Im vorliegenden Versuch wird die Klonierung des Hefe-Gens sba1 erzielt. Der Bericht protokolliert den Versuchsaufbau, Materielien, Methoden und die Ergebnisse.
Aus dem Inhalt:
I)Versuch: Klonierung eines Hefe-Gens;
Einleitung;
Materialien und Methoden;
Ergebnisse;
Diskussion;
II)Versuch: Ortsspezifische Mutagenese;
Einleitung;
Materialien und Methoden;
Ergebnisse;
Diskussion
Inhaltsverzeichnis
I) Versuch: Klonierung eines Hefe-Gens
Einleitung
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
II) Versuch: Ortsspezifische Mutagenese
Einleitung
Materialien und Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Zielsetzung & Themen
Dieses Praktikumsprotokoll dokumentiert die Durchführung und Auswertung molekularbiologischer Methoden im Rahmen eines Vertiefungskurses. Das primäre Ziel der Arbeit liegt in der praktischen Anwendung von Verfahren zur Genklonierung und Mutagenese sowie der anschließenden analytischen Überprüfung der Ergebnisse mittels Gelelektrophorese und Selektionsmethoden.
- Klonierung des Hefe-Gens sba1
- Durchführung einer ortsspezifischen Mutagenese nach Kunkel
- Agarosegelelektrophorese zur Kontrolle von DNA-Präparationen und PCR-Produkten
- Analyse von Transformationsraten und Blau-Weiß-Selektion
- Interpretation von Bandenmustern in Gelfotos unter Berücksichtigung molekulargenetischer Grundlagen
Auszug aus dem Buch
Diskussion
Kontrolle, Abb. 1: Spur A zeigt eine obere Bande (>10kBp) und ein langer Schmier; Spur B hat ein ähnliches Spurmuster (der Schmier ist kürzer und es sind 3 schwache Banden zw. 1,5kBp-5kBp zu erkennen); Spur C zeigt nur noch eine obere Bande (>10kBp) und ein schwacher Schmier im unteren Bereich. Ein Vergleich dieser Spuren in Hinsicht auf ihre einzelnen Behandlungen lässt folgendes interpretieren:
Im Spur A ist die oberste Bande die unverdaute, hochmolekulare genomische Hefe-DNA, die bei Verdau mit SalI teilweise verschwindet, also nicht die komplette Bande (Vgl. oberste Bande von A, B, und C). Dies lässt vermuten, dass sämtliche Bereiche der Hefe-gDNA vor Restriktionsverdau geschützt sind (Sekundärstrukturen, an gDNA gelagerte Histonproteine). Die mittlere, große Schmierregion ist eine Zusammensetzung aus vielen Banden von RNA-Nukleotiden verschiedenster Größen. Denn nach Behandlung mit RNase (C) verschwindet diese Schmierregion fast vollständig (bis auf eine schwache untere Schmierregion). In der unteren Schmierregion sind ebenfalls RNA-Moleküle von ca. 100Bp-Größe, die später nach Zugabe von RNase abgebaut wurden (s. Spur C). Diese kleinen RNA-Moleküle entsprechen die microRNAs (miRNAs), die bei der Genregulation von besonderer Bedeutung sind.
Zusammenfassung der Kapitel
I) Versuch: Klonierung eines Hefe-Gens: In diesem Kapitel wird die Klonierung des Gens sba1 beschrieben, wobei insbesondere die PCR-Amplifikation und die nachfolgende Transformation in Bakterien analysiert werden.
II) Versuch: Ortsspezifische Mutagenese: Dieser Abschnitt befasst sich mit der Anwendung der Kunkel-Methode zur gezielten Mutation des lacZ-Gens in Phagemid-Vektoren und deren Auswertung mittels Blau-Weiß-Selektion.
Schlüsselwörter
Molekularbiologie, Klonierung, sba1, Hefe, PCR, Agarosegelelektrophorese, Mutagenese, Kunkel-Methode, Phagemid, lacZ-Gen, Blau-Weiß-Selektion, Transformation, Restriktionsverdau, RNase, Genregulation
Häufig gestellte Fragen
Worum geht es in diesem Praktikumsprotokoll grundsätzlich?
Das Dokument protokolliert die praktische Umsetzung molekularbiologischer Experimente im Rahmen eines universitären Vertiefungskurses zur mikrobiellen Gentechnologie.
Welche zentralen Themenfelder werden bearbeitet?
Die Arbeit fokussiert sich auf die Klonierung eines spezifischen Hefe-Gens sowie die Durchführung einer ortsspezifischen Mutagenese an Phagemid-Vektoren.
Was ist das primäre Ziel der beschriebenen Versuche?
Das Ziel besteht in der erfolgreichen Klonierung von Genfragmenten sowie der gezielten Erzeugung von Mutationen, begleitet durch eine umfassende Erfolgskontrolle mittels biochemischer Analysen.
Welche wissenschaftliche Methode kommt primär zum Einsatz?
Es werden klassische molekularbiologische Methoden wie PCR, Restriktionsverdau, Gelelektrophorese sowie transformationsbasierte Selektionsverfahren (Blau-Weiß-Selektion) angewandt.
Was wird im Hauptteil der Arbeit behandelt?
Der Hauptteil gliedert sich in die Versuchsbeschreibungen inklusive Materialien, Methoden, Ergebnissen und einer detaillierten Diskussion der Resultate für die beiden Versuchsreihen.
Welche Schlüsselbegriffe charakterisieren die Arbeit?
Die Arbeit wird durch Begriffe wie Klonierung, Mutagenese, Transformation, Gelelektrophorese und Selektionsmarker definiert.
Warum wird in der Diskussion das Verschwinden von Schmierregionen durch RNase-Zugabe thematisiert?
Dies dient der Identifikation und Abgrenzung von RNA-Verunreinigungen in den DNA-Präparationen, um die Qualität der extrahierten Hefe-gDNA zu beurteilen.
Welche Rolle spielen Satelliten-Kolonien bei der Blau-Weiß-Selektion?
Satelliten-Kolonien sind E.coli-Bakterien, die kein resistenzvermittelndes Plasmid tragen, aber durch sekretierte Beta-Lactamase aus benachbarten Kolonien vor dem Antibiotikum im Nährmedium geschützt werden.
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- Student Arlie Zegarra Pumapillo (Author), 2008, Klonierung des Hefe-Gens sba 1. Praktikumsbericht mikrobielle Gentechnologie, Munich, GRIN Verlag, https://www.grin.com/document/114072
