für unterschiedlichste Forschungsbereiche, aber vor allem für die Weiterentwicklung der Photothermale Therapie eingesetzt wird, erstellt werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: Vorder- (Links) und Innenansicht (Rechts) der vorgegebenen Laserbestrahlungs-Apparatur mit rot markierter „vorderer linker “ Vertiefung

Dazu ist ein Anwenderprogramm erforderlich, welches auf den Versuchsaufbau abgestimmt ist, alle nötigen Sicherheitsvorkehrungen erfüllt, eine einfache Bedienung ermöglicht und den Nutzer über Fortschritt und Status der Versuchsdurchführung informiert.

Das Programm LICSY (Laser Irradiation and Control System) soll folgen Aufgaben erfüllen:

2.1. Einstellen der Bestrahlungsparamater selektiv

In die vordere Linke (Abbildung 2), der insgesamt vier Vertiefungen in der Bodenplatte der Laserbestrahlungs-Apparatur, wird eine 96-We//-U-Boden-Platte (Abbildung 3) eingesetzt. Ziel soll es sein, dem Anwender die Möglichkeit zu geben, intuitiv im Vorhinein, die Paramater Bestrahlungsdauer und Intensität, für jede einzelne der 96 Wells vorzugeben und diese dann im Anschluss, automatisiert, nacheinander, von der Laserbestrahlungs-Apparatur, mit den vorgegebenen Parametern, bestrahlen zu lassen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 3: 96-We//-U-Boden-P/atte 25

2.2. Einstellung der Bestrahlungsparameter gruppiert

Neben der Einzeleingabe von Werten für eine We//, soll der Anwender außerdem die Möglichkeit haben, Bestrahlungsdauer und Intensität für eine ganze Reihe, also acht We//s, vorgeben zu können.

3. Grundlagen

Alle für das Verständnis dieser Arbeit erforderlichen Grundlagen, werden in diesem Kapitel erläutert.

3.1. RS-232

Die RS-232 ist eine Standardschnittstelle, gehört zu einer der ältesten seriellen Schnittstellen und findet auf Grund des minimalen technischen Aufwands, um Daten zwischen zwei unterschiedlichen Geräten zu übertragen, für bestimmte Systeme, immer noch Anwendung. Zwar verfügt heutzutage kaum noch ein Gerät standardmäßig über die RS-232, diese kann aber mit Hilfe von Konvertern, welche an der gängigen USB-Schnittstelle angeschlossen werden, virtuell abgebildet werden.

Als seriell oder auch bitseriell werden Bits, der zu übertragenden Bytes, bezeichnet, die nicht als komplettes Byte, sondern nacheinander übergeben werden.

Die Bits werden asynchron übertragen, d.h. es ist kein separates Taktsignal erforderlich, welches die einzelnen Bits markiert und den Empfänger mit dem Sender synchronisiert. Stattdessen synchronisieren sich Sender und Empfänger meist über ein bis zwei Startbits (logischer Wert 0) und Stoppbits (logischer Wert 1). Damit die asynchrone Datenübertragung richtig interpretiert werden kann, wird vorausgesetzt, dass Sender und Empfänger mit demselben Übertragungsformat arbeiten, welches die Parameter Baudrate (Bit/s), Anzahl der Datenbits (zwischen 7 und 8), Paritätsbit (gerad, ungerade oder keine Parität) und Anzahl der Stoppbits (meist 1 oder 2) beinhaltet. [23, 24]

3.2. D/A-Wandlung

Unter einem Signal wird eine physikalische Größe verstanden, welche als Träger einer Information dient und in eine zeitliche oder räumliche Abhängigkeit gesetzt wurde.

Auf Grund der Relevanz für diese Arbeit, werden in folgendem lediglich eindimensionale, zeitabhängige Signale behandelt. Diese werden in diskrete und kontinuierliche Signale unterschieden. Ein Signal, welches zu jedem Zeitpunkt als definiert gilt und jeden beliebigen Wert auf der Wertachse einnehmen kann, wird als kontinuierlich bezeichnet, wohingegen zeit- und wertdiskrete Signale nur bestimmte Stellen einnehmen können.

Anhand der genannten Kriterien werden analoge- von digitalen Signalen unterschieden, d.h. ein digitales Signal ist zeit- und wertediskret, wohingegen es sich bei einem zeit- und wertekontinuierlichen Signal um ein analoges Signal handelt (Abbildung 4). [26, 27]

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 4: Beispiele der Signalklassen [27]

Ein D/A-Wandler ermöglicht es, ein digitales (binäres) Signal, in ein analoges Signal umzuwandeln.

Es wird prinzipiell zwischen „parallelen“ und „seriellen“ D/A-Wandlern unterschieden, wobei in folgendem lediglich auf den seriellen D/A-Wandler näher eingegangen wird, da er in dieser Arbeit Anwendung findet.

Seriell beschreibt die Art der Datenübertragung und wurde bereits im Kapitel 4.1 näher erläutert. Auf Grund der Zuordnung zu einem digitalen Code, kann der D/A-Wandler wie bereits beschrieben, nur wert- bzw. zeitdiskrete Werte annehmen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

3.3. Schrittmotoren

Ein Schrittmotor grenzt sich von anderen Elektromotoren durch das Drehen der Motorwelle, in diskreten Schritten ab. Die Motorwelle dreht sich dabei, durch ein sprungförmig weitergeschaltetes Magnetfeld, um diskrete Winkelschritte a. Die Schrittanzahl Z ist abhängig vom Motoraufbau und beschreibt, in wie vielen Schritten der Motor innerhalb einer ganzen Umdrehung auflösen kann.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Ein Bipolarer Hybrid-Schrittmotor beispielweise benötigt, mit einem Schrittwinkel von a = 1,8°, 200 Schritte für eine ganzheitliche Umdrehung um die eigene Achse (Gl. 2).

Mit Hilfe von Schrittmotoren wird ein schnelles und schrittgenaues Positionieren, in der Regel ohne Rückmeldung der Rotorlage, ermöglicht. Für Positionierungsantriebe werden Schrittmotoren eingesetzt, welche einen möglichst kleinen Schrittwinkel haben, um eine genauere Positionierung zu ermöglichen. [30, 31]

Um die Drehbewegung des Motors in eine Linearbewegung umzusetzen gibt es unterschiedliche Möglichkeiten. Der Zahnriemen-Antrieb ermöglicht große Fahrwege und zeichnet sich vor allem durch niedrige Kosten und Spielfreiheit des Antriebs aus. Hierbei wird die Drehbewegung des Motors über ein Ritzel auf den Riemen übertragen, welcher beispielsweise einen Schlitten auf einer Führungsschiene bewegt.

Die zurückgelegte Strecke pro Schritt kann auf verschiedene Wege ermittelt werden und ist für eine punktuelle Positionierung erforderlich. Eine Methode ist die direkte translatorische analoge Wegmessung, bei der die Längsbewegung unmittelbar mit der des Maschinenschlitten gekoppelt ist. So kann die zurückgelegte Strecke des Schlittens mit einem geraden Maßstab ermittelt und die Strecke durch die Anzahl der bewegten Schritte geteilt werden, um so die Wegstrecke pro Schritt zu ermitteln. Vorzugsweise wird dies anhand einer möglichst großen Wegstrecke ermittelt, um Ungenauigkeiten zu kompensieren. [30-32]

Wird der Maschinenschlitten beispielweise um 20.000 Schritte in eine Richtung bewegt und eine Wegstrecke von 67,6 cm gemessen, dann beträgt die Wegstrecke pro Schritte 33,8 μm.

4. Ist-Zustand der Hardware

Als Grundlage dieser Arbeit, dient eine bereits fertiggestellte und betriebsbereite Laserbestrah- lungs-Apparatur, welche sich über einen programmierten Mikrocontroller ansteuern lässt.

In diesem Kapitel werden, sowohl die damit verbundenen bzw. benötigten Hardwareelemente, als auch die Steuerung vorgestellt und beschrieben.

4.1. Aufbau

Der fertige Laserbestrahlungs-Aufbau lässt sich in zwei Komponenten einteilen.

Die erste Komponente ist das Gehäuse des Bestrahlungs-Aufbaus (Abbildung 5), welches das Austreten der risikobehafteten Laserstrahlung verhindert. Dieses besteht aus einem Korpus und einer Schutzabdeckung, welche sich nach oben hin öffnen lässt. Auf der Vorderseite des Gehäuses, befinden sich mehrere Bedien- und Anzeigeelemente. Zu den Bedienelementen, gehört unter anderem der Ein- und Ausschalter für den gesamten Aufbau, sowie der separate für den Laser. Mit einem roten und einem schwarzen Taster auf der Vorderseite, können manuell Eingaben gemacht werden, welche für diese Arbeit, jedoch nicht von Bedeutung sind. Als analoge Anzeigeelemente des Aufbaus, dienen zwei grüne und eine rote Status-LED, welche Auskunft über die Betriebsbereitschaft und eventuelle Fehler geben. Das Netzteil des Lasers verfügt über eigene Status-LEDs an der Vorderseite. Ein Schloss an der Vorderseite des Gehäuses, zwischen Deckel und Korpus, schützt vor unzulässigem Öffnen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 5: Vorderansicht auf das Gehäuse des Bestrahlungs-Aufbaus

Das Innere des Gehäuses ist die zweite Komponente des Bestrahlungsaufbaus (Abbildung 4), welches aus dem 808 nm Infrarot Laser, der Elektronik und dem 2D Flächenportal besteht. Das 2D Flächenportal, welches sich im horizontalen Arbeitsraum bewegt, setzt sich aus zwei Y- Linearachsen und einer X-Linearachse zusammen. Die X-Achse ist oberhalb der Y-Achsen frei in Y-Richtung montiert und ermöglicht so eine Bewegung in diese Richtung. An der Oberseite der X-Portalachse befindet sich der, auf einem Schlitten montierte Laser, welcher in diese Achs- richtung ebenfalls frei beweglich ist und eine Bewegung in X-Richtung ermöglicht.

Bewegt werden die Achsen jeweils über einen bipolaren Hybrid-Schrittmotor, welcher seine Drehbewegung über ein Ritzel auf einen Zahnriemen überträgt, um so eine Linearbewegung zu erzeugen. Am Anfang und am Ende jeder Achse, befinden sich Lichtschranken, welche verhindern, dass der Laser von den Schrittmotoren, über die Grenzen hinausbewegt wird.

Durch diesen Aufbau ist es möglich, nahezu jeden Punkt, innerhalb der Begrenzungen der X- und Y-Achse, anzusteuern. Über diesen, in Verbindung mit einem Schnappschalter zwischen dem Korpus und der Schutzabdeckung, wird beispielweise Auskunft über den Zustand der Schutzabdeckung, folglich „geschlossen“ oder „geöffnet“, gegeben.

Unterhalb des Lasers und somit im Zentrum der Achsen, befinden sich Vorrichtungen für vier 96-We//-U-Boden-Platten, wobei bisher nur die vordere Linke, zu sehen in Abbildung 6, tatsächlich benötigt und genutzt wird.

Außerhalb des Flächenportals, dennoch innerhalb des Gehäuses, ist die für den Bestrahlungsaufbau benötigte Elektronik verbaut. Dazu gehört unteranderem das Netzteil zur Stromversorgung des gesamten Aufbaus, sowie ein separates für den Laser, deren Bedien- und Anzeigeelemente von der Vorderseite des Gehäuses zu sehen sind.

Mit Hilfe des programmierten Mikrocontrollers, mit dem über den RS-232 Anschluss auf der Vorderseite des Gehäuses, Interaktionen erfolgen, lassen sich unteranderem die Schrittmotoren, welche für die Bewegung in X- und Y-Richtung zuständig sind und der Laser, der für die Bestrahlung der Proben eingesetzt wird, steuern. Des Weiteren wird durch den Mikrocontroller, über die RS-232 signalisiert, falls der Laser einer der insgesamt vier Lichtschranken auslöst. Diese und weitere erforderliche Funktionen des Mikrocontrollers, welche für das LICSY von Bedeutung sind, werden im Kapitel 5 (Steuerung) näher erläutert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 6: Innenansicht des Bestrahlungs-Aufbaus

5. Steuerung

Die Interaktion mit dem Mikrocontroller erfolgt über die RS-232 Schnittstelle, in hexadezimal Befehlen.

Damit die Kommunikation sichergestellt wird, muss das vorgegeben Übertragungsformat der Schnittstelle, verwenden werden (Tabelle 1).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 1: Übertragungsformat der RS-232 Schnittstelle

Um alle nötigen Funktionen (Tabelle 2), zur Steuerung des Bestrahlungsaufbaus, nutzen zu können, ist es notwendig zu wissen, welcher Hexadezimal-Befehl welche Aktion hervorruft und in welchem Schema und in welcher Abfolge diese an den Mikrocontroller übergeben werden müssen, damit diese, vom Mikrocontroller, richtig interpretiert und verarbeitet werden können.

Grundsätzlich werden hexadezimal kodierte ein-Byte Pakete zur Steuerung gesendet, wobei auf einige Pakete, wie auch aus Tabelle 2 hervorgeht, weitere 2 Datenbytes für die Positionierung folgen müssen.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 2: Befehlssatz zur Positionierung der X/Y - Koordinaten

Die zwei Datenbytes, welche auf den Hexadezimal-Befehl folgen, geben entweder die geforderte Schrittanzahl für die Schrittmotoren an, oder die Zähler der geforderten Leistung, welche sich aus der Auflösung des D/A-Wandlers und der spannungsabhängigen Intensität für den Laser ergeben.

Die Antwort des Controllers, wenn der Befehl empfangen und richtig interpretiert werden konnte, stimmt immer mit dem, an den Controller gesendeten Befehl überein.

Andernfalls wird ein Fehler als sogenannter Error Code gesendet (Tabelle 3).

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Tabelle 3:Allgemeine Error Codes

Erst nach dem alle nötigen Informationen, seitens des Mikrocontrollers, eingegangen, zurückgegeben bzw. keine Fehler aufgetreten sind, wird mit der Abarbeitung des gesendeten Befehls begonnen.

Falls eine Wegstrecke zurückgelegt wurde, wird nach erfolgreicher Abarbeitung „0x0F“ zurückgesendet. Im Falle eines Fehlers, während der Abarbeitung, wird abhängig von der Art des Fehlers, ebenfalls ein Error Code ausgegeben (Tabelle 4)

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Tabelle 4: Hex. Error Codes während der Abarbeitung

Um mit dem Laser, gezielte Wells einer 96-Well-U-Boden-Platte anzusteuern wir der Abstand der jeweiligen Well vom Ursprung benötigt, bzw. die Anzahl der Schritte, die die Schrittmotoren zurücklegen müssen, um den Laser mittig über die Well zu positionieren. Der Einfachheit halber wurden den 96 Wells der vorderen linken Vorrichtung, chronologisch numerische Werte von 1 bis 96 zugeordnet (Abbildung 7).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 7: Schematischer Positionsplan mit numerischen Zuordnungen

Anschließend wurden für alle 96 Positionen, die Entfernungen vom Koordinatenursprung bis zum Well-Mittelpunkt, in Schrittweiten ermittelt (Tabelle 5).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 5: Positionsbezogene Koordinaten in Schrittweiten

Für den Anwender ist vor allem die Intensität des Laserstrahls von Interesse. Sie wird von der anliegenden Spannung und dem Verhältnis -Spannung zu Intensität- bestimmt und verläuft nicht linear und macht daher eine tabellarische Darstellung, in der die Spannungen den Intensitäten gegenübergestellt werden, sinnvoll (Tabelle 6).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Tabelle 6: Abhängigkeit der Lichtintensität bezogenen Steuerspannung, der Laserdiode

6. Anforderungen an das LICSY

6.1. Anforderung an die Entwicklungsumgebung

In den Bereichen der Mess- und Automatisierungstechnik, stellt sich zunächst die Frage nach einer geeigneten Entwicklungsumgebung.

Um für das LICSY geeignet zu sein, müssen folgende Voraussetzungen von der Entwicklungsumgebung erfüllt werden:

- Einbinden von physikalischen Schnittstellen (RS-232)
- Einlesen von Tabellenwerten (Koordinaten, Spannungsabhängige Laserintensitäten)
- Möglichkeit zur Erstellung einer geeigneten Benutzeroberfläche (GUI)

Alle genannten Voraussetzungen werden von der Entwicklungsumgebung NI-LabVIEW erfüllt, in dem sie sowohl für Standardschnittstellen wie der RS-232, fertige Treiber zur Verfügung stellt und die Möglichkeit bietet, sämtliche Hardwarekomponenten einzubinden.

Des Weiteren ist es möglich, mit Hilfe von Tools, verschiedenste Tabellenformate einzulesen. Außerdem bietet NI LabVIEW eine umfassende Sammlung an Drag and drop-Bedien- und - Anzeigeelementen, welche es ermöglichen, schnell und einfach, eine individuelle GUI sowie Datenanzeige zu erstellen. 933

6.2. Anforderungen an das Anwenderprogramm

Das LICSY wird im Forschungsbereich eingesetzt, aus dem immer wieder neue wissenschaftliche Fragestellungen aufkommen.

Damit das LICSY für seine Aufgaben auch in Zukunft universell einsetzbar bleibt, ist es bei der Entwicklung eines Anwenderprogramms besonders wichtig, folgende Futures zu berücksichtigen:

- Struktur
- Modularität
- Erweiterbarkeit

gestellt und sind in nachfolgendem näher erläutert.

6.2.1. Struktur

Auf Grund der Komplexität, welche aus den Automatisierungsfunktionen des LICSYs, also dem Senden von Befehlen und dem gleichzeitigen Lesen und Reagieren auf Antworten des Mikrocontrollers resultieren, ist für das Verständnis und die Analysierbarkeit, eine funktionalitätsabhängige Struktur erforderlich. So müssen die Module für die Steuerung der gemachten Eingaben sich sichtbar von den Modulen für die Reaktion auf die Antworten des Mikrocontrollers unterscheiden.

6.2.2. Modularität

Komplexe Programme, welche ein Vielzahl von Funktionalitäten abbilden, sollten modular aufgebaut werden, also in mehrere, möglichst unabhängige Teilsysteme. Um die nötige Modularität des LICSYs zu gewährleisten, muss also eine klare Trennung von Funktionen erfolgen. Modular bedeutet auch, dass die Strukturen möglichst unabhängig voneinander agieren. Dennoch muss es auch hier eine Instanz geben, welche die Funktionalitäten der einzelnen Module steuert. Durch den Schritt der Modularisierung, wird eine Erhöhung der Flexibilität und Erweiterbarkeit möglich, da bei Änderungen bzw. Erweiterungen, nur wenige, oder sogar nur einzelne Module angepasst werden müssen und nicht das gesamte System. Nicht nur die Flexibilität und Erwei- terbarkeit, lassen sich durch einen modularen Aufbau vereinfachen, sondern auch der Wartungsaufwand kann erheblich reduziert werden. 34

6.2.3. Erweiterbarkeit

Die Erweiterbarkeit spielt für die langfristige und nachhaltige Einsetzbarkeit des LICSYs eine entscheidende Rolle. Auf Grund von Änderungen oder Erweiterungen, welche sich aus neuen wissenschaftlichen Anforderungen ergeben können, muss eine flexible Erweiterung des LICSY gewährleistet werden. Um die Erweiterbarkeit eines komplexen Systems auch noch nach Jahren sicherzustellen, muss das System eine klare, verständliche und einheitliche Architektur aufweisen. Diese sollte dokumentiert werden und somit analysierbar sein. Die Erweiterbarkeit geht dabei auch mit der Modularität einher.

6.3. Funktionale Anforderungen

In diesem Kapitel werden die Anforderungen, welche an das LICSY gestellt werden, um die gewünschte Funktionalität zu erreichen, erörtert.

6.3.1. Vorgabe von Bestrahlungsparametern

Der Nutzer soll im Vorhinein, Intensität und Bestrahlungsdauer, für jeden einzelne Well, der 96-Well-U-Boden-Platte in der vorderen linken Vorrichtung vorgeben können. Häufig kommt es vor, dass nicht alle der 96 Wells mit Proben bestückt werden, sodass es auch möglich sein soll, keine Werte vorzugeben.

6.3.2. Referenzfahrt

Angesichts der Hybrid-Schrittmotoren ohne Lagerrückmeldung und der damit verbundenen unbekannten Lage des Schlittens zu Beginn des Programmstarts, ist eine Positionsfindung vor jeder automatisierten Abarbeitung notwendig. Demnach soll, vor Beginn des gezielten Anfahrens der Wells, ein Referenzpunkt angesteuert werden, welcher vom Programm registriert werden kann und als Referenz für alle weiteren Bewegungen dient. Hierzu eignet sich der globale Koordinatenursprung, da der Funktionsumfang des Mikrokontrollers bereits die Funktion beinhaltet, den Schlitten zum Koordinatenursprung zu bewegen. Nach dem senden der nötigen Befehle und Rückmeldung über die RS-232, kann auf Grund der nun bekannten Position des Schlittens und der daraus resultierenden Lage der 96 Wells begonnen werden diese anzufahren und zu bestrahlen.

6.3.3. Vorheizen des Lasers

Um reproduzierbare Versuchsergebnisse zu erzielen, ist ein möglich konstantes Strahlprofil anzustreben. Zur Verringerung von Fluktuationen des Laserstrahls, während der Bestrahlung von Proben, ist eine Vorheizphase sinnvoll. Dazu soll die Leistung des Lasers, für fünf Minuten, an einer geeigneten Stelle auf das Maximum gebracht werden.

Damit die Proben, während dieser Zeit, möglichst nicht von diesem Prozess beeinflusst werden, eignet sich eine Stelle, welche möglichst weit von den Proben entfernt liegt. Der globale Nullpunkt ist nicht nur, der am weitesten von den Proben entfernte, sondern erweist sich auf Grund der bereits vorhandenen Befehle (Tabelle 2), als der geeignetste.

6.3.4. Parkposition nach Abarbeitung

Am Anfang und am Ende jeder automatisierten Abarbeitungsphase, soll eine geeignete End- bzw. Parkposition vom Laser eingenommen werden, um ein einfaches Einlegen und Entnehmen der Mikrotiterplatte, ohne dass der Laser ein Hindernis darstellt, zu ermöglichen.

Wenn sich der Laser am Global-Koordinatenursprung befindet, liegt die vordere linke Vorrichtung frei, so dass sich dieser Bereich optimal eignet. Um zu Beginn, einen unmittelbaren Kontakt mit den Lichtschranken während der Referenzfahrt und einer damit verbundenen mechanischen Belastung zu vermeiden, sollte die Parkposition einige Schritte von dem Koordinatenursprung entfernt liegen. In der Praxis hat sich eine Entfernung von 800 Schritten als ausreichend erwiesen.

6.3.5. Anforderung an den Ablauf

Nachdem der Nutzer die 96We//-U-Bodenplatte in die vorgesehene Vorrichtung im inneren der Laserbestrahlungs-Apparatur gesetzt, das Programm gestartet und im Vorhinein Parametervorgaben für die bestückten Wells vorgegeben hat, soll über eine weitere Eingabe, dem Programm vermittelt werden, dass die automatisierte Abarbeitung der Vorgaben erfolgen kann. Anschließend, soll die Referenzfahrt durchgeführt werden, um danach am Koordinatenursprung fünf Minuten mit voller Intensität vorzuheizen.

Im Anschluss soll der Laser chronologisch, mittig über die Wells, für welche Eingaben getroffen wurden, positioniert werden, um sie dann mit der eingestellten Laserintensität, für die vorgegebene Dauer, zu Bestrahlen.

Im Anschluss an diesen Abarbeitungszyklus, soll der Laser zunächst zum Koordinatenursprung gefahren werden, um dann die endgültige Endposition einzunehmen.

Nach Erreichen der Endposition, soll wieder die Möglichkeit bestehen, die U-Bodenplatte auszuwechseln, die Bestrahlungsparameter zu ändern und den Abarbeitungsprozess über seine Eingabe erneut zu starten oder das Programm zu beenden (Abbildung 8).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 8: Anforderungen an den Ablauf, schematisch dargesteUt

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¹ "Lab oratory Virtual Instrumentation Engineering Workbench", kurz LabVIEW, ist eine grafische Entwicklungsumgebung von NI, welche nicht nur als Entwicklungsumgebung, sondern auch als Programmiersprache fungiert [23, 24]. 9